Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Składanie macierzy nukleosomalnych z rekombinowanych histonów rdzenia i pozycjonowania nukleosomów DNA

22.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50354

⸱

10 września 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biochemistry and Molecular Biology, Colorado State University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono metodę rekonstytucji modelowych macierzy nukleosomalnych z rekombinowanych histonów rdzeniowych i tandemowo powtarzanego DNA do pozycjonowania nukleosomów. Opisujemy również, w jaki sposób eksperymenty z prędkością sedymentacji w ultrawirówce analitycznej i mikroskopia sił atomowych (AFM) są wykorzystywane do monitorowania stopnia nasycenia macierzy nukleosomalnej po rekonstytucji.

Streszczenie

Oktamery histonów rdzeniowych, które są wielokrotnie rozmieszczone wzdłuż cząsteczki DNA, nazywane są macierzami nukleosomalnymi. Macierze nukleosomalne uzyskuje się na jeden z dwóch sposobów: oczyszczanie ze źródeł in vivo lub rekonstytucję in vitro z rekombinowanych histonów rdzeniowych i tandemowo powtarzanego pozycjonowania nukleosomów DNA. Ta ostatnia metoda ma tę zaletę, że pozwala na złożenie bardziej jednolitej składowo i precyzyjnie ustawionej macierzy nukleosomalnej. Eksperymenty z prędkością sedymentacji w ultrawirówce analitycznej dostarczają informacji o wielkości i kształcie makrocząsteczek poprzez analizę szybkości, z jaką migrują one przez roztwór pod wpływem siły odśrodkowej. Technika ta, wraz z mikroskopią sił atomowych, może być wykorzystana do kontroli jakości, zapewniając, że większość matryc DNA jest nasycona nukleosomami po rekonstytucji. W tym miejscu opisujemy protokoły niezbędne do odtworzenia miligramowych ilości długości i składu zdefiniowanych macierzy nukleosomalnych odpowiednich do biochemicznych i biofizycznych badań struktury i funkcji chromatyny.

Wprowadzenie

Genomy eukariotyczne nie istnieją jako nagie DNA, ale są raczej zagęszczone i zorganizowane przez związane białka. Te kompleksy DNA i białka są znane jako chromatyna. Podstawową powtarzającą się jednostką chromatyny jest nukleosom. Nukleosom składa się z oktamera histonowego i 146 par zasad DNA owiniętych wokół oktamera histonowego około 1,6 razy1. Oktamer histonowy składa się z dwóch kopii histonów rdzeniowych H2A, H2B, H3 i H4. Oktamery histonów rdzeniowych, które są powtarzalnie rozmieszczone wzdłuż cząsteczki DNA, nazywane są układami nukleosomalnymi. Rozszerzona struktura macierzy nukleosomalnych została określona jako włókno 10 nm lub struktura "koralików na sznurku" i występuje in vitro w warunkach niskiej zawartości soli2. Włókno o długości fali 10 nm jest zdolne do kondensacji w struktury wyższego rzędu poprzez zagęszczanie wewnątrz macierzy i/lub oligomeryzację między tablicami2. Te struktury wyższego rzędu mogą być indukowane w obecności soli lub mogą być kształtowane poprzez wiązanie białek architektonicznych chromatyny z macierzą nukleosomalną3,4. Poziomy zagęszczenia chromatyny są odwrotnie skorelowane z szybkością transkrypcji in vivo5,6. Ostatnie badania podkreślają znaczenie strukturalnej organizacji genomów w procesach takich jak różnicowanie, rozwój nowotworów i inne7,8. Zastosowanie macierzy nukleosomalnych do badania struktury i funkcji chromatyny stało się powszechne. Tutaj opisujemy metodę składania macierzy nukleosomalnych z rekombinowanych histonów rdzeniowych i pozycjonowania nukleosomów DNA.

Użycie rekombinowanego DNA z tandemowymi powtórzeniami sekwencji pozycjonowania nukleosomów pozwala na odtworzenie tablic zawierających regularnie rozmieszczone nukleosomy. Dwie z bardziej popularnych sekwencji pozycjonowania to sekwencja genu 5S rRNA i sekwencja "601"9,10. Sekwencja 601 została uzyskana z eksperymentów SELEX i silniej pozycjonuje nukleosomy niż sekwencja5S 11. W związku z tym długość DNA łącznika macierzy 601 jest bardziej jednorodna. Tandemowo powtarzane pozycjonowanie nukleosomów DNA uzyskuje się przez filtracjężelową 4,12. Rekombinowane histony są oczyszczane z E. coli w warunkach denaturacji13. Zastosowanie rekombinowanych histonów pozwala na dokładną kontrolę składu histonów macierzy nukleosomalnych. Na przykład histony rdzeniowe niosące specyficzne mutacje14 lub modyfikacje potranslacyjne15,16 można zastąpić histonami rdzenia typu dzikiego.

Eksperymenty prędkości sedymentacji monitorują szybkość sedymentacji makrocząsteczek w roztworze pod wpływem przyłożonej siły odśrodkowej17. W ten sposób można uzyskać informacje o wielkości i kształcie makrocząsteczek w próbce. Eksperymenty z prędkością sedymentacji są zatem odpowiednim narzędziem do badania zmian stanu roztworu w strukturze włókien chromatyny spowodowanych kondensacją chromatyny18. Co ważne, w pierwszej kolejności należy zastosować eksperymenty z prędkością sedymentacji jako etap kontroli jakości w rekonstytucji macierzy nukleosomalnej. Jeśli DNA i nukleosomy nie są połączone w odpowiednim stosunku molowym, macierze mogą być niedosycone lub nadmiernie nasycone histonami rdzeniowymi. W ten sposób informacje uzyskane z eksperymentów z prędkością sedymentacji są wykorzystywane do zapewnienia, że DNA jest prawidłowo nasycone nukleosomami. Ważne jest, aby stosować alternatywne metody do szacowania nasycenia DNA nukleosomami, zwłaszcza w przypadku pracy z wcześniej niescharakteryzowaną matrycą DNA. W związku z tym opisano również metodę analizy macierzy nukleosomalnych z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych (AFM). AFM to potężna technika, która pozwala na wizualizację wpływu wielu parametrów, takich jak poziom nasycenia, wpływ obecności wariantów histonów lub wpływ MgCl2 19,20. AFM został również zastosowany do badania dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania poklatkowego 21. Złożone w warunkach in vitro 12-merowe macierze nukleosomalne są szczególnie podatne na badania AFM, ponieważ mieszczą się w odpowiednim zakresie rozmiarów do obrazowania AFM 22. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy AFM macierzy nukleosomalnych jako kontrolę jakości, a także sposób na potwierdzenie danych z AUC ("zobaczyć znaczy uwierzyć"). Oprócz prostej wizualizacji, AFM umożliwia pomiar profili wysokości próbek jako dodatkową metrykę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Składanie rekombinowanych histonów rdzeniowych w oktamery

Uzasadnienie: Pierwszym krokiem w rekonstytucji macierzy nukleosomalnej jest przygotowanie natywnych oktamerów histonów rdzeniowych z liofilizowanych rekombinowanych histonów rdzeniowych. Białka histonowe są łączone w równych ilościach molowych i składane w oktamery histonowe poprzez dializację próbek z buforu denaturującego do buforu fałdowego.

  1. Oczyść i liofilizuj rekombinowane histony rdzeniowe (H2A, H2B, H3, H4) zgodnie z opisem13.
  2. Rozpuścić około 5 mg każdego liofilizowanego histonu rdzeniowego w 3 ml buforu rozwijającego się (6 M HCl guanidyny, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM DTT). Pozostawić każdą podwielokrotność do rozpuszczenia przez co najmniej jedną godzinę. Upewnij się, że po bokach pojemnika nie pozostało żadne białko.
  3. Zmierzyć absorbancję każdego histonu przy długości fali 276 nm, używając buforu rozwijającego się jako punktu odniesienia.
  4. Oblicz molowość każdego histonu, korzystając z ich współczynników ekstynkcji (patrz tabela 1 dla współczynników ekstynkcji histonów Xenopus). Porównaj stężenie histonu oznaczone jako absorbancja z liofilizowaną suchą masą i oszacuj, czy większość białka jest rozpuszczona.
  5. Określ, który histon ma najmniej moli, ponieważ będzie to ograniczona liczba moli dla wszystkich histonów.
  6. Połączyć histony w równych ilościach molowych i rozcieńczyć buforem rozwijającym się do końcowego stężenia 1 mg/ml.
  7. Umieścić próbkę w rurkach dializacyjnych MWCO o natężeniu 6-8 kDa. Uszczelnij rurkę i umieść w 2 litrach buforu do ponownego składania na zimno (2 M NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 5 mM β-merkaptoetanolu).
  8. Dializować próbkę przez 18 godzin w temperaturze 4 °C z mieszaniem. Upewnij się, że rurka do dializy może się swobodnie i energicznie obracać, w przeciwnym razie histony mogą się wytrącić.
  9. Wymienić bufor dializacyjny dwa razy w ciągu 18 godzin (tj. należy zmieniać bufor do ponownego składania co około 6 godzin, aż do zakończenia). Nawet jeśli utworzy się osad, nie należy wyrzucać próbki, część oktamera może zostać odzyskana, chociaż wydajność zostanie zmniejszona.

Uwaga: Zobacz kroki 2.1-2.2, aby przygotować równowagę kolumn na następny dzień.

2. Oczyszczanie oktamerów histonów za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar

Uzasadnienie: Po zakończeniu sekcji 1, próbki będą zawierały oktamery histonów, jak również inne kompleksy histonowe, takie jak agregaty, tetramery H3/H4 i dimery H2A/H2B. Oktamery histonów zostaną oczyszczone z tych innych kompleksów za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC).

  1. Podłącz kolumnę HiLoad 16/60 Superdex200 16/60 (S200) do systemu FPLC. Upewnij się, że pęcherzyki powietrza nie dostały się do systemu.
  2. Wyczyść kolumnę S200 przefiltrowaną wodą o wielkości 0,2 μm. Użyj natężenia przepływu 0,3 ml/min i ustaw limit ciśnienia wstecznego na 0,5 MPa. Upewnij się, że masz wystarczającą ilość wody i pozostaw kolumnę do wyczyszczenia przez noc.
  3. Zrównoważyć kolumnę S200 i pętlę próbki FPLC za pomocą bufora do ponownego składania. Użyj 1 l filtrowanego buforu do ponownego składania 0,2 μm. Przepływać bufor do ponownego składania przez kolumnę z prędkością 1 ml/min i maksymalnym ciśnieniem 0,5 MPa przez około 2 godziny.
  4. Zrównoważyć koncentrator odśrodkowy Vivaspin (50 kDa MWCO) z 1 ml buforu do ponownego składania. Wyjąć próbkę z rurki dializacyjnej i odwirować próbkę w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich osadów. Odpipetować supernatant próbki do koncentratora. Zagęścić próbkę do objętości około 500 μl.
  5. Wyjąć zagęszczoną próbkę oktamera do nowego pojemnika i przepłukać koncentrator 1 ml buforu do ponownego składania. Zagęścić płukanie do 500 μl i dodać je do próbki oktameru. Pomaga to uratować wszelkie oktamery pozostające w koncentratorze.
  6. Wirować próbkę w probówce do mikronasycania o pojemności 1,5 ml przez 5 minut z prędkością 10 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i przenieść do nowej probówki. Pomaga to usunąć wszelkie osady przed załadowaniem próbki do FPLC.
  7. Załaduj próbkę do kolumny S200. Załadować maksymalnie 1,5 ml całkowitej objętości lub 15 mg oktamera w jednym oczyszczeniu.
  8. Eluować próbkę za pomocą świeżo przygotowanego buforu do ponownego składania. Stosować natężenie przepływu 1 ml/min i ograniczenie ciśnienia wstecznego 0,5 MPa. Użyć buforu do składania o objętości dwóch kolumn (400 ml) i zebrać frakcje o objętości 2 ml. Monitorować absorbancję przy 280 nm podczas elucji. Różne gatunki będą wymywać się w kolejności zmniejszania się. Agregaty histonowe zwykle eluują się w około 45 ml, oktamer w około 65 ml, a dimer w około 84 ml (ryc. 1).
  9. Analizuj frakcje elucyjne z pików zainteresowania, uruchamiając próbki na 18-20% SDS-PAGE. Frakcje zawierające oczyszczone oktamery powinny mieć równe ilości molowe czterech podstawowych białek histonowych (ryc. 1).
  10. Zebrać frakcje zawierające oczyszczone oktamery i stężyć do ≤15 mg/ml za pomocą filtra odśrodkowego Vigaspin. Rozcieńczone oktamery mogą rozłączyć się na dimery H2A/H2B i tetramery H3/H4.
  11. Oznaczyć stężenie oktamera, mierząc absorbancję przy długości fali 280 nm i obliczyć przy użyciu współczynnika ekstynkcji z tabeli 1.
  12. Oktamery histonów mogą być przechowywane przez krótki czas w buforze do ponownego składania w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania oktamery będą bardziej stabilne w temperaturze -20 °C i w 50% roztworze glicerolu. Oktamery przechowywane w glicerolu powinny być dializowane do świeżego buforu do ponownego fałdowania przed pomiarami absorbancji i użyciem w rekonstytucji macierzy nukleosomalnej.

3. Rekonstrukcja macierzy nukleosomalnych z DNA i oczyszczonych oktamerów

Uzasadnienie: Rekonstrukcja macierzy nukleosomalnych wymaga, aby oktamery histonów i matrycowe DNA były połączone w określonych proporcjach molowych. Mieszaniny DNA i oktamerów histonowych w 2 M NaCl są dializowane skokowo do o zmniejszającej się sile jonowej. Stopniowa zmiana na niższą zawartość soli zapewnia prawidłowe tworzenie nukleosomów. Uzyskanie macierzy nukleosomalnych o pożądanym poziomie nasycenia oktamerem histonów matrycy DNA wymaga rekonstytucji testowej na małą skalę, a następnie rekonstytucji preparatywnej na dużą skalę. Odpowiednie warunki określone przez rekonstytucję na małą skalę są stosowane w celu kierowania preparatywną rekonstytucją.

  1. Oczyść tandemowo powtórzone DNA ustawiające nukleosom zgodnie z opisem 4,12. Krótko mówiąc, wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu Qiagen GigaPrep lub podobnego produktu. Ustaw trawienie enzymu restrykcyjnego w celu uwolnienia matrycowego DNA i strawienia plazmidowego DNA do mniejszych rozmiarów (≤700 pz). Matrycowy DNA można następnie oczyścić z małych pozostałości plazmidowego DNA za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC). Kolumna zasilana grawitacyjnie, o wysokości około 115 cm wypełniona koralikami Sephacryl S-1000 jest wystarczająca do oczyszczenia 601 DNA o wymiarach207 pz x 12 merów.

Uwagi: Do oczyszczania plazmidowego DNA przy niższych kosztach, ale zwiększonym wysiłku, można użyć alkalicznej lizy z oczyszczaniem DNA fenolem/chloroformem w celu wyizolowania plazmidowego DNA z E. coli23,24. Strategie oddzielania matrycowego DNA od plazmidowego DNA mogą się różnić w zależności od zmian wielkości matrycy DNA. W przypadku SEC ważne jest, aby skonfigurować trawienie enzymu restrykcyjnego w sposób, który maksymalizuje różnicę w wielkości między matrycą a plazmidowym DNA.

  1. Określ, które proporcje molowe (r) należy użyć do rekonstytucji. r jest równe stosunkowi moli oktamera do moli powtórzenia DNA. W przypadku początkowych prób na małą skalę wartości r 0,9, 1 i 1,1 są odpowiednie, jeśli celem jest uzyskanie nasyconych macierzy nukleosomalnych.
  2. Przygotować próbki w małej skali, obliczając ilość oktamera, którą należy dodać do około 18 μg DNA dla każdego badanego stosunku molowego. Wymieszaj oktamery DNA i histonów. Końcowe stężenie NaCl w próbce powinno wynosić ≥2 M, a końcowe stężenie DNA powinno wynosić około 0,3 μg/μl. Końcowe warunki buforowania próbki powinny również obejmować 10 mM Tris pH 7,8 i 1 mM EDTA.
  3. Próbki są teraz gotowe do dializy. Załaduj próbki do rurki dializacyjnej 12k-14k MWCO. Próbki należy dializować w stosunku do 2 litrów buforu o zmniejszającej się sile jonowej w następujący sposób.

Składniki we wszystkich: 10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA. Bufor 1 (dodać 1 M NaCl, 1 mM DTT) przez 5-6 godzin. Bufor 2 (dodać 0,75 M NaCl, 1 mM DTT) przez noc. Bufor 3 (dodać 2,5 mM NaCl, 1 mM DTT) przez 5-6 godzin. Bufor 4 (dodać 2,5 mM NaCl, 0,1 mM PMSF) przez noc.

  1. Wyjąć próbki z rurki dializacyjnej i przejść do sekcji 4-6. Jeśli próbki na małą skalę dają pożądane wyniki, powtórz kroki w sekcjach 3-6 na dużej skali.

Uwaga: Aby oszczędzać zasoby, próbki na małą skalę powinny mieć minimalną objętość niezbędną do przeprowadzenia dalszych badań przesiewowych. Aby uzyskać wystarczającą ilość próbki do wymienionych tutaj eksperymentów dotyczących prędkości sedymentacji i AFM, odpowiednie jest 50 μl próbek o stężeniu 0,3 mg/ml DNA. Wielkość próbek preparatywnych na dużą skalę zależy od ich przeznaczenia. Próbkę w dużej skali należy przygotować w taki sam sposób, jak próbki w małej skali.

4. Analiza prędkości sedymentacji odtworzonych macierzy nukleosomalnych

Uzasadnienie: Eksperymenty z prędkością sedymentacji w ultrawirówce analitycznej Beckman Xl-A/I dostarczają informacji na temat wielkości i kształtu cząsteczek w roztworze. Eksperymenty z prędkością sedymentacji przeprowadzone w warunkach niskiej zawartości soli służą do określenia stopnia, w jakim odtworzone macierze są nasycone nukleosomami.

  1. Rozcieńczyć próbkę do absorbancji około 0,5 przy 260 nm przy użyciu buforu TEN (10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA, 2,5 mM NaCl). Załadować 400 μl próbki do celi z dwusektorową częścią centralną, z próbką po jednej stronie i odniesieniem (buforem TEN) po drugiej25. Utrzymać menisk wzorcowy wyżej niż menisk próbki (tj. dodać 420 μl roztworu wzorcowego).
  2. Załaduj komórki do wirnika i odpowiednio wyrównaj komórki, używając znaków krzyżyka na spodzie komórek i wirnika25. Delikatnie odkurz soczewki komórek za pomocą sprężonego powietrza.
  3. Włącz wirówkę XL-A/XL-I, włóż wirnik, a następnie zamocuj i zabezpiecz optykę zgodnie z opisem w instrukcji. Otwórz oprogramowanie Proteome Lab i wybierz plik: nowy.
  4. Ustaw pojedynczy przebieg skanowania przy 3 000 obr./min i temperaturze 25 °C. W obszarze Opcje wybierz opcję zatrzymaj po ostatnim skanowaniu i uruchom kalibrację radialną (kalibracja promieniowa nie jest konieczna, jeśli wirnik był ostatnim wirnikiem używanym w AUC).
  5. Dla każdej komórki nazwij próbki, wybierz długość fali (260 nm), wybierz absorbancję i wybierz lokalizację pliku zapisu na komputerze. Rozpocznij pojedynczy przebieg skanowania.
  6. Użyj pojedynczego skanu, aby określić odpowiednią długość skanowania promieniowego (Rysunek 2A). Zmniejszenie długości komórki, która będzie skanowana, skraca czas wykonywania. Pamiętaj jednak, aby dołączyć menisk próbki i przedłużyć koniec bardzo blisko lub na dole komórki.

Uwaga: Pojedyncze skany pozwalają na skrócenie obszaru pomiaru poprzez rozpoczęcie pomiarów tuż przed meniskusem próbki (Rysunek 2A). Większość skanów generowanych podczas przebiegu AUC powinna mieć frakcje graniczne poza łąkotką, a także stabilne płaskowyże (ryc. 2B). Brudne soczewki na komórkach AUC mogą generować skany z dużymi skokami, co może wpływać na analizę danych. Do oprogramowania UltraScan dołączona jest instrukcja, która jest doskonałym źródłem informacji na temat analizy danych analitycznych z ultrawirowania26.

  1. Za pomocą panelu sterowania XL-A/XL-I wprowadź prędkość 0 i naciśnij start. Spowoduje to, że komora wirówkowa wytworzy próżnię i pozwoli na wyrównanie temperatury komory. Odczekaj 1 godzinę, aby umożliwić wyrównanie temperatury przed rozpoczęciem biegu.
  2. Użyj oprogramowania, aby skonfigurować rozruch dla żądanej prędkości i liczby skanów. Wyższe prędkości zwiększają rozdzielczość, ale należy zebrać co najmniej 20 skanów (najlepiej więcej), zanim próbka opadnie na dno komórki. Wygodnie jest nałożyć na siebie kilka ostatnich skanów (wykonanych w menu opcji) w celu monitorowania postępu przebiegu i sprawdzenia, czy nie ma potencjalnych problemów, takich jak nieszczelne komórki. Monitoruj pierwsze kilka skanów, aby zapewnić prawidłowe działanie.

5. Edycja i analiza danych dotyczących prędkości sedymentacji

Uzasadnienie: Surowe dane dotyczące prędkości sedymentacji powinny być analizowane przez program, który daje skorygowany dyfuzją rozkład współczynnika sedymentacji. Informacja ta z kolei wskazuje frakcję odtworzonej próbki, która zawiera zadanym poziomie nasycenia, np. w przypadku zastosowania 12-merowej matrycy DNA możliwe będzie określenie frakcji odtworzonych macierzy, która ma 10, 11 i 12 nukleosomów/DNA.

  1. Użyj oprogramowania do analizy danych AUC, takiego jak UltraScan, aby edytować dane26. Edycja danych skanowania musi być wykonana dla każdej komórki i tworzy zestaw danych do późniejszej analizy. Właściwa edycja skanów polega na zdefiniowaniu menisku próbki, zredukowaniu danych do obszaru zainteresowania oraz zdefiniowaniu obszarów linii bazowej i plateau (ryc. 2). W tym momencie można również usunąć niechciane skany ze zbioru danych. Ponieważ jednak możliwe jest usunięcie niechcianych skanów podczas analizy, zaleca się, aby wszystkie skany były przechowywane w tym momencie.
  2. Zdecydowanie zaleca się stosowanie rozszerzonej metody van Holde-Weischeta do analizy danych27. Ta metoda analizy koryguje skutki dyfuzji w trakcie przebiegu i daje całkowy rozkład współczynników sedymentacji. W szczególności ulepszona metoda van Holde'a-Weischeta (zaimplementowana w UltraScan) pozwoli na włączenie do analizy skanów, które nie mają stabilnych płaskowyżów lub które zawierają frakcje graniczne, które nie usunęły łąkotki28
    3. .
  3. Określ rozkład współczynników sedymentacji dla zmontowanych tablic. Reprezentatywne wyniki dla macierzy nukleosomalnych 601-12 (207bp, 12-mer) przedstawiono na rysunku 3.
  4. Jeżeli jedna z próbek w małej skali zawiera tablice o pożądanym zakresie współczynników sedymentacji, należy powtórzyć proces w zwiększonej skali, zaczynając od sekcji 3. Jeżeli żadna z próbek pobranych w małej skali nie ma właściwego rozkładu współczynników sedymentacji, należy powtórzyć badania w małej skali z nowym zakresem r, zaczynając od sekcji 3.

6. Wizualizacja macierzy nukleosomalnych za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM)

Uzasadnienie: AFM umożliwia wizualizację poziomu nasycenia macierzy nukleosomalnych. Technika ta uzupełnia prędkość sedymentacji przez AUC i trawienie enzymami restrykcyjnymi jako test kontroli jakości.

  1. Korzystając z metod opisanych powyżej, uzyskaj dobrze nasyconą macierz nukleosomów (ryc. 5A).
  2. Przygotować szkiełka mikowe poddane działaniu APTES, umieszczając ~30 μl 1:1,000 rozcieńczenia handlowego (Sigma-Aldrich (3-Aminopropyl)trietoksysilan A3648-100ML) w przefiltrowanej 0,22 μm wodzie nanoczystej na 30 min.
  3. Po 30 minutach spłucz APTES przefiltrowaną wodą i delikatnie wysusz je w strumieniu azotu.
  4. Umieścić odpowiednio rozcieńczoną próbkę układu nukleosomów (~1,5 ng/μl) na szkiełku podstawowym i inkubować pod przykryciem w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  5. Spłukać próbkę przefiltrowanym buforem do próbek, wysuszyć jak poprzednio i umieścić szkiełko na stoliku AFM (w tym przypadku mikroskopu sił atomowych Asylum Research MFP-3D).
  6. Zacznij od zobrazowania skanów 2 x 2 μm z 512 liniami skanowania. Policz liczbę nukleosomów, aby ustalić poziom nasycenia (ryc. 5B).
  7. Idealnie byłoby zobrazować obszary na szkiełku z dobrze oddzielonymi macierzami nukleosomów.
  8. W przypadku obrazów o wyższej rozdzielczości można uzyskać skan o rozdzielczości 500 x 500 nm (ilustracja 5C).
  9. Obrazy można spłaszczać i analizować za pomocą oprogramowania MFP-3D dostarczonego przez Asylum.
  10. Każdy obraz można podzielić na cztery ćwiartki i powiększyć cyfrowo, aby uzyskać wyraźniejszy widok dobrze oddzielonych macierzy, a przez matryce można narysować wiele linii odręcznych, a dla nukleosomów uzyskuje się profile wysokości (Rysunek 5C, ślad wysokości prawego panelu i 5D).
  11. Dla każdego typu macierzy obejmującej kilkaset nukleosomów należy przeanalizować kilka takich obrazów. Profile wysokości są rejestrowane, kategoryzowane i kreślone w programie MS Excel.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zilustrować protokół, zrekonstytuowaliśmy macierze nukleosomalne z rekombinowanych histonów rdzeniowych Xenopus oraz DNA składającego się z 12 tandemowych powtórzeń 207 bp sekwencji pozycjonującej 601 (601207 x 12). W pierwszej kolejności zmontowaliśmy natywne oktamery z liofilizowanych histonów rdzeniowych, a następnie oczyszcziliśmy oktamery za pomocą FPLC, używając kolumny S200 (Rysunek 1A). Większe kompleksy eluują z kolumny S200 wcześniej. Histony zazwyczaj eluują w następują...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Modelowe macierze nukleosomalne są bardzo przydatnym narzędziem do badania in vitro struktury i funkcji chromatyny. Na przykład były szeroko stosowane do badania mechanizmu kondensacji włókien chromatyny w roztworze 30-34 i umożliwiły uzyskanie struktury rentgenowskiej tetranukleosomu 35. Ostatnio okazały się przydatne w rozszyfrowywaniu skutków strukturalnych określonych wariantów histonów rdzeniowych, mutantów i modyfikacji potranslacyjnych14-16,36. W tym miejscu opisujemy ogól...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty NIH GM45916 i GM66834 dla J.C.H. oraz stypendium od Międzynarodowej Fundacji Zespołu Retta dla A.K. Praca ta była również wspierana przez GM088409 grantów NIH i wkład Instytutu Medycznego Howarda Hughesa w K.L.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-aminopropylo)trietoksysilanSigma-AldrichA3648-100ML
6-8 kDa Rurki do dializy MWCOFisher21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 KolumnaGE17-1069-01
Koncentrator odśrodkowy Vivaspin 50 kDa MWCOSartoriusVS2031
12-14 kDa Rurka do dializy MWCOFisher08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 SuperfineGE17-0476-01
XL-A/I Ultrawirówkaanalityczna Beckman-Coulter

Bibliografia

  1. Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 7, (1997).
  2. Hansen, J. C. Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).
  3. McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. Chromatin architectural proteins. Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).
  4. Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1. Biochemistry. 28 (23), 9129-9136 (1989).
  5. Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions. The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).
  6. Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4. Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).
  7. Nguyen, C., Gonzales, F. chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation. Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).
  8. Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure. Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).
  9. Simpson, R. T., Stafford, D. W. Structural features of a phased nucleosome core particle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).
  10. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  11. Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences. Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).
  12. Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *. The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).
  13. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).
  14. McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).
  15. Ma Shogren-Knaak,, Fry, C. J., Peterson, C. L. A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications. The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).
  16. Lu, X., Simon, M. The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure. Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).
  17. Ausio, J. Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure. Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).
  18. Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution. Methods. 12 (1), 62-72 (1997).
  19. Montel, F., Menoni, H., et al. The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin. Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).
  20. Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays. The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).
  21. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  22. Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling. Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).
  23. Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
  24. Sambrook, J., Russell, D. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. J. Vis. Exp. (33), e1530(2009).
  26. Demeler, B. UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments. Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).
  27. Holde, K. V., Weischet, W. Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes. Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).
  28. Demeler, B., van Holde, K. E. Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems. Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).
  29. Hansen, J., Lohr, D. Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays. Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).
  30. Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).
  31. Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).
  32. Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber. Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).
  33. Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding. The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).
  34. Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt. Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).
  35. Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre. Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).
  36. Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states. Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).
  37. Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding. Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).
  38. Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined "30 nm" Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone. Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).
  39. Dorigo, B., Schalch, T. Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail. J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).
  40. Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM. Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oktamer histonowyProtok rekonstytucjiSzybko sedymentacjiAnalityczna ultrawir wkaMikroskopia si atomowychChromatografia elowaDializa stopniowaOczyszczanie histon w rdzeniowych
Składanie macierzy nukleosomalnych z rekombinowanych histonów rdzenia i pozycjonowania nukleosomów DNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.