Artykuł metodologiczny

Identyfikacja motywów funkcjonalnych i ich partnerów wiążących w oparciu o peptydy

DOI:

10.3791/50362

⸱

30 czerwca 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Biochemistry, & Immunology, Morehouse School of Medicine, 2Institute for Systems Biology, 3Advanced Medical & Dental Institute, Universiti Sains Malaysia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano techniki analizowania mechanizmów leżących u podstaw wydzielania HIV-1 Nef w egzosomach. Specyficzne krótkie peptydy pochodzące z transfekcji Nef i białka wykorzystano do określenia struktury, funkcji i partnerów wiążących region modyfikacji wydzielania Nef. Procedury te mają ogólne znaczenie w wielu badaniach mechanistycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specyficzne krótkie peptydy pochodzące z motywów występujących w białkach o pełnej długości, w naszym przypadku HIV-1 Nef, nie tylko zachowują swoją funkcję biologiczną, ale mogą również kompetycyjnie hamować funkcję białka o pełnej długości. Zestaw 20 peptydów skanujących Nef o długości 20 aminokwasów, z których każdy nakładał się na 10 aminokwasów sąsiada, został wykorzystany do identyfikacji motywów w Nef odpowiedzialnych za indukcję apoptozy. Peptydy zawierające te motywy apoptotyczne indukowały apoptozę na poziomach porównywalnych z białkiem Nef o pełnej długości. Drugi peptyd, pochodzący z regionu modyfikacji wydzielania (SMR) Nef, zachował zdolność do interakcji z białkami komórkowymi zaangażowanymi w wydzielanie Nef w egzosomach (exNef). Ten peptyd SMRwt został wykorzystany jako białko "przynęty" w eksperymentach z koimmunoprecypitacją w celu wyizolowania białek komórkowych, które wiążą się specyficznie z motywem SMR Nef. Transfekcję białek i hamowanie przeciwciał wykorzystano w celu fizycznego zakłócenia interakcji między Nef a mortaliną, jednym z izolowanych białek wiążących SMR, a efekt zmierzono za pomocą fluorescencyjnego testu wydzielania exNef. Zdolność peptydu SMRwt do konkurowania z pełnowymiarowym Nef dla białek komórkowych wiążących motyw SMR, czyni go pierwszym inhibitorem wydzielania exNef. Tak więc, stosując opisane tutaj techniki, które wykorzystują unikalne właściwości specyficznych krótkich peptydów pochodzących z motywów znajdujących się w białkach o pełnej długości, można przyspieszyć identyfikację funkcjonalnych motywów w białkach i rozwój opartych na peptydach inhibitorów funkcji patogennych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z pojawieniem się terapii antyretrowirusowej, epidemia AIDS w świecie zachodnim została spowolniona, ale nie ograniczona, a rozprzestrzenianie się HIV nadal stanowi poważne obciążenie zdrowotne na całym świecie. Z wyjątkiem marginalnie skutecznego tajlandzkiego badania klinicznego RV144, szczepionki przeciwko HIV jak dotąd nie chronią przed zakażeniem. W związku z tym badania nad dodatkowymi, potencjalnymi celami terapeutycznymi są nadal uzasadnione.

Wraz z wyczerpaniem limfocytów T CD4, cechą charakterystyczną zakażenia wirusem HIV jest uporczywa uogólniona aktywacja immunologiczna. Ta przewlekła aktywacja immunologiczna (CIA) prowadzi do wzrostu obrotu komórkowego, aktywowanych i zróżnicowanych subpopulacji limfocytarnych, wyczerpania komórkowego i starzenia się oraz zabijania limfocytów T i limfocytów B poprzez śmierć komórek indukowaną aktywacją (AICD)1,2,3 i jest dobrze znana jako jeden z najsilniejszych predyktorów progresji choroby4,5,6,7,8,9,10,11,12. Jednak mechanizmy leżące u podstaw wyczerpania limfocytów T CIA i CD4 w zakażeniu wirusem HIV pozostają w pełni wyjaśnione.

Dowody z naszego laboratorium i innych doprowadziły nas do modelu progresji choroby (Rysunek 1), w którym białko HIV Nef (Negatywny Czynnik Regulatorowy) indukuje swoje wydzielanie w egzosomach z komórek zakażonych HIV-113,14. Te egzosomy zawierające Nef (exNef) indukują apoptozę w wielu liniach komórkowych, w tym w niezakażonych limfocytach T CD415,16. Alternatywnie, w monocytach/makrofagach exNef zmienia wzorce ekspresji genów, np. ekspresję cytokin, i wydaje się, że wywołuje stan nieplanowanej aktywacji immunologicznej. Ten materiał dowodowy sugeruje ważną rolę exNef w zubożeniu komórek T CIA i CD4.

Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw zdolności Nef do manipulowania szlakiem transportu egzosomalnego będzie przydatne w projektowaniu nowych inhibitorów wydzielania exNef. Hamowanie wydzielania exNef powinno zmniejszyć wyczerpanie limfocytów T CD4 i CIA, które napędzają patogenezę HIV/AIDS.

Aby zebrać dowody, które doprowadziły do naszego modelu progresji choroby HIV/AIDS i późniejszych danych, które zbudowały ten model, opracowaliśmy szereg nowych odczynników i metodologii, które pozwoliły nam przeanalizować genetykę wydzielania exNef i zacząć określać zaangażowane białka komórkowe. We wstępnych pracach stwierdziliśmy, że białko Nef indukuje apoptozę w komórkach osób postronnych i jest uwalniane zewnątrzkomórkowo z komórek transfekowanych Nef i zakażonych wirusem HIV15. Wcześniej wykazano, że peptydy pochodzące z SDF-1α (czynnik pochodzący z komórek zrębu-1, z alternatywnym splicing alfa) zachowują większość aktywności wiążącej i sygnalizacyjnej cząsteczki o pełnej długości17. Spekulowaliśmy, że peptydy Nef mogą zachować część aktywności apoptotycznej pełnego białka i że peptydy te koniecznie zawierałyby domenę apoptotyczną Nef. Aby zidentyfikować te peptydy, a w konsekwencji domenę apoptotyczną Nef, uzyskaliśmy zestaw 20 peptydów skanujących HIV-1 Nef z NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. Te peptydy 20-aa, z których każdy nakłada się na 10 aminokwasów sąsiada, są nazwane numerem ich ostatniego aminokwasu, tj. N20 obejmuje aminokwasy Nef 1-20, N30 obejmuje aminokwasy Nef 11-30 itd.16. Odkryliśmy, że wystawienie komórek T na zewnątrz komórek na specyficzne peptydy nakładające się na dwie odrębne domeny 10-aa w białku Nef o pełnej długości indukowało apoptozę w tych komórkach. Późniejsza analiza tych peptydów apoptotycznych pochodzących z Nef ujawniła ich zdolność do fizycznej interakcji z receptorem chemokiny CXCR4 na powierzchni limfocytów T, z kinetyką wiązania, która pozwoliła tym peptydom na konkurencyjne hamowanie wiązania między CXCR4 a jego naturalnym ligandem SDF-1α. Wreszcie, stwierdzono, że interakcja peptydów apoptotycznych pochodzących z Nef z CXCR4 indukuje reakcję stresową w tych limfocytach T, prowadząc do apoptozy. Te dowody pozwoliły nam szybko zmapować domeny funkcjonalne Nef; proces, który trwałby znacznie dłużej przy użyciu standardowych technik mutagennych DNA, takich jak mutageneza skaningowa alaniny. Wykazano również, że te krótkie peptydy pochodzące z Nef zachowały biologiczną funkcję domen apoptotycznych w białku o pełnej długości.

Po zidentyfikowaniu roli zewnątrzkomórkowego Nef, tj. apoptozy limfocytów T, staraliśmy się lepiej zrozumieć, w jaki sposób Nef jest wydzielany z komórek. Korzystając z serii zmutowanych konstruktów Nef, zmapowaliśmy wysoce konserwatywne motywy białka Nef w N-końcowych regionach zarówno HIV Nef, jak i jego odpowiednika makaka rezusa SIVmac (małpi wirus niedoboru odporności) Nef, które mają kluczowe znaczenie dla wydzielania exNef13 . Jeden z tych motywów, Region Modyfikacji Wydzielania (SMR; 66VGFPV70), był szczególnie krytyczny, ponieważ zastąpienie alaniny którymkolwiek z jej pięciu aminokwasów albo znacznie zmniejszyło, albo zniosło wydzielanie exNef. Po dostarczeniu do komórek za pomocą odczynnika do dostarczania białka rydwanu firmy Active Motif, stwierdzono, że peptyd zawierający SMR przyłączony do sekwencji peptydowej FLAG (SMRwt) hamuje wydzielanie exNef zarówno z komórek transfekowanych Nef, jak i zakażonych wirusem HIV 18. Opierając się na naszych wcześniejszych doświadczeniach z peptydami, zdecydowaliśmy się użyć tego peptydu do wyjaśnienia cząsteczek i mechanizmów leżących u podstaw roli Nef SMR w wydzielaniu exNef.

Używając peptydu SMRwt jako naszego "białka przynęty", wspólnie immunoprecypitowaliśmy komórkowych partnerów wiążących SMR z niezakażonych lizatów limfocytów T18. Sekwencja peptydowa FLAG zapewniła wygodny uchwyt do wychwytywania peptydu SMRwt za pomocą żywicy powinowactwa anty-FLAG. Nasze poprzednie odkrycie, że pojedyncza mutacja waliny do alaniny w peptydzie SMRwt była wystarczająca do zniesienia hamowania wydzielania exNef, zidentyfikowało wygodny, wysoce specyficzny peptyd kontrolny (SMRmut), którego użyliśmy, aby wykluczyć białka koimmunoprecypitowane niespecyficzne dla SMR. Użycie peptydu z konkretną domeną będącą przedmiotem zainteresowania, a nie białka o pełnej długości, pozwoliło nam ominąć badania przesiewowe dziesiątek czynników komórkowych, które wiążą się z innymi domenami w Nef19.

Gdy zidentyfikowaliśmy partnerów wiążących SMR, logicznym następnym krokiem było pokazanie, że zidentyfikowani partnerzy wiążący komórki są ważne dla funkcji biologicznej18. Standardową procedurą, aby to osiągnąć, jest obniżenie poziomu białka za pomocą docelowego miRNA lub siRNA specyficznego dla białka, a następnie oznaczenie wpływu na funkcję biologiczną. Przeprowadziliśmy knockdown miRNA, który hamuje translację docelowego mRNA, zmniejszając produkcję tego celu, w tym przypadku białka wiążącego SMR. To zmniejszenie docelowego białka jest skutkiem pośrednim i prawdopodobnie ma opóźniony wpływ na funkcję biologiczną, w której docelowe białko odgrywa rolę. W związku z tym zastosowaliśmy również mniej powszechną technikę hamowania przeciwciał, aby określić, czy bezpośrednie zakłócenie aktywności białka docelowego zmniejsza lub eliminuje funkcję biologiczną. W tej procedurze przeciwciała wytworzone przeciwko docelowemu białku są transfekowane do komórki za pomocą odczynnika Chariot i oddziałują bezpośrednio z białkiem docelowym, albo sekwestrując je od miejsca funkcji, albo blokując jego odpowiednią domenę wiążącą. Hamowanie białka docelowego poprzez tę procedurę bezpośrednio zakłóca jego funkcję i może uzupełniać procedury knockdown RNA, dodatkowo potwierdzając znaczenie białka docelowego dla funkcji biologicznej.

Chociaż odczynnik Chariot jest skuteczny w dostarczaniu peptydów i białek do komórek; proces ten jest czasochłonny i ogranicza rodzaje eksperymentów, np. przedłużone lub powtarzane ekspozycje oraz badania na zwierzętach in vivo, które można przeprowadzić. W związku z tym dodaliśmy sekwencję peptydu penetrującego komórki (CPP) do peptydu SMRwt (SMRwt-CPP)18, aby wygenerować peptyd, który może być biernie pobierany przez komórki z pożywki hodowlanej. Ta wersja była równie skuteczna jak poprzednia w hamowaniu wydzielania exNef.

Dowody z tych opublikowanych eksperymentów pokazują zdolność małych peptydów zawierających specyficzne motywy funkcjonalne do antagonizowania funkcji białka o pełnej długości poprzez inhibicję konkurencyjną i do izolowania białek, które wiążą te motywy. Można by się spodziewać, że techniki te powinny być przydatne w wielu protokołach eksperymentalnych. Powinny być również skuteczne w inżynierii nowych inhibitorów peptydowych wielu procesów komórkowych; funkcję, którą można dodatkowo rozszerzyć poprzez powiązanie z sekwencjami CPP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I. Użycie krótkich peptydów w analizie biologicznej

I.1. Mapowanie biologicznie funkcjonalnych motywów za pomocą peptydów

  1. Leczenie komórek peptydami skanującymi Nef
    1. Zaopatrz się w zestaw peptydów skanujących obszar zainteresowania. Do naszych eksperymentów uzyskano 20-merowe peptydy, z 10 nakładającymi się na siebie aminokwasami, obejmujące całe białko Nef HIV-1 (205 aa), z programu AIDS Reagent Program. Peptydy są oznaczane indywidualnie w następujący sposób:
    2. Dodać 10 ng/ml peptydu do pożywki do hodowli komórkowej.
    3. Dodać 10 ml pożywki hodowlanej na płytkę do kultur komórkowych Jurkat.
    4. Inkubować kultury przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
  2. Test apoptozy za pośrednictwem końcowej deoksynukleotydylotransferazy dUTP z biotyną Nicka (TUNEL)
    1. Umyj komórki 1X PBS i utrwal przez 30 minut w temperaturze pokojowej z 4% paraformaldehydem w 1X PBS, pH 7,4.
    2. Umyć 1X PBS i przepuszczać 0,1% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Przepłucz komórki dwukrotnie 1X PBS.
    4. Policz barwione komórki za pomocą epifluorescencji w sterowanym komputerowo systemie mikroskopowym.

I.2. Analiza inhibicji konkurencyjnej za pomocą peptydów

  1. Kotransfekcja peptydów przy użyciu zestawu odczynników do dostarczania białek rydwanu
    1. Na mieszaninę reakcyjną transfekcji rozcieńczyć 1 μg plazmidowego DNA wtNef-GFP i 100 ng peptydów typu dzikiego pochodzących z domeny SMR lub peptydów zawierających alaninową substytucję poszczególnych aminokwasów w motywie SMR, do końcowej objętości 100 μl za pomocą 1X PBS.
    2. Rozcieńczyć 6 μl odczynnika rydwanu w stosunku 1:10 do końcowej objętości 100 μl sterylną wodą i połączyć z rozcieńczoną mieszaniną DNA-peptyd
      3. .
    3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić utworzenie kompleksu rydwan/peptyd DNA.
    4. Osad 3 x 105 komórek Jurkat przez odwirowanie przy 600 x g przez 5 min.
    5. Umyj komórki dwukrotnie 1X PBS i ponownie zawieś w kompleksie rydwan/peptyd DNA.
    6. Dodać 400 μl pożywki RPMI 1640 bez surowicy do zawiesiny i inkubować komórki na płytkach hodowlanych w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    7. Dodać 1 ml świeżej pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS do każdej płytki i inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.
    8. Zbierz komórki i określ wydajność transfekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
  2. Test inhibicji peptydów z czytnika płytki fluorescencyjnej wydzielania Nef-GFP
    1. Zebrać bezkomórkowe kondycjonowane podłoża z pobranych komórek i przenieść 100 μl do indywidualnych dołków 96-dołkowej czarnej płytki do mikromiareczkowania.
    2. Zmierz fluorescencję GFP w pożywce na fluorymetrze Tecan GENEios o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 515 nm we względnych jednostkach fluorescencyjnych.
    3. Ustaw poziom fluorescencji GFP w grupie kontrolnej (pożywki z komórek współtransfekowanych Nef-GFP i zaszyfrowanym peptydem) na 100%.
    4. Porównaj to z poziomem fluorescencji GFP w pożywkach z komórek transfekowanych różnymi peptydami SMR, aby określić zmiany w wydzielaniu Nef-GFP.

I.3. Izolowanie partnerów wiążących motywy za pomocą peptydów jako przynęty

  1. Koimmunoprecypitacja peptydami SMR
    1. Hodować komórki Jurkata w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% FBS w temperaturze 37 °C w kolbie do hodowli tkankowych T-75, a komórki osadkowe przez wirowanie w temperaturze 1 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Określić wydajność transfekcji, umieszczając płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym, uchwycić obrazy, a następnie policzyć całkowite i oznakowane komórki oraz określić procent znakowanych komórek.
    2. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml 1X PBS i przenieść go do 1,5 ml probówki Eppendorfa. Mikrowirówka przy 1 000 x g przez 1 min. Zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy α-FLAG, delikatnie pipetując. Bufor do lizy: Wymieszaj 50 mM Tris•HCl pH 7,4, 150 mM chlorku sodu [NaCl], 1 mM EDTA i 1% Triton X-100 z 1 mM fluorkiem fenylometylosulfonylu [PMSF] i 10 μl/ml koktajlu inhibitorów proteazy do stosowania z ekstraktami komórek i tkanek ssaków [; Sigma]. Zrób bezpośrednio przed użyciem.
    3. Różnicowo odwirować zawiesiny w ilości 2 000 x g przez 5 minut i przy 13 000 x g przez 10 minut, aby odpowiednio osadzać resztki komórek i DNA. Zebrać supernatant (zwany dalej "lizatem").
    4. Dodać 1 mg białka lizatu i 1 μg peptydu SMRwt lub SMRmut do 20 μl żelu anty-FLAG M2 Affinity Gel (zwanego dalej "żywicą"; Sigma). Zauważ, że zarówno SMRwt, jak i SMRmut użyte tutaj mają sekwencję znaczników FLAG osadzoną w peptydach. Doprowadzić mieszaninę do końcowej objętości 1 ml w buforze Co-IP (α-FLAG Bufor do lizy minus PMSF i). Inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C przez noc, obracając się od końca do końca. Jako kontrolę ujemną inkubować lizat z żywicą pod nieobecność któregokolwiek z peptydów.
    5. Osadzać żywicę przez mikrowirowanie w temperaturze 5 000 - 8 000 x g przez 30 sekund. Pozostawić żywicę do osiadania przez 2 minuty przed przystąpieniem do próbki, a następnie odessać supernatant. Usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety z wąskim końcem lub strzykawki Hamiltona, uważając, aby nie przenieść żywicy. Końcówki do pipet z wąskimi końcami można wykonać za pomocą kleszczyków, aby przycisnąć otwór plastikowej końcówki do pipety, aż zostanie częściowo zamknięta. Umyj żywicę czterokrotnie 500 μl buforu do przemywania (50 mM Tris•HCl pH 7,4 i 150 mM NaCl). Usunąć związane białka komórkowe za pomocą 15 μg peptydu 3X FLAG (Sigma) w 50 μl buforu do przemywania i inkubować na rockerze/wytrząsarce przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Zagęścić eluaty przez wytrącanie acetonu, a następnie gotować w buforze do próbek Laemmli (Bio-Rad). Oddziel białka za pomocą SDS-PAGE na 4-20% prefabrykowanym żelu Tris-HCl Criterion (Bio-Rad). Zabarwić żel środkiem Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad). Uwaga: w przypadku eksperymentów identyfikacyjnych spektrometrii mas (Rysunek 4A), każdy warunek (Co-IP z SMRwt, SMRmut lub bez peptydu) przeprowadzono w kwadransie, a eluaty ze wszystkich czterech kontrprób połączono przed wytrąceniem acetonu, co daje łącznie 4 mg całkowitego wkładu/warunku białka).
  2. Koimmunoprecypitacja białkiem Nef-GFP
    1. Wymieszaj 50 μl kulek magnetycznych Dynabeads Protein G (Invitrogen) z 2 μg mysiego monoklonalnego anty-GFP w 1 ml 1X PBS z 0,02% Tween 20 (PBS-T). Inkubować mieszaninę obracając się od końca do końca w 1,5 ml probówce Eppendorfa przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    2. Oddziel kulki od buforu, umieszczając probówkę na 1,5-mililitrowym stojaku do separacji magnetycznej MagnaSphere Technology (Promega Corp., Madison, WI), umożliwiając magnetyczne ściąganie, a następnie usunięcie supernatantu. Umyj kulki pokryte powłoką anty-GFP 1 ml PBS-T, delikatnie pipetując.
    3. Liza Nef-GFP transfekowała komórki Jurkata 1 ml buforu 1X RIPA+ przez delikatne pipetowanie i inkubację przez 15 minut na lodzie. Bufor RIPA+: 10X RIPA Lysis Buffer, pH 7,4 [Millipore, Bedford, MA] rozcieńczony w stosunku 1:10 w sterylnej wodzie, 0,02% azydku sodu [Sigma] i 0,1% dodecylosiarczanu sodu [SDS], z 1 mM PMSF i 10 μl/ml dodanymi bezpośrednio przed użyciem.
    4. Osadzać resztki komórek przez mikrowirowanie w temperaturze 2 000 x g przez 10 minut. Zebrać supernatant (zwany dalej "lizatem").
    5. Dodać 1 mg białka lizatu do kulek pokrytych powłoką anty-GFP, doprowadzić końcową objętość do 1 ml za pomocą buforu 1X RIPA+ i inkubować mieszaninę z rotacją od końca do końca przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Uwaga: W przypadku badań konkurencji peptydów, 1 mg białka lizatu może być wstępnie inkubowany z 2 μg peptydu SMRwt lub SMRmut w 1 ml buforu 1X RIPA+, przed dodaniem do kulek pokrytych powłoką anty-GFP.
    6. Przemyć kulki przez ponowne zawieszenie w 1 ml buforu do przemywania (50 mM Tris•HCl pH 7,4, 150 mM NaCl i 0,1% Tween 20). Inkubować z rotacją od końca do końca przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Oddzielić kulki od prania za pomocą magnetycznego stojaka separacyjnego. Umyj kulki po raz drugi i trzeci płuczącymi zawierającymi odpowiednio 250 mM i 300 mM NaCl.
    7. Ponownie zawiesić kulki w 200 μl PBS, przenieść mieszaninę do czystej probówki i oddzielić kulki od prania na stojaku magnetycznym. Gotować kulki w 50 μl buforu do próbek Laemmliego przez 5 minut w temperaturze 95 °C, pozostawić mieszaninę do ostygnięcia przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić mieszaninę na stojaku magnetycznym w celu oddzielenia i zebrać supernatanty ("eluaty").
    8. Oddzielić białka eluatu za pomocą SDS-PAGE na 8-16% prefabrykowanym żelu Tris-HCl Criterion.
  3. Spektrometria mas
    1. Wytnij interesujące pasma białkowe z żeli barwionych Coomassie.
    2. Zredukować próbki w 10 mM 1,4-ditiotreitolu (DTT) przez 45 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Alkilować próbki w 55 mM jodoacetamidem przez 45 minut w temperaturze 25 °C.
    4. Próbki należy roztwarzać przez noc trypsyną do sekwencjonowania (Promega) w temperaturze 37 °C.
    5. Odsolić peptydy próbki za pomocą C-18 ZipTip (Millipore). Wymieszaj peptydy próbki z matrycą alfa-CHC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) i umieść je na ramce docelowej MTP III (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA).
    6. Wykonaj analizę spektrometrii mas metodą desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą tandemową (MALDI-TOF/TOF) przy użyciu spektrometrii mas Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF.
    7. Porównaj dane MS/MS z nienadmiarowymi bazami danych NCBI i Swiss-Prot przy użyciu algorytmu Mascot (www.matrixscience.com).
  4. Analiza immunoblot
    1. Oddzielić próbki białek za pomocą SDS-PAGE na 4-20% lub 8-16% żelach prefabrykowanych Tris-HCl Criterion (Bio-Rad). Przenieś pasma elektroforetycznie na membranę nitrocelulozową.
    2. Umyj membranę w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Tris (TBS; Bio-Rad) przez 5 min. Blokuj z 5% beztłuszczowym mlekiem w TTBS (TBS z 0,1% Tween 20) przez 1 godzinę, wstrząsając w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować błonę do immunoblottingu przy użyciu specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego w 5% mleku beztłuszczowym, wstrząsając w temperaturze 4 °C przez noc. Myć w TTBS przez 20 minut, a następnie podawać drugorzędowe przeciwciało IgG (H+L) sprzężone z HRP w 5% mleku beztłuszczowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Prać w TTBS przez 30-60 min.
    4. Wykryj prążki białkowe za pomocą odczynnika Western Blotting Luminol (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Wystaw filtr na kliszę fotograficzną. Uwaga: W niektórych eksperymentach używano odczynnika do strippingu do usuwania błony (Pierce, Rockford, IL), a następnie hybrydyzacji z różnymi przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi.
    5. Zeskanuj filmy rentgenowskie do programu Adobe Photoshop 5.0.2. Wykonaj analizę densytometryczną za pomocą oprogramowania ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

II. Zastosowanie hamowania przeciwciał w analizie funkcjonalnej

II.1. Kotransfekcja przeciwciał przy użyciu zestawu odczynników do dostarczania białek rydwanu

  1. Na mieszaninę reakcji transfekcji rozcieńczyć 1 μg plazmidowego DNA wtNef-GFP i 1 μg przeciwciała anty-mortalinowego lub przeciwciała anty-α-tubuliny, do końcowej objętości 100 μl za pomocą 1X PBS. Uwaga: Wcześniej stwierdzono, że kotransfekcja przeciwciała anty-α-tubuliny nie ma wykrywalnego wpływu na wydzielanie exNef, a zatem służy jako skuteczna kontrola negatywna w tych eksperymentach.
  2. Rozcieńczyć 6 μl nierozcieńczonego odczynnika Chariot do końcowej objętości 100 μl sterylną wodą i połączyć z rozcieńczoną mieszaniną DNA i przeciwciał.
  3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić utworzenie kompleksu rydwan/DNA-przeciwciało.
  4. Osad 3 x 105 komórek Jurkat przez odwirowanie przy 600 x g przez 5 min.
  5. Umyj komórki dwukrotnie 1X PBS i ponownie zawieś w kompleksie rydwan/przeciwciało DNA.
  6. Dodać 400 μl pożywki RPMI 1640 bez surowicy do zawiesiny i inkubować komórki na płytkach hodowlanych w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  7. Dodać 1 ml świeżej pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS do każdej płytki i inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.

II.2. Test na inhibicję przeciwciał na czytniku płytki fluorescencyjnej Nef-GFP

  1. Zebrać bezkomórkowe kondycjonowane podłoża z pobranych komórek i przenieść 100 μl do indywidualnych dołków 96-dołkowej czarnej płytki do mikromiareczkowania.
  2. Zmierz fluorescencję GFP w pożywce na fluorymetrze Tecan GENEios o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 515 nm we względnych jednostkach fluorescencyjnych.
  3. Ustaw poziom fluorescencji GFP w grupie kontrolnej (pożywki z komórek współtransfekowanych Nef-GFP i przeciwciałem anty-α-tubuliny) na 100%.
  4. Porównaj to z poziomem fluorescencji GFP w pożywkach z komórek współtransfekowanych przeciwciałem anty-mortalinowym, aby określić zmiany w wydzielaniu Nef-GFP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mapowanie biologicznie funkcjonalnych motywów za pomocą peptydów. Zidentyfikowano dwa regiony białek Nef, które indukują apoptozę. Zaobserwowano apoptozę napędzaną peptydami (ryc. 2), zaczynając od peptydu N50 (aa30-50), osiągając szczyt na N60 (aa40-60) i N70 (aa50-70) i zmniejszając się do poziomów tła przy peptydzie N100 (aa80-100). Główny pik Motif 1 (M1), koncentrujący się na aa50-60, indukuje >80% poziomów apoptozy białka Nef o pełnej długości. Drugi, mniejszy pik apoptotyczny z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw zdolności Nef do manipulowania szlakiem transportu egzosomalnego będzie przydatne w inżynierii nowych inhibitorów wydzielania exNef. Hamowanie wydzielania exNef powinno zmniejszyć wyczerpanie limfocytów T CD4 i CIA, które napędzają patogenezę HIV/AIDS. W tym celu opracowaliśmy szereg nowatorskich odczynników i metodologii, które pozwoliły nam przeanalizować genetykę wydzielania exNef i rozpocząć określanie zaangażowanych białek komórkowych. Podejście to doprowadziło również do o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIH/NIGMS/MBRS (Grant 58268), NIH/NCRR/RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Research Alliance finansujące grant GRA. ODKURZACZ08. W, NIH/NIAID/NRSA grant F31AI091484, Emory CFAR grant P30 A1050409. Badanie to zostało przeprowadzone w obiekcie zbudowanym przy wsparciu grantu na poprawę infrastruktury badawczej #C06 RR18386 z NIH/NCRR. Komórki Jurkat, zestaw 20 peptydów HIV-1 Nef, a także królicza surowica anty-HIV-1 Nef uzyskano z NIH AIDS Research & Reference Reagent Program (Rockville, MD).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw peptydów 20mer z nakładaniem się 10 aminokwasówodczynników badawczych i referencyjnych NIH AIDS4641
Test TUNELRoche11 684 809 910
Odczynnik do dostarczania białka rydwanuAktywny motyw30100
Fluorymetr Tecan GENEios(Tecan Group, Szwajcaria)
96-dołkowa płytka do mikromiareczkowaniaCorning3792
anti-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
Dynabeads Białko G Koraliki magnetyczne Invitrogen100.03D
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (dwupozycyjny)Promega Corp., Madison, WIZ5332
C-18 ZipTip MilliporeZTC18S096Żywica C18 (0,6 μ l lub 0,2 μ l objętości łóżek). Oligonukleotydy lub małe (< 50 kDa) białka/ peptydy w roztworze wodnym
MALDI TOF/TOFBruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF
Program

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen? Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).
  2. Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).
  3. Smith, S. M. The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all. Retrovirology. 3 (1), 60(2006).
  4. Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).
  5. Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).
  6. Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).
  7. Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).
  8. Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).
  9. Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).
  10. Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).
  11. Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
  12. Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).
  13. Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).
  14. Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).
  15. James, C. O., Huang, M. -B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).
  16. Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).
  17. Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).
  18. Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release. J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).
  19. Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).
  20. Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo. J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Peptide ScanningApoptosis AssayCo immunoprecipitationFluorescent MicroscopyFlow CytometryHIV 1 NefSecretion Modification RegionExosome SecretionMortalin BindingPeptide Inhibitors

Powiązane artykuły