Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rekombinowanie homologicznych konstruktów rekombinacji u Drosophila

18.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50346

⸱

13 lipca 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 3Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

W tym artykule

Podsumowanie

Techniki rekombinacji homologicznej znacznie rozwijają genetykę Drosophila, umożliwiając tworzenie molekularnie precyzyjnych mutacji. Niedawne zastosowanie rekombinacji pozwala na manipulowanie dużymi fragmentami DNA i przekształcanie ich w Drosophila6. Przedstawione tutaj metody łączą te techniki w celu szybkiego generowania dużych wektorów rekombinacji homologicznej.

Streszczenie

Ciągły rozwój technik szybkiego, wielkoskalowego manipulowania endogennymi loci genów poszerzy zastosowanie Drosophila melanogaster jako genetycznego organizmu modelowego do badań nad chorobami ludzkimi. W ostatnich latach nastąpił postęp techniczny, taki jak rekombinacja homologiczna i rekombinacja. Jednak generowanie jednoznacznych mutacji zerowych lub znakowanie białek endogennych pozostaje znacznym wysiłkiem dla większości genów. W tym miejscu opisujemy i demonstrujemy techniki stosowania metod klonowania opartych na rekombinacji do generowania wektorów, które można wykorzystać do celowania i manipulowania endogennymi loci in vivo. W szczególności opracowaliśmy kombinację trzech technologii: (1) transgenezy/rekombinacji BAC, (2) rekombinacji homologicznej typu ends-out oraz (3) technologii Gateway, aby zapewnić solidną, wydajną i elastyczną metodę manipulowania endogennymi loci genomowymi. W tym protokole podajemy szczegółowe informacje krok po kroku o tym, jak (1) projektować poszczególne wektory, (2) jak klonować duże fragmenty genomowego DNA do homologicznego wektora rekombinacji za pomocą naprawy luk oraz (3) jak zastąpić lub oznaczyć interesujące geny w tych wektorach za pomocą drugiej rundy rekombinacji. Na koniec przedstawimy również protokół, w jaki sposób zmobilizować te kasety in vivo w celu wygenerowania nokautu lub oznakowanego genu poprzez knock-in. Metody te można łatwo zastosować do wielu celów równolegle i zapewnić środki do manipulowania genomem Drosophila w odpowiednim czasie i w skuteczny sposób.

Wprowadzenie

Czyste, molekularnie zdefiniowane manipulacje pojedynczymi genami w ich endogennych loci oferują nieocenione narzędzie do badania niezliczonych pytań związanych z biologią eukariotyczną. Techniki odwróconej genetyki Drosophila do generowania alleli utraty funkcji okazały się trudne, dopóki Golic i współpracownicy nie wprowadzili celowania genowego in vivo za pomocą rekombinacji homologicznej do Drosophila 1-3. Wykazali, że określone loci genomowe mogą być celowane za pomocą liniowego fragmentu DNA ze zintegrowanego konstruktu transgenicznego. Ten liniowy "donorowy" DNA jest generowany in vivo poprzez rekombinację za pośrednictwem FRT (w celu wycięcia DNA z chromosomu jako cząsteczki kolistej), a następnie linearyzację za pomocą meganukleazy I-SceI. Chociaż metodologia ta została z powodzeniem wykorzystana do generowania różnych zdefiniowanych zmian chorobowych, technika ta nie była łatwo skalowalna do równoległej manipulacji wieloma genami, ponieważ każdy indywidualny konstrukt nokautujący wymaga odrębnego i niestandardowego projektu. Na przykład trudności w płynnym manipulowaniu dużymi fragmentami DNA (>5 kb) in vitro przy użyciu klasycznego klonowania enzymem restrykcyjnym/ligacją lub PCR, a także ograniczenia wielkości tradycyjnych wektorów transformacji in vivo często przeszkadzają w szybkim tworzeniu wektorów ukierunkowanych na rekonekcję homologiczną. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, połączyliśmy system rekombinerowania/transgenezy P[acman], który umożliwia subklonowanie i transgenezę do 100 kb DNA, z metodologią celowania genów typu ends-out, aby stworzyć wydajną i stosunkowo szybką platformę, która ułatwia celowanie w geny Drosophila.

Inżynieria genetyczna oparta na rekombinacji (rekombinacji) to potężna technologia klonowania oparta na rekombinacji homologicznej 4,5. W przeciwieństwie do konwencjonalnego klonowania enzymów restrykcyjnych/ligaz, rekombinacja nie jest ograniczona sekwencją lub rozmiarem zmanipulowanego DNA. Rekombinacja wykorzystuje specjalny szczep E. coli, który zawiera maszynerię rekombinacji zapewnioną przez wadliwy λ profag 4. Technika ta została niedawno przyjęta do stosowania u Drosophila 6,7. Rekombinacja u Drosophila opiera się na zmodyfikowanym, warunkowo amplifikowalnym wektorze sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC) o nazwie P[acman] 6,7. Wektor ten ma dwa źródła replikacji: OriV, który wytwarza wysoką liczbę kopii po indukcji chemicznej w celu oczyszczenia dużych ilości DNA wymaganych do sekwencjonowania i wstrzyknięcia zarodka oraz OriS, który utrzymuje niską liczbę kopii w warunkach podstawowych. Dodatkowo wektor P[acman] jest wyposażony w miejsce przyczepiania się bakterii (attB). Miejsce attB służy jako substrat dla transgenezy za pośrednictwem integrazy ΦC31, która umożliwia włączenie dużych fragmentów DNA do z góry określonego miejsca lądowania w genomie Drosophila 8,9.

Wygenerowano wektor P[acman] (określany jako P[acman]-KO 1.0), który może być używany jako wektor celowania dla rekombinacji homologicznej 10,11. Aby włączyć do systemu technologię celowania genowego typu ends-out, dodaliśmy dwa miejsca FRT i dwa I-SceI. Dołączyliśmy również kasetę Gateway do tego zmodyfikowanego wektora, aby usprawnić proces włączania ramion homologii do P[acman]-KO 1.0. Zapewnia to szybki i prosty sposób na wprowadzenie praktycznie każdego interesującego regionu genomu do wektora docelowego. W tym protokole opiszemy, jak zaprojektować wektor celowania za pomocą P[acman]-KO 1.0 i jak zmobilizować ten wektor in vivo do celowania w endogenne locus. Na potrzeby tego protokołu użyjemy kasety RFP/Kan do zastąpienia genu będącego przedmiotem zainteresowania, ale z tym protokołem można użyć różnych kaset, które zawierają marker selekcji antybiotyków. Zaprojektowaliśmy i z powodzeniem zastosowaliśmy zestaw kaset do wymiany genów i znakowania 10,11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wybór BAC i regionu do celu

  1. Aby uzyskać BAC z genem zainteresowania (GOI) (tutaj CG32095 jest używany jako przykład), wyszukaj CG32095 pod adresem www.flybase.org. W sekcji zapasy i odczynniki należy zapoznać się z sekcją zatytułowaną "Klony genomowe" pod kątem BAC zawierających CG32095. Upewnij się, że BAC obejmuje co najmniej 10 kb w górę i 5 kb za genem będącym przedmiotem zainteresowania. Alternatywnie, klony w wektorze P[acman]7 można również znaleźć pod adresem http://www.pacmanfly.org/libraries.html.
  2. Klony BAC występują w komórkach DH10B, a klony P[acman] w komórkach EPI300. Klony genomowe muszą zostać przekształcone w komórki SW102, które są podatne na rekombinację. Przeprowadza się "brudne minipreparaty" (minipreparat Qiagen bez użycia kolumny i wytrącania DNA za pomocą izopropanolu), rozpoczynając od 5 ml kultury O/N zaszczepionej komórkami zawierającymi BAC. Po ponownym zawieszeniu świeżo przygotowanego osadu DNA w 20 μl dH2O, rozcieńczyć 1 μl w 100 μl dH2O i użyć 1 μl do elektroportowania elektrokompaktora SW102. Aby uzyskać elektrokompetentność SW102, użyj następującego protokołu:
    1. Zaszczepić komórki SW102 w 4 ml LB. Hodować kulturę w temperaturze 32 °C O/N, wstrząsając przy 250 obr./min. ważny: Ogniwa SW102 NIGDY nie powinny być wystawiane na działanie temperatury wyższej niż 32 °C, chyba że pożądana jest indukcja maszyn rekombinacyjnych.
    2. Zaszczepić 1 ml nasyconej kultury SW102 w 44 ml LB i wyhodować na wytrząsarce o temperaturze 32 °C do OD600 między 0,2-0,3 (zwykle około 1-1,5 godziny). nuta: Inne protokoły rekombinacji zalecają hodowlę w mniejszej objętości do OD600 0,6-0,7, jednak hodowla bakterii do mniejszej gęstości w większej objętości znacznie zwiększa wydajność transformacji 12. Ponadto ta modyfikacja skraca czas oczekiwania.
    3. Schłodzić kulturę w zawiesinie lodowatej wody przez 5 minut. Ważne: Podczas poniższych kroków komórki MUSZĄ być przechowywane w niskich temperaturach. Ma to kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrej jakości ogniw elektrokompetentnych.
    4. Odwirować kulturę w temperaturze 4 °C przy 1 500 x g przez 10 min. Odrzucić supernatant i przepłukać osad w 25 ml zimnego (4 °C) 10% glicerolu 13. Najpierw ponownie zawiesić komórki w 5 ml, stukając i obracając probówkę w zawiesinie lodowatej wody (NIE PIPETOWAĆ W GÓRĘ I W DÓŁ), a następnie dodać pozostałe 10% glicerolu (20 ml).
    5. Wirować w temperaturze 4 °C przy 1 500 x g przez 10 minut, odrzucić supernatant i przemyć osad po raz drugi 25 ml lodowatego 10% glicerolu.
    6. Wirować w temperaturze 4 °C przy 1 500 x g przez 10 minut, odrzucić supernatant i przemyć osad po raz trzeci 25 ml lodowatego 10% glicerolu.
    7. Wirować w temperaturze 4 °C przy 1500 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant. W tym momencie osad komórkowy może być bardzo luźny i należy zachować ostrożność podczas wyrzucania supernatantu. Zawiesić osad w 1 ml zimnego 10% glicerolu. Przenieść komórki do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować przez 30 sekund przy 12 000 x g w mikrowirówce stołowej w temperaturze 4 °C. Odrzucić większość sklarowanego osadu, pozostawiając ≈90 μl glicerolu/komórek. Ogniwa są teraz gotowe do elektroporacji. nuta: W tym momencie ogniwa można przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania. Może to jednak obniżyć kompetencje.
    8. Elektroportuj DNA do komórek za pomocą kuwety 1 mm przy 1,800 V, 25 μF, 200 Ω. Po elektroporacji dodać 300 μl S.O.C. i pozostawić ogniwa do regeneracji przez 2 godziny w temperaturze 32 °C (wstrząsanie nie jest wymagane). Płytki na agarze LB plus 25 μg/ml chloramfenikolu (lub innych odpowiednich antybiotyków w zależności od przekształconego BAC lub PAC) i inkubować w temperaturze 32 °C przez 24-30 godzin.
  4. Ramiona homologiczne do celowania w geny są projektowane poprzez wybór 10 kb genomowego DNA przed i 5 kb w dół względem rządu Indii. Wybierz 500 pz na końcu ramion homologii 10 kb i 5 kb do amplifikacji (patrz sekcja 2) (rysunek 1). Te 500 pz fragmenty służą jako ramiona homologiczne używane do rekombinacji regionu genomu otaczającego GOI w P[acman] KO 1.0. Fragmenty te są określane jako lewe ramię (LA) dla regionu, który odpowiada ramieniu homologii 5' w górę i prawe ramię (RA) dla regionu, który odpowiada ramieniu homologii 3' w dół rzeki. Ważne: Ramiona homologii nie powinny zawierać miejsc restrykcyjnych BamHI, ponieważ linearyzacja plazmidu (w kroku 3.2) odbywa się za pomocą trawienia restrykcji BamHI.

2. Wstaw ramiona homologii do P[acman]-KO 1.0

  1. Ustaw dwie indywidualne reakcje PCR: jedną w celu amplifikacji LA i drugą w celu amplifikacji RA. W przypadku LA należy użyć starterów attB1-I-SceI-LA-F i BamHI-LA-R oraz użyć starterów BamHI-RA-F i attB2-I-SceI-RA-R w celu wzmocnienia RA (Tabela 1). Jako matrycę należy użyć 1 μl DNA BAC z kroku 1.2 lub 0,5 μl gotowanej przez noc kultury bakteryjnej zawierającej BAC będący przedmiotem zainteresowania. Upewnij się, że używasz polimerazy DNA z możliwością korekty. Dotyczy to wszystkich kolejnych testów PCR – z wyjątkiem kontroli PCR w krokach 2.8 i 3.13. nuta: Czas przedłużenia korekty polimerazy DNA może różnić się od zwykłej polimerazy DNA Taq w zależności od producenta. W tych krokach można użyć PfuUltra II Fusion HotStart, który polimeryzuje z szybkością 15 sekund/kb.
    LA/RA PCR 1 μl DNA z brudnego minipreparatu z kroku 1.2 Bac 0,25 μl Każdy Podkład 20 μM 2,5 μl 10X bufor PfuUltra II 0,75 μl 10 mM (każdy) dNTP 0,5 μl Polimeraza DNA PfuUltra II Fusion HotStart 19,75 μl Woda 25 μl Całkowita objętość Warunki PCR Krok 1 95 °C 2 min do aktywacji enzymu Krok 2 95 °C 20 s denaturacja Krok 3 60 °C 20 sek. wyżarzanie Krok 4 72 °C 20 s przedłużenia Krok 5 Przejdź do kroku 2 i powtórz 29 cykli Krok 6 4 °C Przytrzymaj
  2. Przeprowadź próbki na 1% żelu agarozowym i ekstrahuj produkty za pomocą zestawu do odzyskiwania DNA Zymoclean. Wymyj DNA z kolumny Zymoclean za pomocą 10 μl sterylnej wody.
  3. Wykonaj splicing przez nakładanie się przedłużenia (PCR SOE) z dwoma fragmentami, używając 10-30 ng całkowitego DNA z każdego amplifikowanego produktu oczyszczonego w 2.2 (Figura 2). Zwykle jest to około 1/20 każdego oczyszczonego produktu PCR:
    LA/RA PCR-Soe 0,5 μl każdy Oczyszczony produkt PCR LA i RA około 10-30 ng 0,25 μl każdy Podkład 20 μM 2,5 μl 10X bufor PfuUltra II 0,75 μl 10 mM (każdy) dNTP 0,5 μl Polimeraza DNA PfuUltra II Fusion HotStart 19,25 μl Woda 25 μl Całkowita objętość Warunki PCR Krok 1 95 °C 2 min do aktywacji enzymu Krok 2 95 °C 20 s denaturacja Krok 3 55 °C 20 sek. wyżarzanie (niższa temp., aby umożliwić wyżarzanie ramion) Krok 4 72 °C 20 s przedłużenia Krok 5 Przejdź do kroku 2 i powtórz 1 cykl Krok 6 95 °C 20 s denaturacja Krok 7 60 °C 20 sek. wyżarzanie Krok 8 72 °C 20 s przedłużenia Krok 9 Przejdź do kroku 2 i powtórz 27 cykli Krok 10 4 °C Przytrzymaj
  4. Uruchom próbkę PCR na żelu agarozowym i odzyskaj pasmo 1,0 kb przez ekstrakcję żelu. Jest to kaseta attB1-LA-BamHI-RA-attB2.
  5. Użyj zestawu enzymatycznego Gateway BP ClonaseII, aby skonfigurować reakcję BP zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Kaseta wygenerowana w 2.4 będzie działać jako DNA dawcy, a P[acman]-KO 1.0 jako wektor docelowy.
  6. Rozcieńczyć 50 μl ogniw elektrokompetentnych TransforMax EPI300 dodając 30 μl zimnego 10% glicerolu lub zimnego dH2O. Przekształć 1 μl reakcji BP w ogniwa elektrokompetentne zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Dodanie wody rozcieńcza dość wysokie stężenie soli w reakcji BP, aby zapobiec wyładowaniom elektrycznym (wyładowaniom łukowym) podczas elektroporacji. Elektroportuj DNA do komórek za pomocą kuwety 1 mm przy 1,800 V, 25 μF, 200 Ω.
  7. Dodać 300 μl S.O.C. i pozostawić komórki do regeneracji przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (wstrząsanie nie jest wymagane). Płytki na agarze LB + 50 μg/ml Amp (P[acman]-KO 1.0 zawiera gen oporności na Amp). Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 18-24 godziny.
  8. PCR sprawdza poszczególne kolonie za pomocą konwencjonalnego PCR kolonii przy użyciu T3 (sekwencja T3 znajduje się za kasetą Gateway w starterach P[acman]-KO 1.0 (Rysunek 1) i attB1-I-SceI-LA-F. Dodatnie klony pokażą pasmo, które działa z prędkością 1,2 kb.
  9. Wyhodować przez noc kulturę dodatniego klonu w LB z 50 μg/ml ampicyliny.
  10. Amplifikować wektor P[acman]-KO 1.0 zawierający LA i RA w 10 ml LB z hodowlą ampicyliny 50 μg/ml przy użyciu roztworu do kontroli kopiowania zgodnie z protokołem producenta (epicentrum).
  11. Wykonaj miniprep Qiagen zgodnie z protokołem producenta.

3. Rekombinacja interesującego regionu genomowego do P[acman]-KO 1.0

Dzień 1

  1. Zaszczepić komórki SW102 zawierające BAC w 4 ml LB plus 25 μg/ml chloramfenikolu (Chl) lub odpowiednim antybiotykiem doborowym. Kultura upraw w temperaturze 32 °C, O/N, wytrząsanie przy 250 obr./min. ważny: Poza tym podczas indukcji w kroku 3.5 ogniwa SW102 nie powinny być wystawiane na działanie temperatury wyższej niż 32 °C, ponieważ wysoka temperatura aktywuje maszynerię rekombinacji tych komórek.

Dzień 2

  1. Strawić 0,4 μg P[acman]-KO-1.0 zawierającego ramiona LA i RA wytworzone w sekcji 2 z ≈20 jednostkami BamHI w reakcji 25 μl. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 3 godziny. Ważne: Długie trawienie ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia trawienia całego DNA. Zmniejszy to liczbę późniejszych klonów wyników fałszywie dodatnich.
  2. Zaszczepić 1,0 ml nasyconej kultury SW102/BAC w 44 ml LB-Chl (25 μg/ml) i hodować na wytrząsarce o temperaturze 32 °C do OD600 w zakresie 0,2-0,3 (zwykle około 1-1,5 godziny). Dołączyć dodatkową identyczną próbkę do kontroli innej niż HS. Próbka ta będzie traktowana tak samo jak próbka doświadczalna w każdym pojedynczym aspekcie, z wyjątkiem HS. Ta kultura bez szoku cieplnego służy jako kontrola negatywna. Pojawienie się wielu kolonii na płytce kontrolnej innej niż HS (krok 3.13) zwykle wskazuje na transformację z niestrawionym plazmidem P[acman] KO 1.0 LA/RA.
  3. Podczas gdy kultura rośnie, uruchom P[acman]-KO z ograniczeniami BamHI na żelu. Następnie wyekstrahuj żelem i eluuj DNA w 10 μl wody podgrzanej do 55 °C. UWAGA: Nie eluuj DNA w żadnym buforze. Sole obecne w buforze mogą powodować wyładowania elektryczne podczas elektroporacji.
  4. Szok termiczny kultury w temperaturze 42 °C dokładnie przez 15 minut w łaźni wodnej. Spowoduje to aktywację maszynerii rekombinacyjnej komórek SW102. Nie należy szokować cieplnie kultury kontrolnej.
  5. Natychmiast po szoku cieplnym przenieś kultury kontrolne poddane szokowi cieplnemu i bez HS do schłodzonych probówek kanonicznych o pojemności 50 ml i pozwól kulturom schłodzić się w zawiesinie lodowatej wody przez 5 minut. Ważne: Podczas poniższych kroków komórki MUSZĄ być przechowywane w niskich temperaturach. Ma to kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrej jakości ogniw elektrokompetentnych.
  6. Odwirować kulturę przy 1 500 x g przez 10 min. Odrzucić supernatant i przepłukać osad w 25 ml zimnego (4 °C) 10% glicerolu 13. Najpierw ponownie zawiesić komórki w 5 ml, stukając i obracając probówkę w zawiesinie lodowatej wody (NIE PIPETOWAĆ W GÓRĘ I W DÓŁ), a następnie dodać pozostałe 10% glicerolu (20 ml).
  7. Wirować w temperaturze 4 °C przy 1 500 x g przez 10 minut, odrzucić supernatant i przemyć osad 25 ml lodowatego 10% glicerolu po raz drugi.
  8. Wirować w temperaturze 4 °C przy 1 500 x g przez 10 minut, odrzucić supernatant i przemyć osad 25 ml lodowatego 10% glicerolu po raz trzeci.
  9. Wirować w temperaturze 4 °C przy 1 500 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant. W tym momencie osad komórkowy może być bardzo luźny i należy zachować ostrożność podczas wyrzucania supernatantu. Zawiesić osad w 1 ml zimnego 10% glicerolu. Przenieść komórki do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować przez 30 sekund przy 12 000 x g w mikrowirówce stołowej w temperaturze 4 °C. Odrzucić większość sklarowanego osadu, pozostawiając ≈90 μl wody/komórek. nuta: W tym momencie ogniwa można przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania. Może to jednak obniżyć kompetencje.
  10. Dodać 2 μl P[acmana] trawionego przez BamHI (dążyć do 50 ng) do komórek i delikatnie wymieszać za pomocą końcówki pipety. Przenieś ogniwa do kuwety elektroporacyjnej o średnicy 1 mm i naelektryzuj pod napięciem 1 800 V, 25 μF, 200 Ω.
  11. Dodać 300 μl S.O.C. i pozostawić komórki do odzysku przez 2 godziny w temperaturze 32 °C (wstrząsanie nie jest wymagane). Płytki na agarze LB plus 50 μg/ml ampicyliny i inkubować w temperaturze 32 °C przez 24-30 godzin.

Dzień 3

  1. Badanie przesiewowe pod kątem prawidłowej naprawy luk za pomocą PCR kolonii. Użyj starterów kontrolnych T3 i RA dla RA oraz T7 i LA kontrolnych starterów dla LA (Tabela 1). Zaprojektuj startery PCR-Check-RA i PCR-Check-LA 100-200 pz w kierunku regionu docelowego (Tabela 1). Dodatnie kolonie z reakcji PCR przy użyciu PCR-Check-RA z T3 lub PCR-Check-LA z T7 pokażą pasmo biegnące przy 800-1,000 pz (ryc. 3). nuta: Bardzo ważne jest, aby przetestować oba ramiona, ponieważ czasami obserwuje się włączenie jednego ramienia, ale nie drugiego.
  2. Hoduj kolonie zweryfikowane metodą PCR w temperaturze 32 °C w 4 ml LB+50 μg/ml ampicyliny na noc. Zrób zamrożony zapas tych komórek do późniejszego wykorzystania.

4. Zamiana regionu genomowego na kasetę celowniczą

Dzień 4

  1. Amplifikować kasetę z nokautem RFP/KAN metodą PCR przy użyciu pENTR-RFP/KAN (wstępnie strawionego za pomocą AscI i NheI w celu linearyzacji) jako matrycy oraz starterów 5'HA-RFP/Kan-F i 3'HA-RFP/Kan-R (Tabela 1). Kasetę RFP/KAN można zamówić pod numerem referencyjnym 11.
  2. Żel oczyszcza produkt PCR, eluując w 20 μl sterylnej wody. Kaseta RFP-KAN wraz z ramionami homologicznymi powinna mieć około 3 kb.
  3. Zaszczepić 1 ml nasyconej kultury SW102/P[acman]-KO (krok 3.13) do 44 ml LB-Amp (50 μg/ml) i hodować na wytrząsarce o temperaturze 32 °C do OD600 między 0,2-0,3. Dołączyć dodatkową identyczną próbkę do kontroli innej niż HS. Próbka ta będzie traktowana tak samo jak próbka doświadczalna w każdym pojedynczym aspekcie, z wyjątkiem HS.
  4. Gdy kultura SW102/P[acman]-KO osiągnie pożądaną gęstość, wykonaj kroki od 3,5 do 3,10.
  5. Elektroportować około 100 ng kasety celowniczej do 90 μl elektrokompetentnych ogniw SW102/P[acman]-KO. Przenieś ogniwa do kuwety elektroporacyjnej o średnicy 1 mm i naelektryzuj pod napięciem 1 800 V, 25 μF, 200 Ω. Dodać 300 μl S.O.C. i pozostawić komórki do odzyskania sprawności przez 2 godziny w temperaturze 32 °C (wstrząsanie nie jest wymagane). nuta: Zdecydowanie zaleca się stosowanie świeżej kasety oczyszczonej żelem.
  6. Płytki w agarze LB + Amp (50 μg/ml) + Kan (50 μg/ml) i inkubować przez 24-30 godzin w temperaturze 32 °C.

Dzień 5

  1. Wyhoduj 5 ml kultury z 5 różnych kolonii w temperaturze 32 °C O/N.

Dzień 6

  1. Wykonaj "brudny miniprep" i uruchom połowę uzyskanego DNA na 1% żelu agarozowym, aby poszukać obecności plazmidu o niskiej masie cząsteczkowej. Nie powinno być żadnego plazmidu, który działa poniżej 12 kb. (Rysunek 4)
  2. Rozcieńczyć DNA w stosunku 1:500 z dodatniego klonu i użyć 1 μl do elektroporacji do 50 μl TransforMax EPI300. Ważne: Upewnij się, że rozcieńczyłeś DNA, aby zapobiec elektroporacji wielu plazmidów w jednej komórce. Płytki w agarze LB + Amp (50 μg/ml) + Kan (50 μg/ml) i inkubować przez 18-24 godziny w temperaturze 37 °C

Dzień 7

  1. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 10 ml LB + i wyhodować O/N.

Dzień 8

  1. Wysiewać 100 ml pożywki LB z nasyconą kulturą z kroku 4.10. Dodać odpowiednie antybiotyki plus 100 μl roztworu kontrolnego 1000X copy i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-6 godzin.
  2. Wykonaj maxiprep i sprawdź, czy kaseta została włożona we właściwe miejsce poprzez sekwencjonowanie.
  3. Oprócz sekwencjonowania należy wykonać test trawienia enzymem restrykcyjnym z DNA z klonu, który nie zawierał żadnego plazmidu o niskiej masie cząsteczkowej i jego rodzicielskiego DNA. Wybrane enzymy restrykcyjne będą różne dla każdego genu, ale celem jest znalezienie grupy enzymów, które pozwolą badaczowi scharakteryzować wektor rekombinowany. Na przykład wektor kierowania CG32095 był seryjnie trawiony za pomocą PacI, AscI, BamHI i AatII. Pojawienie się wszystkich przewidywanych prążków i brak jakichkolwiek nieprawidłowych prążków potwierdza, że wektor docelowy został poprawnie zrekombinowany (rysunek 5).

5. Wstrzykiwanie much i mobilizacja kasety In vivo

  1. Wstrzyknąć kasetę za pomocą integrazy ΦC31 do wstępnie zdefiniowanego miejsca lądowania. Zewnętrzni dostawcy, tacy jak Rainbow Transgenics (http://www.rainbowgene.com), mogą być wykorzystywani do usług iniekcyjnych. ważny: DNA musi być świeżo przygotowane przed wstrzyknięciem. Wyższą wydajność przemiany obserwuje się, gdy DNA jest przygotowywane na miejscu i wstrzykiwane tego samego dnia.
  2. Aby zmobilizować kasetę z miejsca lądowania, użyj numeru katalogowego Bloomington 25680 lub 25679. Stada te zawierają flippazę i I-SceI za promotorem szoku cieplnego, odpowiednio na chromosomie drugim i trzecim. Ponadto zawierają transgen hs-hid na chromosomie równoważącym i na chromosomie Y. Zbierz samce z wybranego stada i skrzyżuj się z dziewiczymi samicami niosącymi kasetę KO w miejscu lądowania. Ustaw ~30 krzyżówek i pozwól samicom składać jaja przez 2-3 dni. nuta: Zaleca się wybór stada, które znajduje się na innym chromosomie niż locus docelowe.
  3. Przełóż rodziców do nowego zestawu 30 fiolek i larwy szoku cieplnego w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, dwa razy dziennie, przez trzy kolejne dni. Szoki cieplne aktywują produkcję enzymów; flippaza i I-SceI oraz gen śmierci komórki ukryły się, zabijając samce i muchy przenoszące chromosomy równoważące. Pozwól rodzicom w nowo odwróconych fiolkach złożyć jaja przez 2-3 dni, a następnie powtórz szok cieplny dla tych fiolek, po ponownym przewróceniu rodziców do nowych fiolek. Powtórz to przez kilka przewróceń, aż rodzice przestaną składać jaja.
  4. Zbierz dziewicze samice z potomstwa F1 much z szokiem cieplnym i skrzyżuj z samcami y-w. Celuj w 150-200 krzyży; Trzy dziewice i trzech mężczyzn na krzyż.
  5. Przebadaj potomstwo F2 pod fluorescencyjnym lunetą, która umożliwia wykrycie RFP w oku. Badanie przesiewowe pod kątem oczu z dodatnim zapytaniem ofertowym, które są zmutowane dla genów białego i żółtego (y-w-). Ten proces przesiewowy pozytywnie selekcjonuje obecność kasety RFP i selekcjonuje brak wektora P[acman] (mini-biały) i miejsca lądowania, które jest oznaczone żółtym genem typu dzikiego. nuta: Mniej czasochłonne jest badanie przesiewowe pod kątem zapytania ofertowego w oku niż pierwsze badanie przesiewowe pod kątem much yw. Zdarzenia mobilizacyjne są bardzo skuteczne podczas szoków cieplnych, co skutkuje znacznie mniejszą liczbą much zawierających RFP w oku w porównaniu z muchami y-w-.
  6. Ustaw krycia pojedynczej pary dla każdej muchy y-w-RFP+, ponieważ każde zdarzenie mobilizacyjne może być inne. Zmapuj zapytanie ofertowe do właściwego chromosomu. Prawidłowe celowanie chromosomowe obserwuje się zwykle w >95% przypadków.
  7. Ustal zapasy i sprawdź, czy zdarzenia kierowania są prawidłowe, korzystając ze standardowych technik analizy Southern Blot. Zaprojektuj sondę o długości 2 kb przed (lewe ramię) i za (prawe ramię) docelowego genu oraz 2 kb (lub krótszą, jeśli to konieczne) obejmującą usunięty ORF. Pierwsze dwie sondy dadzą prążek w nokautach homozygotycznych i heterozygotycznych, który nie występuje w typie dzikim, podczas gdy ORF nie da prążka w nokautach homozygotycznych. Możliwy jest również szybki PCR dla ORF, jednak zależy to od braku opaski.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Amplifikacja ram homologicznych LA i RA powinna dać produkty o długości 500 bp, a reakcja PCR-SOE powinna przynieść produkt o długości 1,0 kb (sekcje 2.1-2.4; Rysunek 2). Reakcja BP przeprowadzona w sekcji 2.5 jest zazwyczaj bardzo wydajna, a transformacja bakteryjna produktu daje średnio od 5 do 100 kolonii. Prawie wszystkie kolonie sprawdzone za pomocą PCR wykazują oczekiwany produkt PCR.

Podczas pierwszej rundy rekombineeringu (Sekcja 3) należy spodziewać się uzyskania 20-4...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Siła modelowych organizmów genetycznych w badaniach biomedycznych opiera się w dużej mierze na dostępnych narzędziach manipulacji genetycznej. W szczególności małe modele C. elegans i Drosophila pozwalają na niedrogie i szybkie molekularne analizy genetyczne kompletnych szlaków i rodzin genów zaangażowanych w rozwój lub funkcję wielokomórkową. W ostatnich latach nastąpił znaczny postęp w rozwoju narzędzi do manipulowania genami u Drosophila 14,15. Na przykład rekombinacja, która jest...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów w odniesieniu do przedstawionych tu technik.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Hugo Bellenowi i Bloomington Stock Center za odczynniki. Ponadto dziękujemy Koenowi Venkenowi, Hugo Bellenowi i wszystkim członkom laboratoriów Buszczak i Hiesinger za pomocne dyskusje. Prace te były wspierane przez granty z National Institute of Health dla ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) i MB (RO1GM086647), grant z Cancer Prevention Research Institute of Texas dla MB i PRH (RP100516) oraz Welch Foundation (I-1657) dla PRH. MB jest stypendystą E.E. i Greer Garson Fogelson w dziedzinie badań biomedycznych, a PRH jest stypendystą Eugene'a McDermotta w dziedzinie badań biomedycznych w UT Southwestern Medical Center.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SW102 Rekombinacja kompetentne bakterieNCI-Frederick(SW102, SW105 i SW106)http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx
Elektrokompetent TransforMax EPI300 E. coliEpicentreEC300110Zawiera CopyControl roztwór indukcyjny
PfuUltra II Fusion HS Polimeraza DNA AligentTechnology Inc.600670
BamHI-HFNew England BiolabsR3136S
Zymoclean Gel Zestaw do odzyskiwania DNAZymo ResearchD4001
Użyj zestawu enzymatycznego Gateway BP ClonaseIIInvitrogen11789-020
P[acman]KO1.010Buszczak and Hiesinger LabsNa żądanie
pENTR RFP-Kan11Buszczak i HiesingerLabs Upon request
FlystocksBloomington stock centerNumery magazynowe: 25680, 25679y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4
y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1
Maszyna do elektroporacjiBiorad GenePulser Xcell z modułem PC165-2662
Kuwetymarki Fisher#FB101
Bakterie rekombinacyjne

Bibliografia

  1. Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Genetics. 157, 1307-1312 (2001).
  2. Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
  3. Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
  4. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).
  5. Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
  6. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
  7. Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
  8. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
  9. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
  10. Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
  11. Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
  12. Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
  13. Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
  14. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
  15. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Drosophila melanogastertransgeneza BACtechnologia Gatewaynaprawa luk (gap repair)knockout genuknockin genukonstrukcja plazmiduelektroporacja
Rekombinowanie homologicznych konstruktów rekombinacji u Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.