Artykuł metodologiczny

Wysokowydajna, zautomatyzowana ekstrakcja DNA i RNA z próbek klinicznych przy użyciu technologii TruTip w popularnych robotach do obsługi cieczy

35.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50356

⸱

11 czerwca 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Application Development, Akonni Biosystems, Inc., 2Manufacturing, Akonni Biosystems, Inc., 3Engineering, Akonni Biosystems, Inc., 4Research & Development, Akonni Biosystems, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

TruTip to prosta technologia ekstrakcji kwasów nukleinowych, w której porowata, monolityczna matryca wiążąca jest umieszczana w końcówce pipety. W związku z tym format przygotowania próbki jest kompatybilny z większością przyrządów do obsługi cieczy i może być używany do wielu zastosowań klinicznych o średniej i wysokiej przepustowości oraz typów próbek.

Streszczenie

TruTip to prosta technologia ekstrakcji kwasów nukleinowych, w której porowata, monolityczna matryca wiążąca jest umieszczana w końcówce pipety. Geometria monolitu może być dostosowana do konkretnych końcówek pipet o objętości od 1,0 do 5,0 ml. Duża porowatość monolitu umożliwia łatwe przechodzenie przez niego lepkich lub złożonych próbek przy minimalnym przeciwciśnieniu płynu. Przepływ dwukierunkowy maksymalizuje czas przebywania między monolitem a próbką i umożliwia przetwarzanie dużych objętości próbek w ramach jednej końcówki TruTip. Podstawowe etapy, niezależnie od objętości próbki lub geometrii TruTip, obejmują lizę komórek, wiązanie kwasów nukleinowych z wewnętrznymi porami monolitu TruTip, wymywanie niezwiązanych składników próbki i do lizy oraz elucję oczyszczonych i stężonych kwasów nukleinowych do odpowiedniego buforu. Właściwości i zdolności adaptacyjne TruTip zostały zademonstrowane w trzech zautomatyzowanych protokołach przetwarzania próbek klinicznych przy użyciu robotów do obsługi płynów Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR i STARplus, w tym izolacji RNA z aspiratu nosowo-gardłowego, izolacji genomowego DNA z krwi pełnej oraz ekstrakcji i wzbogacania DNA płodu z dużych ilości osocza matki (odpowiednio).

Wprowadzenie

Oczyszczanie kwasów nukleinowych jest konieczne dla większości diagnostyki molekularnej, zastosowań badawczych i nauk przyrodniczych. Od czasu ekstrakcji fenolem/chloroformem pojawiły się różne podejścia, z których wiele opiera się na podstawowej zasadzie wiązania kwasów nukleinowych z krzemionką w obecności soli chaotropowych 1. Proces ekstrakcji został usprawniony i zautomatyzowany dzięki zastosowaniu różnych formatów opartych na kulkach i membranach, przy czym filtry wirowe, kulki magnetyczne i podobne podejścia dominują w branży nauk przyrodniczych (patrz przykłady w 2-13). Chociaż cząsteczki i membrany są skuteczne, mają znane ograniczenia w konfrontacji z trudnymi matrycami klinicznymi. Na przykład membrany i kolumny oparte na kulkach są zgodne, mają małe rozmiary porów (stąd wysokie ciśnienie wsteczne) i wymagają pewnego rodzaju podparcia, aby mogły być przetwarzane przez wirówkę lub system próżniowy. Właściwości fizyczne membran i kolumn perełkowych skutkują znacznym oporem płynów, który ogranicza rodzaj próbek, które można efektywnie przetwarzać bez zatykania materiału eksploatacyjnego, i/lub całkowitą (wejściową) objętość próbki, która może być przetwarzana jednokierunkowo przez ścieżkę przepływu. I odwrotnie, cząstki magnetyczne muszą być rozprowadzane w próbce przez mieszanie. Konieczność jednorodnego rozprowadzenia cząstek magnetycznych w roztworze ogranicza całkowitą objętość próbki wejściowej, którą można przetworzyć za pomocą większości materiałów eksploatacyjnych z kulkami magnetycznymi. Cechy kliniczne próbki (takie jak lepkość lub złożoność) mogą prowadzić do nieefektywnego stężenia cząstek magnetycznych na boku rurki lub pręta. Ponadto drobne cząstki krzemionki mogą odrywać się od kulek podczas procesu ekstrakcji, tracąc namagnesowanie i zanieczyszczając próbkę końcową.

Technologia TruTip została opracowana w celu przezwyciężenia niektórych z tych ograniczeń i ograniczeń związanych z przetwarzaniem próbek kwasów nukleinowych 14. Osadzenie porowatego monolitu w końcówce pipety powoduje obniżenie przeciwciśnienia płynu, co umożliwia kontrolę przepływu za pomocą podciśnienia (tj. zasysanie pipety). Ta cecha umożliwia znaczne uproszczenie procesu ekstrakcji i oprzyrządowania wymaganego do oczyszczania kwasów nukleinowych z trudnych typów próbek (rysunek 1). Geometria i porowatość monolitu jest dostosowana tak, aby zminimalizować zatykanie, podczas gdy grubość monolitu zapewnia wystarczającą zdolność wiązania kwasów nukleinowych dla próbek o objętości od 1,0 do 5,0 ml. Dwukierunkowy przepływ podczas aspiracji i dozowania próbki pozwala na wydłużenie czasu przebywania między ekstraktem próbki a monolitem wiążącym w celu wydajnego odzyskiwania i elucji kwasów nukleinowych, a także umożliwia przetwarzanie stosunkowo dużych objętości próbek, które przekraczają objętość samej końcówki pipety. Wcześniej informowaliśmy o opracowaniu i zastosowaniu ręcznej procedury TruTip do oczyszczania RNA grypy z próbek z nosogardzieli przy użyciu jedno- lub wielokanałowego pipetora Rainin 15. Równoważną skuteczność ekstrakcji uzyskano między zautomatyzowaną metodą QIAcube a ręczną metodą TruTip przy 106 kopiach genów grypy A na ml aspiratu nosowo-gardłowego. Celem tego badania było zademonstrowanie średnio- i wysokoprzepustowych, zautomatyzowanych procedur oczyszczania kwasów nukleinowych TruTip dla aspiratu nosowo-gardłowego (NPA) i innych klinicznie istotnych typów próbek, przy użyciu robotów do obsługi cieczy, powszechnie spotykanych w referencyjnych laboratoriach klinicznych.

Protokół

Trzy protokoły automatycznej ekstrakcji TruTip są opisane i zademonstrowane tutaj: 1) średnioprzepustowa ekstrakcja RNA z NPA na Eppendorf epMotion 5070; 2) wysokoprzepustowa ekstrakcja genomowego DNA z małych objętości krwi pełnej na Hamilton STAR oraz 3) selektywna izolacja i wzbogacanie fragmentarycznego DNA płodu z dużych objętości osocza matki na Hamilton STARplus. Zautomatyzowane skrypty są dostępne w Akonni i dostępne są tutaj tylko deskryptory programów wysokiego poziomu. Odczynniki do ekstrakcji i elucji są automatycznie dozowane z koryt odczynników luzem na płytki 96-dołkowe za pomocą zautomatyzowanego skryptu (skryptów) przed przetworzeniem próbek klinicznych.

1. Automatyczna ekstrakcja RNA z aspiratu nosowo-gardłowego

Poprzednio opisana ręczna metoda TruTip 15 jest teraz dostosowana do działania na robocie do obsługi cieczy Eppendorf epMotion 5070, wykorzystując matrycę TruTip o dużych porach wbudowaną w końcówki do pipet Eppendorf o pojemności 1,0 ml, płytkę głębinową o pojemności 2 ml (USA Scientific), odczynniki do ekstrakcji Akonni TruTip i NPA jako typ próbki. Robot do obsługi cieczy epMotion 5070 utrzymuje jednocześnie do 8 końcówek, dzięki czemu opisano podstawowy protokół automatyczny dla 8 równoległych ekstrakcji. Jednak podczas jednego programu można przetworzyć do 24 próbek na jednej 96-dołkowej płytce z próbkami głębokimi. Dostępny jest (i wymagany) oddzielny program epMotion do przetwarzania 16 lub 24 próbek. Protokół opisany poniżej dotyczy 8 przykładowych skryptów automatycznych.

Ustawienia

  1. Próbki z nosogardzieli należy przynieść do RT przed rozpoczęciem ekstrakcji.
  2. Dozować 100 μl aspiratu do nosogardzieli oraz 150 μl wody wolnej od nukleaz do kolumny 1 płytki z próbką (ryc. 2A).
  3. Umieść sample płytkę w pozycji B1 na stole roboczym epMotion (Rysunek 2B).
  4. Umieść końcówki do pipet, końcówki TruTip i korytka na odczynniki o pojemności 30 ml w odpowiednich pozycjach stołu roboczego epMotion (Rysunek 2B).
  5. Otwórz oprogramowanie Eppendorf epBlue, wybierz plik Run dostarczony przez Akonni dla 8 próbek i załaduj metodę, klikając przycisk RUN na karcie RUN.
  6. W obszarze Ustawienia czujnika poziomu wybierz Poziomy i wskazówki, a następnie kliknij przycisk URUCHOM.
  7. Wprowadź próbkę objętości do oprogramowania i kliknij przycisk URUCHOM.
  8. Skrypt epMotion poprosi użytkownika o dodanie odczynników do ekstrakcji i elucji do zbiorników odczynników znajdujących się w pozycji B2 na stole roboczym. Dodaj zalecane objętości każdego odczynnika do odpowiedniego koryta. Dla 8 próbek minimalne objętości odczynników wynoszą:
Odczynnik Objętość (ml) Pozycja koryta 95% etanolu 3,5 cyfra arabska Bufor do płukania D 9,0 3 Bufor do płukania E 9,0 4 Bufor elucyjny A2 1.3 5 Bufor do lizy i wiązania D 11,0 6
  1. Wprowadź objętości odczynników do tabeli przedstawionej przez oprogramowanie epMotion podczas monitu z kroku 8 powyżej. Wartość wejściowa powinna odzwierciedlać rzeczywistą objętość buforu dozowanego przez użytkownika do każdego odpowiedniego zbiornika odczynnika i musi być większa lub równa minimalnym objętościom wymienionym powyżej. Nieprawidłowe wprowadzanie objętości może skutkować nieprawidłowymi objętościami dostarczanymi przez sprzęt epMotion do każdej probówki lub studzienki w 96-dołkowej płytce (płytkach).

Zautomatyzowany program

  1. Wybierz pozycję URUCHOM, aby uruchomić metodę automatyczną. Zautomatyzowany skrypt przejdzie przez następujące kroki bez interwencji użytkownika:
    Liza próbki i dystrybucja odczynników:
    1. Dozować 375 μl buforu do lizy D do kolumny 1 i mieszać przez 10 cykli (apirat + dozowanie = 1 cykl). Ten etap rozpoczyna proces inkubacji lizy, podczas gdy pozostałe odczynniki są porcjowane.
    2. Dozować 1,6 ml buforu do przemywania D do kolumny 2.
    3. Dozować 1,6 ml buforu do przemywania E do kolumny 3.
    4. Dozować 50 μl buforu elucyjnego A do kolumny 4.
    5. Przerwa na 6 minut, aby zakończyć 10-minutową inkubację próbki w buforze do lizy D.
    6. Dodać 375 μl etanolu do każdej studzienki w kolumnie 1, mieszając każdą próbkę z etanolem przez 10 cykli pipetowania.
    wydobywanie:
    1. Załaduj 8 końcówek TruTips z pozycji A2 na stole roboczym i rozpocznij proces ekstrakcji opisany na rysunku 1.
    2. Odessać i dozować mieszaninę próbki/buforu do lizy/etanolu z kolumny 1 płytki z próbką przez siedem cykli w celu związania kwasu nukleinowego z monolitem TruTip. Chociaż przepływ próbki przez TruTip może się różnić (ze względu na różnice w lepkości próbki klinicznej), zmiana przepływu nie miała wpływu na wydajność kwasów nukleinowych dla tych próbek. Opcje poprawy przepływu próbki są opisane w dyskusji.
    3. Przesunąć TruTips do kolumny 2 płytki do pobierania próbek i przejechać buforem D do przemywania 5x monolitu, aby usunąć resztki buforu do lizy i matrycę próbki.
    4. Przenieś TruTips do kolumny 3 płytki do pobierania próbek i cyklicznie przemyj bufor E 5x na monolicie, aby usunąć białka i inne zanieczyszczenia z związanego kwasu nukleinowego.
    5. Przesuń TruTips do pozycji pustego zbiornika odczynnika 1 (w lokalizacji stołu roboczego B2) i wykonaj cykl 80x (przy szybkim przepływie), aby wysuszyć monolit. Ważne jest, aby dokładnie wysuszyć TruTip, ponieważ pozostałości rozpuszczalników w eluowanych preparatach kwasów nukleinowych będą negatywnie wpływać na enzymy, takie jak odwrotna transkryptaza i polimeraza Taq DNA.
    6. Przenieś TruTips do kolumny 4 płytki próbki i wykonaj cykl 5x w buforze elucyjnym A. Wyekstrahowany i oczyszczony kwas nukleinowy znajduje się teraz w buforze elucyjnym w studzienkach 4 kolumny z płytką próbki.
    7. Wyrzuć TruTips do kosza na śmieci epMotion.
    8. Po zakończeniu programu ręcznie wyjmij płytkę próbki z przyrządu i przenieś oczyszczony kwas nukleinowy do nowych probówek w celu długotrwałego przechowywania lub dalszego użytkowania. Zaawansowani użytkownicy epMotion mogą dodać instrukcje do pliku Run, aby w razie potrzeby przenieść eluowane próbki do oddzielnych probówek do przechowywania lub płytek PCR.

Program dla 16 próbek powtórzy kroki od 10.1 do 10.13 przy użyciu kolumn 5-8 płytki próbki. W przypadku programu obejmującego 24 próbki kroki od 10.1 do 10.13 są powtarzane 2x przy użyciu kolumn z płytkami próbki odpowiednio 5-8 i 9-12.

2. 96-dołkowa ekstrakcja genomowego DNA z krwi pełnej

Robot do obsługi płynów Hamilton STAR służy do demonstracji automatycznego pobierania 96 próbek jednocześnie z krwi pełnej. Hamilton STAR różni się od systemu epMotion tym, że na pokładzie dostępna jest opcjonalna grzałka/wytrząsarka, która jest ważna dla trawienia enzymatycznego niektórych matryc klinicznych, takich jak krew pełna. Ponieważ system może być wyposażony w 96-kanałową głowicę pipetową, dla każdego z etapów TruTip i odczynników dostępna jest dedykowana 96-dołkowa płytka.

Ustawienia

  1. Włącz instrument STAR i komputer.
  2. Otwórz oprogramowanie Hamilton Run Control.
  3. Otwórz plik Uruchom dostarczony przez firmę Akonni dla 96 przykładów.
  4. Umieść sprzęt laboratoryjny na pokładzie STAR, jak pokazano na rysunku 3.
  5. Dozować odczynniki do odpowiednich korytek (objętości oznaczają minimum wymagane do przetworzenia 96 próbek):
Odczynnik Objętość (ml) Pozycja koryta Bufor do lizy i wiązania F 75 Rozdział 5 95% etanolu 100 szt. 6 Bufor do płukania J 175 Rozdział 7 Bufor do płukania K 175 Rozdział 8 Bufor elucyjny A2 12 9 Proteinaza K (20 mg ml-1) 8 15

6. Pozwól próbkom zrównoważyć się do RT.

7. Umieść probówki z próbkami w stojakach na próbki (pozycja na pokładzie 4 na rysunku 3). Umieść próbkę 1 z tyłu skrajnej lewej podstawy nośnej i przesuwaj się kolejno w dół każdej podstawy nośnej, tak aby próbka 96 kończyła się w prawym przednim położeniu.

Zautomatyzowany program

  1. Wybierz przycisk PLAY w lewym górnym rogu okna Uruchom plik i wprowadź liczbę przetwarzanych próbek. Zautomatyzowany skrypt przejdzie następnie przez następujące kroki bez interwencji użytkownika:
    Liza próbki i dystrybucja odczynników
    1. Przenieść 200 μl z każdej probówki z próbką na płytkę inkubacyjną w pozycji 14 na module grzałki/wytrząsarki (rysunek 3).
    2. Dozować 80 μl proteinazy K do każdego dołka próbki na płytce inkubacyjnej.
    3. Dozować 600 μl buforu do lizy F do każdej studzienki płytki inkubacyjnej.
    4. Mieszać roztwór przez 10 cykli, a następnie inkubować przez 20 minut w temperaturze 70 °C i 500 obr./min. Ustawiona temperatura 70 °C powoduje temperaturę próbki ~60 °C w płytce głębokiej studzienki, która mieści się w zakresie aktywności proteinazy K. Podczas inkubacji próbek system obsługi cieczy kontynuuje działanie poprzez dozowanie odczynników do odpowiednich płytek i studzienek:
      • 100 μl buforu elucyjnego A do każdej studzienki płytki studzienki głębinowej w pozycji 13.
      • 800 μl etanolu do każdej studzienki płytki studzienkowej w pozycji 10.
      • 1,6 ml przemyć bufor K do każdej studzienki płytki głębokiej w pozycji 12.
      • 1,6 ml przemywać bufor J do każdego dołka płytki studzienkowej w pozycji 11.
    5. Po 20-minutowej inkubacji mieszaninę próbki przenosi się z płytki inkubacyjnej na płytkę głębinową w pozycji 10 i miesza się przez 12 cykli pipetowania.
    6. Wyrzuć końcówki odczynników do kosza na śmieci.
      Ekstrakcja
      Ta część procedury krwi gDNA jest bardzo podobna do protokołu epMotion influenza, z wyjątkiem składu odczynników do płukania i liczby cykli. Końcówki Hamilton TruTips są czarne, więc przepływ płynów przez TruTip nie jest widoczny.
    1. Załaduj 96 TruTipów z pozycji pokładu 3.
    2. Odessać i dozować mieszaninę próbki/buforu do lizy/etanolu w pozycji 10 przez 10 cykli, aby związać kwasy nukleinowe z monolitem TruTip.
    3. Przesuń TruTips do pozycji 11 i przeprowadź cykl Wash Buffer J 5x nad monolitem, aby usunąć resztki buforu do lizy i matrycę próbki.
    4. Przesuń TruTips do pozycji 12 i cyklicznie Wash Buffer K 5x, aby usunąć białka i inne zanieczyszczenia z związanego kwasu nukleinowego.
    5. Obracaj TruTip 40x z dużą prędkością, aby wyschła na powietrzu.
    6. Przesuń TruTips do pozycji 13 i wykonaj 5-krotny cykl w buforze elucyjnym A2. Wyekstrahowany i oczyszczony kwas nukleinowy znajduje się teraz w buforze elucyjnym w płytce studzienki głębinowej.
    7. Wyrzuć TruTips do kosza na śmieci.

Gdy program zostanie zakończony, wyjmij płytkę elucyjną z instrumentu i przenieś pobrane próbki do odpowiednich probówek do przechowywania lub dalszych zastosowań.

3. Ekstrakcja DNA z dużych objętości próbek osocza

Instrument Hamilton STARplus służy do demonstrowania automatycznego protokołu ekstrakcji swobodnie krążącego DNA płodu z 5 ml osocza matki. System STARplus może obsługiwać dwa zautomatyzowane ramiona kanałów pipet, jedno z kanałami 8 x 5 ml i jedno z kanałami 8 x 1 ml. Ramiona te mogą pracować równolegle w celu rozłożenia w czasie przetwarzania w partiach po 8 próbek każda. TruTip o pojemności 5 ml służy do początkowej ekstrakcji o dużej objętości, a TruTip o pojemności 1 ml służy do separacji wielkości i dalszego zagęszczania wyekstrahowanego kwasu nukleinowego.

Konfiguracja

  1. Włącz instrument STARplus i komputer.
  2. Otwórz oprogramowanie Hamilton Run Control.
  3. Otwórz plik Run dostarczony przez firmę Akonni dla 8 próbek osocza o dużej objętości.
  4. Umieść sprzęt laboratoryjny na pokładzie STARplus, jak pokazano na rysunku 4.
  5. Dozować odczynniki do odpowiednich zbiorników:
Odczynnik Objętość (ml) Pozycja koryta CN-W1 (Zobacz materiał CN-W1) 17 5A CN-W2 (wersja CN-W2) 17 5 mld Silnik CN-W4 21 5C Proteinaza K (20 mg ml-1) 5 6A odpływ 17 6 mld EBA2 (wersja EBA2) 5 6C CN-W3 (Sterownik CN-W3) 5 Rozdzielczość 6D CN-B2 (Kod CN-B2) 5 6E CN-B3 (wersja CN-B3) 5 6F CN-L1 (Kanał CN-L1) Rozdział 52 7 CN-B1 (Kod CN-B1) 175 Rozdział 8
  1. Pozwól, aby próbka zrównoważyła się do RT.
  2. Umieść probówki z próbkami w stojakach na próbki (pozycja na pokładzie 3 na rysunku 4). Umieść próbkę 1 z tyłu i przesuwaj się kolejno w kierunku przodu pokładu.

Zautomatyzowany program

Ze względu na dużą objętość próbki wejściowej, etapy lizy i homogenizacji muszą być wykonywane poza instrumentem Hamilton STARplus w kąpieli wodnej. Kroki wymagające interwencji użytkownika w ramach protokołu automatycznego są oznaczone gwiazdką (*) na początku zdania i pogrubioną czcionką.

Liza próbki i dystrybucja odczynników: Próbka jest inkubowana z proteinazą K i buforem do lizy w celu homogenizacji próbki i uwolnienia DNA.

  1. Wybierz przycisk ODTWÓRZ w lewym górnym rogu okna Uruchom plik. Wprowadź liczbę przetwarzanych próbek, położenie końcówek do pipet na pokładzie oraz położenie końcówek TruTips na pokładzie.
  2. Automatyczny skrypt dodaje 615 μl proteinazy K, 5 ml osocza i 6,2 ml buforu do lizy CN-L1 do każdej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, a następnie WSTRZYMA SIĘ.
  3. *Wyjąć stożkowe probówki o pojemności 50 ml z pokładu próbek, wirować przez 30 sekund na wysokich obrotach i inkubować w trybie off-line przez 30 minut w temperaturze 60 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym. Po wyjęciu stożkowych probówek z pokładu Hamiltona, WZNÓW automatyczny skrypt, aby kontynuować dozowanie odczynników do odpowiednich płytek i dołków (Rysunek 4B i 4C):
    • 2 ml CN-W1 do co drugiej studzienki w pozycji 9, kolumna 1.
    • 2 ml CN-W2 do każdej innej studzienki w pozycji 9 kolumna 2.
    • 2 ml CN-W4 do każdej innej studzienki w pozycji 9 kolumna 3.
    • 250 μl EBA2 do każdej innej studzienki w pozycji 9 kolumny 4 i 5.
    • 495 μl CN-B2 do każdej innej studzienki w pozycji 10 kolumna 1.
    • 1 ml EBB do każdej innej studzienki w pozycji 10 kolumna 2.
    • 500 μl CN-W3 do każdej innej studzienki w pozycji 10 kolumna 3.
    • 500 μl CN-W4 do co drugiej studzienki w pozycji 10 kolumna 4.
    • 50 μl EBA2 do każdej innej studzienki w pozycji 10 kolumna 5.

Ponieważ kanały o długości 5 ml są zbyt szerokie, aby używać sąsiednich studzienek dla każdej próbki, zautomatyzowany program dozuje odczynniki do każdej innej studzienki płytki głębinowej w pozycji pokładu 9. Mechaniczne ramię używane do kanałów o pojemności 1 ml wymaga również użycia wszystkich innych studzienek w płytkach odczynników do etapów wykluczania i zatężania protokołu.

Po wydaniu odczynników, program zostanie WSTRZYMANY.

  1. *Po 30 minutach inkubacji w temperaturze 60 °C umieścić stożkowe probówki o pojemności 50 ml na lodzie na 5 minut.
  2. *Przywróć stożkowe probówki o pojemności 50 ml do ich pierwotnych pozycji w stojaku na próbki w pozycji pokładowej 4 i WZNÓW automatyczny skrypt.
  3. Dodać 12 ml buforu wiążącego CN-B1 do każdej probówki z próbką i wymieszać 10x.

Ekstrakcja dużej objętości: 5 ml TruTips służy do ekstrakcji całkowitego DNA z próbki zlizowanego osocza.

  1. Pobrać 5 ml TruTips z pozycji 2 do ekstrakcji kwasów nukleinowych o dużej objętości.
  2. Wprowadzić mieszaninę próbek do obrotu 15 razy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, zaczynając od dna probówki i przesuwając się o 3 mm wyżej po każdym cyklu pipetowania. Ten etap wiąże całkowity kwas nukleinowy z monolitem TruTip.
  3. Przenieś TruTips na płytki głębokiej studzienki w pozycji 6 kolumny 1 i przeprowadź cykl 1x w buforze myjącym CN-W1.
  4. Przesuń TruTips do pozycji 9 kolumny 2 i przeprowadź cykl 1x w Wash CN-W2.
  5. Przesuń TruTips do pozycji 9 kolumny 3 i przeprowadź cykl 2x w praniu CN-W4.
  6. Przesuń TruTips do pozycji 9 kolumny 4 i cykl 40x z dużą prędkością, aby uzyskać suchą matrycę wiązania.
  7. Przesuń TruTips do pozycji 9 kolumny 5 i wykonaj cykl 10x, aby wymyć związane kwasy nukleinowe z 5 ml TruTips. To jest elucja o dużej objętości #1.
  8. Przenieść TruTips do kolumny 6 i powtórzyć krok z drugą porcją buforu elucyjnego. To jest elucja o dużej objętości #2.
  9. Przenieś elucję #2 do pozycji 9 kolumny 5, aby połączyć ją z elucją #1 i wyrzuć TruTips.

Wykluczenie i koncentracja: DNA o wysokiej masie cząsteczkowej jest usuwane z wyekstrahowanej próbki, a pozostałe DNA jest izolowane i zagęszczane.

  1. Dodaj połączony eluant z kroku 22 do pozycji 10 kolumny 1 i dokładnie wymieszaj 10x.
  2. Pobrać 1 ml TruTips z pozycji 13 i wykonać cykl 20x, aby związać DNA o dużej masie cząsteczkowej z monolitem.
  3. Przesuń TruTips do pozycji 10 kolumny 2 i wykonaj cykl 5x, aby przepłukać końcówkę i usunąć DNA o dużej masie cząsteczkowej. TruTips są zatrzymywane i umieszczane z powrotem w stojaku na końcówki w pozycji 13.
  4. Za pomocą końcówek odczynników z pozycji 12 dodać 575 μl buforu wiążącego CN-B3 do próbki w pozycji 10 kolumna 1 i wymieszać 10x.
  5. Podnieść TruTips z kroku 25, powrócić do pozycji 10 kolumny 1 i wykonać cykl 20 razy, aby związać pozostałe DNA z próbki z 1 ml TruTip.
  6. Przesuń TruTips do pozycji 10 kolumny 4 i przeprowadź cykl 1x w Wash CN-W3, aby usunąć wszelkie pozostałe inhibitory.
  7. Przesuń TruTips do pozycji 10 kolumny 5 i wykonaj cykl 1x w myciu CN-W4, aby wypłukać resztki soli z CN-W3.
  8. Podnieś TruTips nad pozycję 10 kolumny 5 i przeprowadź powietrze przez końcówki 35x, aby wysuszyć monolit.
  9. Przesuń TruTips do pozycji 10 kolumny 6 i wykonaj cykl 10x w EBA2, aby wymyć oczyszczony, dobrany pod względem wielkości i skoncentrowany kwas nukleinowy.
  10. Odrzuć TruTips.
  11. Przenieść eluowaną próbkę z kolumny 6 do probówek o pojemności 1,5 ml w pozycji 11. Wyekstrahowane próbki są gotowe do przechowywania lub dalszego przetwarzania.

Wyniki

Dane z analizy real-time PCR dla ekstrakcji RNA grypy z aspiratów nosowo-gardlowych (NPA) przedstawiono na Rysunku 5A. Szacowana wydajność ekstrakcji kwasów nukleinowych jest zbliżona do wyników uzyskanych przy zastosowaniu ręcznej wersji protokołu 15. Obserwowano liniową odpowiedź średnich wartości Ct w zakresie od 104 do 106 kopii genu ml-1 w próbkach wzbogaconych wirusem grypy (R2 = 0,99 dla grypy A i 0,98 dla grypy B), przy odchyleniach standardowych średnich wartości Ct mniejszych niż 1 cykl. Brak kontaminacji krzyżowej w systemie epMotion wykazano na Rysunku 5B, gdzie 12 pozytywnych próbek NPA zawierających 106 kopii genu ml-1 przeplatano 12 próbkami kontrolnymi z samym buforem. Średnia wartość Ct dla kontroli pozytywnych wynosiła 30,16 ± 0,14, a wszystkie próbki kontrolne z buforem były negatywne. Całkowity czas przetwarzania próbek wynosi odpowiednio 16, 28 i 40 min dla 8, 16 i 24 próbek. Ponieważ typowy kliniczny aspirat lub wymaz z nosogardzieli zawiera 107 kopii genu ml-1 (przy założeniu 1000 wirionów na TCID50 16 oraz > 104 TCID50 ml-1 dla grypy 17), oczekuje się, że zautomatyzowany protokół epMotion będzie skuteczny w większości klinicznych próbek NPA.

Biorąc pod uwagę zakres testów molekularnych wykonywanych na ludzkim DNA genomicznym, głównym celem ekstrakcji kwasów nukleinowych z krwi pełnej jest uzyskanie wolnego od zanieczyszczeń DNA genomicznego o wysokiej masie cząsteczkowej. Zautomatyzowany protokół dla 96 próbek jest realizowany w ciągu 1 h, co stanowi poprawę w stosunku do innych systemów zautomatyzowanych (np. Promega MagneSil = 90 min i system Qiagen QIAamp DNA Blood BioRobot MDx = 2,5 h). Rycina 6A przedstawia profile absorbancji UV/Vis dla 45 pozytywnych próbek krwi przetworzonych jednocześnie z 45 próbkami kontrolnymi (blankami) z odczynnikami zgodnie z protokołem Hamilton STAR, przy średnim stosunku A260/280 wynoszącym 1,96 i średnim stosunku A260/230 wynoszącym 1,93. Stosunek A260/280 w zakresie 1,7–2,0 oraz stosunek A260/230 >1,7 są zazwyczaj wskaźnikami bardzo czystego DNA, wolnego od resztkowych soli, białek lub rozpuszczalników i akceptowalnego dla większości dalszych zastosowań molekularnych. Żel agarozowy 1% na Rycynie 6B pokazuje, że otrzymane gDNA ma wysoką masę cząsteczkową (> 24 kb) przy minimalnym rozszczepieniu. Średnia wydajność kwasów nukleinowych z pełnego zestawu 45 próbek pozytywnych wynosi 5,26 ± 0,46 μg ludzkiego DNA na 200 μl krwi pełnej, w oparciu o zestaw Life Technologies Quantifiler Human DNA Quantification Kit. Badania nad kontaminacją krzyżową, podobne do tych przedstawionych na Rycynie 5B, przeprowadzono z użyciem ujemnych kontroli w postaci blanków z buforem, rozmieszczonych naprzemiennie z próbkami pozytywnymi i ekstrahowanych równolegle; wszystkie blanki ponownie okazały się negatywne w badaniu PCR (nie pokazano). Oczyszczone gDNA nadaje się również do licznych innych analiz opartych na metodzie PCR (nie pokazano).

Wyniki w czasie rzeczywistym z ośmiu prób powtórzonych z połączonej próbki osocza macierzystego, przetworzonej za pomocą procedury TruTip dla dużych objętości, przedstawiono na Rysunku 7. Pełny protokół (w tym inkubacja z proteinazą K w trybie off-line) kończy się w ciągu około 2,5 hr, co jest porównywalne z manualnym zestawem Qiagen Circulating Nucleic Acids Kit (obecnie nie są dostępne porównywalne zautomatyzowane zestawy do ekstrakcji). Średnie wartości Ct dla wszystkich powtórzeń wyniosły odpowiednio 34,58 ± 0,66 dla płodowego DNA męskiego (CHY) oraz 29,76 ± 0,50 dla całkowitego DNA (CH1), co świadczy o doskonałej powtarzalności zautomatyzowanej metody ekstrakcji. Stężenie płodowego DNA w całkowitej puli DNA (w ekwiwalentach genomowych) obliczono na podstawie analizy punktów dopasowania w odniesieniu do standardów, co dało średnią zawartość % płodowego DNA na poziomie 2,8% dla wszystkich próbek. Rzeczywisty % płodowego DNA dla tej próbki jest nieznany, ponieważ próbki zostały połączone przed przeprowadzeniem ekstrakcji. Skład płodowego DNA w niepołączonych próbkach osocza ekstrahowanych metodą TruTip jest zazwyczaj 1,5-krotnie wyższy w porównaniu z wynikami uzyskanymi przy użyciu zestawu Qiagen Circulating Nucleic Acids Kit (brak danych na rysunku).

Proces oczyszczania DNA: Schemat etapów izolacji DNA metodą kolumnową: Liza, Przemywanie, Suszenie powietrzem, Elucja.
Rysunek 1. Proces ekstrakcji TruTip i schemat pracy, niezależnie od zastosowanego systemu do obsługi cieczy. Inne kroki przygotowania próbek lub obsługi cieczy mogą zostać włączone do rutyn automatycznych, w zależności od możliwości konkretnego instrumentu i oprogramowania do obsługi cieczy.

Schemat przygotowania i przechowywania mikropłytek do ekstrakcji DNA; obejmuje próbkę kliniczną oraz bufor elucyjny.
Rysunek 2. (A) Układ płyty z próbkami w urządzeniu Eppendorf epMotion 5070. (B) Rozmieszczenie odczynników/materiałów eksploatacyjnych na stole roboczym. Płyta z próbkami może zostać skonfigurowana dla maksymalnie 24 próbek (odpowiednio kolumny 1, 5 i 9), choć urządzenie epMotion przetwarza jednocześnie maksymalnie 8 próbek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Schemat płytki 96-dołkowej, pozycje próbek, obszar odpadów, konfiguracja procesu laboratoryjnego, układ eksperymentu.
Rycina 3. Układ pokładu Hamilton STAR do oczyszczania genomowego DNA z krwi pełnej (nie w skali). Pozycja pokładu 1 = końcówki filtrowane Hamilton 1 ml; 2 = końcówki niefiltrowane Hamilton 1 ml; 3 = końcówki Akonni/Hamilton 1 ml LPT 2 mm TruTips; 4 = nośniki próbek krwi wejściowych (probówki do pobierania krwi lub probówki do mikrocentryfugi); 5-9 = korytka na odczynniki o pojemności 290 ml odpowiednio dla Buforu do Lizy F, Etanolu, Buforu do Płukania J, Buforu do Płukania K i Buforu do Elucji A2; 10 = płytka wiążąca 96 głębokich dołków; 11 = Płukanie J 96 głębokich dołków; 12 = Płukanie K 96 głębokich dołków; 13 = płytka do elucji 96 głębokich dołków; 14 = grzejarka/mieszadło Hamilton HHS2 z płytką inkubacyjną Nunc 96 głębokich dołków; 15 = korytko na odczynniki o pojemności 50 ml zawierające proteinazę K. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę.

Zautomatyzowany proces pipetowania, schemat z konfiguracją mikropłytki, etapy przemywania i elucji, przepływ pracy laboratoryjnej.
Rysunek 4. Układ pokładu Hamilton STARplus do oczyszczania DNA z próbek plazmy o dużej objętości (nie w skali). System jest wyposażony w 8 kanałów 5 ml oraz 8 kanałów 1 ml (niewidoczne na schemacie pokładu). Pozycja na pokładzie 1 = filtrowane końcówki Hamilton 4 ml; 2 = Akonni/Hamilton 5 ml TruTips; 3 = wyjściowe próbki plazmy; 4 = stożkowe probówki 50 ml; 5 = koryty na odczynniki 120 ml zawierające odczynniki CN-W1, CN-W2 i CN-W4; 6 = koryta na odczynniki o małej objętości zawierające proteinazę K oraz odczynniki CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB i CN-W3; 7 = koryto na odczynniki 290 ml zawierające odczynnik CN-L1; 8 = koryto na odczynniki 290 ml zawierające odczynnik CN-B1; 9 = płytki 96-dołkowe do Kroku 1; 10 = płytki 96-dołkowe do Kroku 2; 11 = nośniki próbek dla oczyszczonego produktu końcowego; 12 = niefiltrowane końcówki Hamilton 1 ml; 13 = Akonni/Hamilton 1 ml LPT 4 mm TruTips. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Analiza stężenia grypy, wykres słupkowy (A) i wykres fluorescencji (B), wyniki qPCR.
Rycina 5. (A). Wyniki Real-time PCR z automatycznej ekstrakcji TruTip wirusa grypy dodanego do aspiratu z nosogardzieli (NPA). Objętość wejściowa NPA = 100 μl, objętość elucji = 50 μl. Wyniki stanowią średnią z 3 powtórzeń ekstrakcji z 5 różnych matryc NPA (n = 15) dla każdego poziomu rozcieńczenia i celu grypy. qPCR przeprowadzono na systemie LightCycler 480 zgodnie z wcześniej opisanymi warunkami analizy 15. (B) Nie wykryto kontaminacji krzyżowej, gdy 12 pozytywnych próbek NPA przeplatano kontrolami bez matrycy i poddano zautomatyzowanej procedurze ekstrakcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Wykres spektroskopii i wynik elektroforezy żelowej dla eksperymentu analizy i rozdziału DNA.
Rycina 6. Wyniki ekstrakcji ludzkiego genomowego DNA z krwi pełnej. A) Widma UV-Vis z NanoDrop 1000 (ThermoFisher) z 10 losowo wybranych powtórzeń. B) 1% żel agarozowy z oczyszczonym gDNA za pomocą TruTip. M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder. Ścieżki 1- 4 = ~100 ng oczyszczonego gDNA z czterech losowo wybranych powtórzeń. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Wykres słupkowy wartości Ct porównujący DNA męskie i całkowite w analizie PCR.
Rycina 7. Wyniki PCR w czasie rzeczywistym z ośmiu powtórzeń ekstrakcji wolnokrążącego DNA z osocza za pomocą TruTip. Próbki oznaczone gwiazdkami (* lub **) zostały wyekstrahowane w różne dni. CHY określa ilość męskiego DNA płodowego, a CH1 określa całkowitą ilość obecnego DNA (płodowego i macierzystego). qPCR przeprowadzono w systemie LightCycler 480 (Roche) przy użyciu wcześniej opublikowanych testów celujących w CHY i CH1 18.

Dyskusja

Prostota koncepcji TruTip i przebiegu pracy (ilustracja 1) sprawiają, że można go łatwo dostosować, zautomatyzować, wydajnie i skutecznie dostosować do wielu matryc próbek klinicznych, objętości próbek wejściowych i systemów obsługi cieczy. Należy jednak pamiętać, że każda próbka kliniczna jest wyjątkowa i będzie się różnić pod względem lepkości, cząstek, śluzu, zanieczyszczeń powierzchniowych, drobnoustrojów i/lub tła genetycznego człowieka. Biorąc pod uwagę spodziewane różnice w składzie próbki klinicznej i zamierzone zastosowania automatycznego protokołu przygotowania próbki TruTip, może być konieczne zmodyfikowanie niektórych etapów procedury TruTip w celu osiągnięcia pożądanych wyników dla określonego typu próbki. Niezależnie jednak od rodzaju próbki, parametry TruTip, które zazwyczaj mają największy wpływ na czystość i/lub odzysk kwasów nukleinowych, obejmują:

  1. Mieszanie i homogenizacja próbki z buforem do lizy (i alkoholem). Podczas gdy TruTips mają stosunkowo duży rozmiar porów, homogenizacja i upłynnienie próbki jest bardzo ważne dla wydajnej lizy komórek i późniejszych etapów wiązania z monolitem TruTip. Dzięki jednorodnemu i dobrze upłynnionemu lizatowi próbki mogą przepływać przez TruTip z większymi natężeniami przepływu, co skraca całkowity czas przetwarzania próbki. Protokół badania plazmy o dużej objętości demonstruje potencjał użytkowników w zakresie dokładnej homogenizacji i skraplania trudnych próbek (on-line lub off-line), pomimo dużej objętości próbki wejściowej.
  2. Natężenia przepływu. Wolniejsze prędkości przepływu podczas wiązania lub elucji kwasów nukleinowych zazwyczaj skutkują wyższą wydajnością kwasów nukleinowych, aczkolwiek kosztem całkowitego czasu przetwarzania. Wolniejsze prędkości przepływu mogą również zmniejszyć zakres ścinania DNA.
  3. Numery cykli. Optymalna liczba cykli aspiracji i dozowania zależy od typu próbki, całkowitej objętości próbki i natężenia przepływu. Krok 1 na rysunku 1 jest zazwyczaj punktem, w którym numery cykli (i natężenia przepływu) mogą wymagać pewnej empirycznej optymalizacji, przy czym próbki takie jak aspirat do nosogardzieli (ryc. 5) stanowią jeden z trudniejszych lizatów do optymalizacji ze względu na zakres lepkości NPA od różnych pacjentów.
  4. Suszenie. Całkowite wysuszenie monolitu TruTip jest konieczne, aby zapobiec koelucji pozostałości rozpuszczalników organicznych z oczyszczoną próbką kwasu nukleinowego i zahamowaniu dalszych procesów lub testów. Ponieważ TruTip nie jest suszony poprzez wirowanie lub filtrację próżniową, ważne jest, aby zmaksymalizować zarówno natężenie przepływu, jak i liczbę cykli na etapie suszenia. Zdarza się, że po zakończeniu cykli suszenia na końcu TruTip znajduje się resztkowa kropla roztworu myjącego. Robot Hamilton ma możliwość wykonania "dotknięcia końcówki" z boku studzienki w celu uwolnienia kropli, zapewniając w ten sposób elucję bez rozpuszczalników. System epMotion nie posiada tej funkcji, ale można zaprogramować wstępne płukanie końcówki TruTip w buforze elucyjnym, aby osiągnąć ten sam efekt.

Ponieważ geometria, materiał końcówki pipety i sposób mocowania do ramion kanału robota są unikalne dla każdego producenta urządzenia, dla każdego systemu obsługi cieczy wymagana jest inna konstrukcja TruTip. Wymiary monolitu TruTip (średnica, grubość i wielkość porów) korelują ze zdolnością wiązania kwasów nukleinowych (i wydajnością elucji), jak można się spodziewać w przypadku każdej techniki ekstrakcji do fazy stałej. Podczas gdy grube (> 4 mm) matryce mogą być osadzone w 1 ml TruTip w celu zwiększenia zdolności wiązania kwasów nukleinowych dla próbek o dużej objętości i/lub wyrównania zdolności wiązania w określonych formatach TruTip, istnieje kompromis między grubością TruTip a natężeniem przepływu podczas początkowego etapu wiązania (w obecności surowych lizatów). W związku z tym czasami korzystne jest osadzanie monolitów o większej średnicy w końcówkach do pipet o większej objętości w początkowych etapach automatycznego protokołu (np. 5 ml końcówek TruTip Hamilton/Akonni do ekstrakcji dużych objętości). Biorąc jednak pod uwagę specyficzne konfiguracje TruTip dyktowane przez producentów robotów do obsługi cieczy, niekoniecznie oczekujemy, że wydajność kwasów nukleinowych TruTip będzie identyczna na platformach do obsługi cieczy różnych producentów lub we wszystkich rozmiarach TruTip.

Próbki kliniczne (z definicji) będą zawierały znaczne ilości ludzkiego genomowego DNA, chyba że zostaną pozyskane z normalnie sterylnych miejsc (np. płynu mózgowo-rdzeniowego). Czasami pożądane jest ludzkie genomowe DNA (jak na rysunku 6), podczas gdy w innych zastosowaniach ludzkie DNA stanowi niepożądane tło genomowe (jak na rysunku 5). Obecność tła DNA zwykle nie jest problematyczna, o ile całkowita ilość kwasu nukleinowego w próbce nie przekracza zdolności wiązania monolitu, a DNA tła może służyć jako nośnik, jeśli pożądany docelowy kwas nukleinowy jest obecny w śladowych ilościach. Celem protokołu ekstrakcji osocza o dużej objętości (ryc. 7) jest wyizolowanie (rozdrobnionego) DNA płodu w obecności 10-20-krotnego nadmiaru DNA matki, co jest podobne do celu przygotowania próbki w testach na choroby zakaźne, z wyjątkiem tego, że sekwencje są wysoce zgodne i można je odróżnić tylko za pomocą wysoce specyficznych testów molekularnych i/lub dyskryminacji wielkości. W tym przypadku całkowite krążące DNA jest izolowane za pomocą 5 ml TruTip, a następnie wysokocząsteczkowe i niskocząsteczkowe DNA płodu jest rozdzielane poprzez późniejsze wiązanie i elucję do 1 ml TruTip poprzez zmianę warunków bufora wiązania. Selektywne rozdzielanie wielkości i wzbogacanie docelowych kwasów nukleinowych w oparciu o ich właściwości wiązania i elucji z monolitem krzemionkowym jest znacznie innym sposobem działania niż osiągany przez membrany lub kolumny wirowe wykluczające rozmiar. Separacja wielkości i wzbogacanie DNA drobnoustrojów z DNA genomowego człowieka może zostać osiągnięte w przyszłych zastosowaniach poprzez dostosowanie wiążących i elucyjnych TruTip.

Zademonstrowane tutaj zautomatyzowane protokoły podkreślają użyteczność samego monolitu TruTip do przetwarzania różnych próbek klinicznych oraz sposób, w jaki można go dostosować do dużych objętości i specjalnych robotów do obsługi cieczy. Uproszczone metody zazwyczaj skutkują szybszymi protokołami ekstrakcji w porównaniu z innymi zautomatyzowanymi systemami. Prostota technologii TruTip zapewnia jednak również pewne korzyści kosztowe dla osób zainteresowanych zakupem nowego, zautomatyzowanego systemu oczyszczania kwasów nukleinowych, ponieważ podstawowym sprzętem wymaganym do automatyzacji procedur TruTip jest samo ramię kanału pipety, a nie pręty magnetyczne, systemy próżniowe lub wirówki pokładowe. Wykorzystanie wstępnie napełnionych płytek z odczynnikami może również zmniejszyć ilość miejsca i wymaganych materiałów eksploatacyjnych oraz podwoić przepustowość na cykl. Minimalizacja przestrzeni na pokładzie dzięki protokołom TruTip umożliwia również zaawansowanym użytkownikom integrację zautomatyzowanych procesów poprzedzających lub końcowych z TruTip. Na przykład rozwiązanie easyBlood firmy Hamilton do frakcjonowania krwi pełnej można połączyć z automatyczną metodą ekstrakcji TruTip, co znacznie usprawniłoby procesy biobankowania. Procesy po ekstrakcji, takie jak oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych, normalizacja, konfiguracja PCR lub sekwencjonowanie DNA, są również łatwo zintegrowane z TruTip na większych platformach do obsługi cieczy.

Oświadczenia

Autorami są pracownicy firmy Akonni Biosystems, Inc., którzy produkują materiały wykorzystane w tym artykule.

Bezpłatny dostęp i produkcja tego artykułu jest sponsorowana przez Akonni Biosystems, Inc.

Podziękowania

Część tej pracy była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) w ramach grantu R 44 AI072784. Dziękujemy dr Kirsten St. George, Sarze B. Griesemer, Darylowi Lamsonowi i Amy Dean z Laboratorium Chorób Wirusowych, Wadsworth Center, Departament Zdrowia Stanu Nowy Jork za ilościowe określenie wirionów grypy i dostęp do klinicznie potwierdzonych testów PCR w czasie rzeczywistym na grypę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki/Materiały
Zestaw do ekstrakcji wirusa grypy TruTip (EPM TruTips)figure-materials-1 Akonni Biosystems, Inc.300-11120
95% etanolAcros Organics/ThermoFisher ScientificAC615110040
Acetone 99%Sigma-Aldrich270725-4L
woda traktowana DEPCLife TechnologiesAM9906
Zbiornik na odczynniki, 30 mlEppendorf960050100
Płytka głębokolwiek 96-dołkowa2,000 μlUSA Scientific30502302
nakładki filtrujące epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μlEppendorf960050100
Sprzęt
System epMotion 5070Eppendorf5070 000.000
Dozownik TM1000-8960001061
Statyw na zbiorniki960002148
Tabela 1. Odczynniki i sprzęt do zautomatyzowanej ekstrakcji RNA z wymazów z nosa i gardła (NPA).
Odczynniki/Materiały
Zestaw do ekstrakcji gDNA z krwi TruTip (Hamilton TruTips)figure-materials-2 Akonni Biosystems, Inc.300-20341
95% etanolAcros Organics/ThermoFisher ScientificAC615110040
Proteinaza KAMRESCO LLCE195
stojak z filtrowanymi końcówkami Hamilton CO-RE 96 o pojemności 1 mlHamilton Robotics, Inc.235905
stelaż z końcówkami Hamilton CO-RE 96, 1 ml, niefiltrowaneHamilton Robotics, Inc.235904
Kuweta na odczynniki 50 mlHamilton Robotics, Inc.187297
płyta głębokodołkowa 2 mlUSA Scientific1896-2800
Nunc 96 DWP-2 mlThermofisher27874
Korytko na odczynnikiFisher14-222-412
Sprzęt
System Hamilton STARHamilton Robotics, Inc.173027
Kanały niezależnej pipety 1 ml / ramię modułoweHamilton Robotics, Inc.173081/173050
głowica 96-kanałowa 1 mlHamilton Robotics, Inc.199090
Uchwyty na końcówkiHamilton Robotics, Inc.182085
Nośniki/wkłady na próbkiHamilton Robotics, Inc.173400/182238
Kamizelki taktyczne z wkładami balistycznymiHamilton Robotics, Inc.182090
Nośnik MultiflexHamilton Robotics, Inc.188039
Urządzenie grzejące z wytrząsarką HHS2Hamilton Robotics, Inc.199033
Uchwyt do kasetHamilton Robotics, Inc.188047
Tabela 2. Odczynniki i sprzęt do ekstrakcji genomowego DNA z krwi pełnej w formacie 96-dołkowym.
Odczynniki/Materiały
Zestaw do ekstrakcji krążącego DNA TruTip R+D (Hamilton TruTips)figure-materials-3 Akonni Biosystems, Inc.Zadzwoń, aby uzyskać informacje
100% etanolSigma-Aldrich459828-1L
IzopropanolAcros Organics/ThermoFisher ScientificAC327270010
Proteinaza KAMRESCO LLCE195
Końcówki filtrowane 4 mlHamilton Robotics, Inc.184022
Nienapowietrzane końcówki 1 mlHamilton Robotics, Inc.235939
Płytki 96-dołkowe o głębokich dołkachUSA Scientific1896-2800
Probówki stożkowate 50 mlCorning/ThermoFisher Scientific05-526B
Kuwety na odczynniki 50 mlHamilton Robotics, Inc.187297
Kuwety na odczynniki o pojemności 120 mlHamilton Robotics, Inc.182703
Kuwetki na odczynniki o dużej objętości z 96 stanowiskamiThermoFisher Scientific14-222-412
Sprzęt
Podstawa / Moduł platformy stacji roboczej STARplus AutoloadHamilton Robotics, Inc.173025/190012
1 ml niezależne kanały pipety / ramięHamilton Robotics, Inc.173081/173052
5 ml niezależny kanał / ramię modułoweHamilton Robotics, Inc.184090/173050
Kamizelki taktyczne z kieszeniami na płyty balistyczneHamilton Robotics, Inc.182090
Nośnik MultiflexHamilton Robotics, Inc.188039
Uchwyt do korytek na odczynniki o pojemności 50 mlHamilton Robotics, Inc.188047
Uchwyt do koryt z odczynnikiem 120 mlHamilton Robotics, Inc.185290
Uchwyty na końcówkiHamilton Robotics, Inc.182085
Statywy na probówki 50 mlHamilton Robotics, Inc.182245
Statywy na próbki 24-miejscoweHamilton Robotics, Inc.173400
Statyw na próbki z 32 pozycjamiHamilton Robotics, Inc.173410
Tabela 3. Odczynniki i sprzęt do ekstrakcji DNA z plazmy w dużych objętościach.

Bibliografia

  1. Boom, R., Sol, C. J. A., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
  2. Baker, M. P., Mitchell, A., et al. Isolation of genomic DNA from blood using a novel filter-based DNA purification technology. BioTechniques. 31, 142-145 (2001).
  3. Sinclair, B. To bead or not to bead: applications of magnetic bead technology. The Scientist. 12, 17-24 (1998).
  4. Dederich, D. A., Okwuonu, G., et al. Glass bead purification of plasmid template DNA for high throughput sequencing of mammalian genomes. Nucl. Acids Res. 30, e32(2002).
  5. Levison, P. R., Badger, S. E., et al. Recent developments of magnetic beads for use in nucleic acid purification. J. Chromatogr. A. 816, 107-111 (1998).
  6. Hourfar, M. K., Schmidt, M., Seifried, E., Roth, W. K. Evaluation of an automated high-volume extraction method for viral nucleic acids in comparison to a manual procedure with preceding enrichment. Vox Sang. 89, 71-76 (2005).
  7. Perelle, S., Cavellini, L., et al. Use of a robotic RNA purification protocol based on the NucliSens easyMAG for real-time RT-PCR detection of hepatitis A virus in bottled water. J. Virol. Methods. 157, 80-83 (2009).
  8. Riemann, K., Adamzik, M., et al. Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples. J. Clin. Lab. Anal. 21, 244-248 (2007).
  9. Hukari, K. W., Shultz, M., Isely, N., Milson, R., West, J. A. A completely automated sample preparation instrument and consumable device for isolation and purification of nucleic acids. J. Lab. Autom. 16, 355-365 (2011).
  10. Kessler, H., Mühlbauer, G. Fully automated nucleic acid extraction. MagNA Pure LC. Clin. Chem. 47, 1124-1126 (2001).
  11. Miller, S., Seet, H., Khan, Y., Wright, C., Nadarajah, R. Comparison of QIAGEN automated nucleic acid extraction methods for CMV quantitative PCR testing. Am. J. Clin. Pathol. 133, 558-563 (2010).
  12. Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction. J. Mol. Diagn. 10, 311-316 (2008).
  13. Kruhøffer, M., Voss, T., et al. Evaluation of the QIAsymphony SP workstation for magnetic particle-based nucleic acid purification from different sample types for demanding downstream applications. J. Lab. Autom. 15, 41-51 (2010).
  14. Akonni Biosystems, Inc. Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids. United States Patent. , US7759112 (2010).
  15. Chandler, D. P., Griesemer, S. B., et al. Rapid, simple influenza RNA extraction from nasopharyngeal samples. J. Virol. Methods. 183, 8-13 (2012).
  16. Chan, K. H., Lai, S. T., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1). J. Clin. Virol. 45, 205-207 (2009).
  17. Chan, K. H., Lama, S. Y., et al. Comparative analytical sensitivities of six rapid influenza A antigen detection test kits for detection of influenza A. subtypes H1N1, H3N2 and. 38, 169-171 (2007).
  18. Fan, H. C., Blumenfeld, Y. J., Chitkara, U., Hudgins, L., Quake, S. R. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 16266-16271 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja DNAizolacja RNArobot Hamilton Starautomatyzacja pipetowaniawi zanie kwas w nukleinowychprzetwarzanie krwi pe nejaspirat z nosogardzieliosocze matkiwzbogacanie p odowego DNA

Powiązane artykuły