Method Article

Identyfikacja motywów funkcjonalnych i ich partnerów wiążących w oparciu o peptydy

DOI:

10.3791/50362

⸱

June 30th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Biochemistry, & Immunology, Morehouse School of Medicine, 2Institute for Systems Biology, 3Advanced Medical & Dental Institute, Universiti Sains Malaysia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano techniki analizowania mechanizmów leżących u podstaw wydzielania HIV-1 Nef w egzosomach. Specyficzne krótkie peptydy pochodzące z transfekcji Nef i białka wykorzystano do określenia struktury, funkcji i partnerów wiążących region modyfikacji wydzielania Nef. Procedury te mają ogólne znaczenie w wielu badaniach mechanistycznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specyficzne krótkie peptydy pochodzące z motywów występujących w białkach o pełnej długości, w naszym przypadku HIV-1 Nef, nie tylko zachowują swoją funkcję biologiczną, ale mogą również kompetycyjnie hamować funkcję białka o pełnej długości. Zestaw 20 peptydów skanujących Nef o długości 20 aminokwasów, z których każdy nakładał się na 10 aminokwasów sąsiada, został wykorzystany do identyfikacji motywów w Nef odpowiedzialnych za indukcję apoptozy. Peptydy zawierające te motywy apoptotyczne indukowały apoptozę na poziomach porównywalnych z białkiem Nef o pełnej długości. Drugi peptyd, pochodzący z regionu modyfikacji wydzielania (SMR) Nef, zachował zdolność do interakcji z białkami komórkowymi zaangażowanymi w wydzielanie Nef w egzosomach (exNef). Ten peptyd SMRwt został wykorzystany jako białko "przynęty" w eksperymentach z koimmunoprecypitacją w celu wyizolowania białek komórkowych, które wiążą się specyficznie z motywem SMR Nef. Transfekcję białek i hamowanie przeciwciał wykorzystano w celu fizycznego zakłócenia interakcji między Nef a mortaliną, jednym z izolowanych białek wiążących SMR, a efekt zmierzono za pomocą fluorescencyjnego testu wydzielania exNef. Zdolność peptydu SMRwt do konkurowania z pełnowymiarowym Nef dla białek komórkowych wiążących motyw SMR, czyni go pierwszym inhibitorem wydzielania exNef. Tak więc, stosując opisane tutaj techniki, które wykorzystują unikalne właściwości specyficznych krótkich peptydów pochodzących z motywów znajdujących się w białkach o pełnej długości, można przyspieszyć identyfikację funkcjonalnych motywów w białkach i rozwój opartych na peptydach inhibitorów funkcji patogennych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z pojawieniem się terapii antyretrowirusowej, epidemia AIDS w świecie zachodnim została spowolniona, ale nie ograniczona, a rozprzestrzenianie się HIV nadal stanowi poważne obciążenie zdrowotne na całym świecie. Z wyjątkiem marginalnie skutecznego tajlandzkiego badania klinicznego RV144, szczepionki przeciwko HIV jak dotąd nie chronią przed zakażeniem. W związku z tym badania nad dodatkowymi, potencjalnymi celami terapeutycznymi są nadal uzasadnione.

Wraz z wyczerpaniem limfocytów T CD4, cechą charakterystyczną zakażenia wirusem HIV jest uporczywa uogólniona aktywacja immunologiczna. Ta przewlekła aktywacja immunologiczna (CIA) prowadz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I. Użycie krótkich peptydów w analizie biologicznej

I.1. Mapowanie biologicznie funkcjonalnych motywów za pomocą peptydów

  1. Leczenie komórek peptydami skanującymi Nef
    1. Zaopatrz się w zestaw peptydów skanujących obszar zainteresowania. Do naszych eksperymentów uzyskano 20-merowe peptydy, z 10 nakładającymi się na siebie aminokwasami, obejmujące całe białko Nef HIV-1 (205 aa), z programu AIDS Reagent Program. Peptydy są oznaczane indywidualnie w następujący sposób:
    2. Dodać 10 ng/ml peptydu do pożywki do hodowli komórkowej.
    3. Dodać 10 ml pożywki hodowlanej na płytkę do kultur komórkowych Jurkat.
    4. I....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mapowanie biologicznie funkcjonalnych motywów za pomocą peptydów. Zidentyfikowano dwa regiony białek Nef, które indukują apoptozę. Zaobserwowano apoptozę napędzaną peptydami (ryc. 2), zaczynając od peptydu N50 (aa30-50), osiągając szczyt na N60 (aa40-60) i N70 (aa50-70) i zmniejszając się do poziomów tła przy peptydzie N100 (aa80-100). Główny pik Motif 1 (M1), koncentrujący się na aa50-60, indukuje >80% poziomów apoptozy białka Nef o pełnej długości. Drugi, mniejszy pik apoptotyczny z.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw zdolności Nef do manipulowania szlakiem transportu egzosomalnego będzie przydatne w inżynierii nowych inhibitorów wydzielania exNef. Hamowanie wydzielania exNef powinno zmniejszyć wyczerpanie limfocytów T CD4 i CIA, które napędzają patogenezę HIV/AIDS. W tym celu opracowaliśmy szereg nowatorskich odczynników i metodologii, które pozwoliły nam przeanalizować genetykę wydzielania exNef i rozpocząć określanie zaangażowanych białek komórkowych. Podejście to doprowadziło również do o.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIH/NIGMS/MBRS (Grant 58268), NIH/NCRR/RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Research Alliance finansujące grant GRA. ODKURZACZ08. W, NIH/NIAID/NRSA grant F31AI091484, Emory CFAR grant P30 A1050409. Badanie to zostało przeprowadzone w obiekcie zbudowanym przy wsparciu grantu na poprawę infrastruktury badawczej #C06 RR18386 z NIH/NCRR. Komórki Jurkat, zestaw 20 peptydów HIV-1 Nef, a także królicza surowica anty-HIV-1 Nef uzyskano z NIH AIDS Research & Reference Reagent Program (Rockville, MD).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zestaw peptydów 20mer z nakładaniem się 10 aminokwasówodczynników badawczych i referencyjnych NIH AIDS4641
Test TUNELRoche11 684 809 910
Odczynnik do dostarczania białka rydwanuAktywny motyw30100
Fluorymetr Tecan GENEios(Tecan Group, Szwajcaria)
96-dołkowa płytka do mikromiareczkowaniaCorning3792
anti-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
Dynabeads Białko G Koraliki magnetyczne Invitrogen100.03D
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (dwupozycyjny)Promega Corp., Madison, WIZ5332
C-18 ZipTip MilliporeZTC18S096Żywica C18 (0,6 μ l lub 0,2 μ l objętości łóżek). Oligonukleotydy lub małe (< 50 kDa) białka/ peptydy w roztworze wodnym
MALDI TOF/TOFBruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF
Program

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen? Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).
  2. Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).
  3. Smith, S. M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Peptide ScanningApoptosis AssayCo immunoprecipitationFluorescent MicroscopyFlow CytometryHIV 1 NefSecretion Modification RegionExosome SecretionMortalin BindingPeptide Inhibitors

Related Articles