Artykuł metodologiczny

Analiza kokulturowa interakcji białek zewnątrzkomórkowych wpływających na wydzielanie insuliny przez komórki beta trzustki

DOI:

10.3791/50365

⸱

15 czerwca 2013

 ,  , 
1Pediatric Diabetes Research Center, University of California, San Diego, 2Janssen Research & Development, 3Department of Medicine, University of California, San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkomórkowe interakcje białkowe są ważnymi determinantami funkcji komórek beta trzustki. Szczegółowo opisano tutaj metodę - zaadaptowaną z modelu synaptogenezy - do badania, w jaki sposób określone białka transbłonowe wpływają na wydzielanie insuliny. Transfekowane komórki HEK293 wyrażają białka będące przedmiotem zainteresowania; Komórki beta nie muszą być transfekowane ani w inny sposób bezpośrednio zaburzone.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje między białkami na powierzchni komórki pomagają koordynować funkcje sąsiednich komórek. Komórki beta trzustki są skupione razem w wyspach trzustkowych i działają w skoordynowany sposób w celu utrzymania homeostazy glukozy. Staje się coraz bardziej oczywiste, że interakcje między białkami transbłonowymi na powierzchni sąsiednich komórek beta są ważnymi determinantami funkcji komórek beta.

Wyjaśnienie ról poszczególnych interakcji międzykomórkowych poprzez badania knockdown, knockout lub nadekspresji w hodowanych komórkach beta lub in vivo wymaga bezpośrednich zakłóceń ekspresji mRNA i białek, potencjalnie wpływając na zdrowie i/lub funkcjonowanie komórek beta w sposób, który mógłby zakłócić analizy efektów określonych interakcji. Podejścia te zmieniają również poziomy domen wewnątrzkomórkowych docelowych białek i mogą zapobiegać skutkom interakcji między białkami w tej samej błonie komórkowej, aby można je było odróżnić od skutków interakcji międzykomórkowych.

Tutaj przedstawiono metodę określania wpływu określonych interakcji międzykomórkowych na zdolność wydzielania insuliny i responsywność komórek beta. Metoda ta ma zastosowanie do linii komórek beta, takich jak komórki INS-1, oraz do zdysocjowanych pierwotnych komórek beta. Opiera się na modelach kokultury opracowanych przez neurobiologów, którzy odkryli, że ekspozycja hodowanych neuronów na określone białka neuronalne ulegające ekspresji na warstwach komórkowych HEK293 (lub COS) zidentyfikowała białka ważne dla tworzenia synaps. Biorąc pod uwagę podobieństwa między maszynerią wydzielniczą synaps neuronalnych i komórek beta, doszliśmy do wniosku, że dojrzewanie funkcjonalne komórek beta może być napędzane przez podobne interakcje międzykomórkowe. Opracowaliśmy system, w którym komórki beta są hodowane na warstwie komórek HEK293 wykazujących ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania. W tym modelu cytoplazma komórki beta pozostaje nietknięta, podczas gdy zewnątrzkomórkowe interakcje białko-białko są manipulowane. Chociaż skupiamy się tutaj przede wszystkim na badaniach nad wydzielaniem insuliny stymulowanym przez glukozę, można analizować inne procesy; na przykład zmiany w ekspresji genów określone za pomocą immunoblottingu lub qPCR.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj metodę ułatwiającą badanie, jak zewnątrzkomórkowe domeny określonych białek transbłonowych wpływają na wydzielanie insuliny. Metoda bada wpływ interakcji białka będącego przedmiotem zainteresowania z białkami (lub ewentualnie innymi cząsteczkami) na powierzchni komórek beta trzustki. Metoda pozwala na zbadanie, w jaki sposób białka powierzchniowe komórek ulegające ekspresji przez komórki beta lub przez inne sąsiednie komórki (np. komórki śródbłonka, neurony, komórki alfa trzustki) wpływają na funkcję komórek beta poprzez interakcje międzykomórkowe (tj. poprzez interakcje z partnerami interakcji na powierzchni sąsiednich komórek beta).

Komórkowa błona plazmatyczna zawiera złożony zestaw strukturalnych i funkcjonalnych białek służących jako pomosty do środowiska zewnątrzkomórkowego. Poprzez tworzenie połączeń międzykomórkowych lub inicjację zdarzeń sygnalizacyjnych z tworzywa sztucznego, interakcje między białkami na powierzchni komórki mogą pomóc w koordynowaniu funkcji sąsiednich komórek. Komórki beta trzustki są zgrupowane razem w wyspach trzustkowych i działają w skoordynowany sposób w celu utrzymania homeostazy glukozy1. Jak wykazano na przykład na przykładzie znaczenia zewnątrzkomórkowych interakcji EphA-ephrinA i neuroliginy-2 w regulacji wydzielania insuliny stymulowanego przez glukozę, staje się coraz bardziej jasne, że zwiększona wiedza na temat interakcji zewnątrzkomórkowych zachodzących między białkami na powierzchni sąsiednich komórek beta będzie miała ogromne znaczenie dla uzyskania pełnego zrozumienia wydzielania insuliny. Dojrzewanie funkcjonalne komórek beta i utrzymanie homeostazy glukozy1-3. Celem opisanej tutaj metody jest umożliwienie zbadania wpływu na funkcję komórek beta interakcji transkomórkowych obejmujących określone białka transbłonowe lub w inny sposób związane z powierzchnią komórki. Poprzez wspólną hodowlę komórek beta z komórkami HEK293 transfekowanymi różnymi konstruktami ekspresyjnymi, można skutecznie badać wpływ różnych białek powierzchniowych komórek lub ich zmutowanych wariantów na funkcję komórek beta. Odbywa się to bez konieczności transfekcji samych komórek beta.

Wyjaśnienie ról poszczególnych interakcji międzykomórkowych poprzez badania knockdown, knockout lub nadekspresji w hodowanych komórkach beta lub in vivo wymaga bezpośrednich zakłóceń ekspresji mRNA i białek komórek beta, potencjalnie wpływając na zdrowie i/lub funkcjonowanie komórek beta w sposób, który mógłby zakłócić analizy efektów określonych interakcji zewnątrzkomórkowych. Podejścia te zmieniają również poziomy domen wewnątrzkomórkowych docelowych białek, a ponadto nie pozwalają na odróżnienie skutków wynikających z interakcji między białkami na tej samej komórce lub w tej samej komórce od skutków interakcji międzykomórkowych. W tym miejscu opisano metodę określania wpływu określonych interakcji międzykomórkowych na zdolność wydzielania insuliny i reaktywność komórek beta. Metoda ta ma zastosowanie do linii komórek beta wydzielających insulinę, takich jak komórki INS-14, oraz do zdysocjowanych pierwotnych komórek beta gryzoni lub ludzkich. Opiera się na modelach kokultury opracowanych przez neurobiologów, którzy odkryli, że narażenie hodowanych neuronów na określone białka neuronalne wyrażane na warstwach komórkowych HEK293 (lub COS) może zidentyfikować białka, które napędzają tworzenie synaps5,6. Biorąc pod uwagę podobieństwa między maszynerią wydzielniczą synaps neuronalnych i komórek beta, doszliśmy do wniosku, że funkcja komórek beta i dojrzewanie funkcjonalne mogą być napędzane przez podobne interakcje międzykomórkowe7-9. Aby zbadać te interakcje, opracowaliśmy opisany tutaj system, w którym komórki beta są hodowane na warstwie komórek HEK293 wyrażających interesujące białko10. System ten pozwala cytoplazmie komórek beta pozostać nietkniętą, podczas gdy zewnątrzkomórkowe interakcje białko-białko są manipulowane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transfekcja warstwy HEK293

  1. Przygotować pożywkę komórkową HEK293, dodając do 500 ml butelek DMEM (z 4,5 g/ml glukozy i czerwieni fenolowej oraz bez glutaminy): 50 ml FBS, 5 ml 100X roztworu penicyliny/streptomycyny, 5 ml 100x roztworu L-glutaminy i 500 μl amfoterycyny B.
  2. Umieść komórki HEK293 na płytce 24-dołkowej, używając 0,5 ml pożywki HEK293 na dołek. Upewnij się, że komórki są równomiernie rozłożone na dnie płytki.
  3. Gdy komórki HEK293 osiągną 100% zbieżności, transfekuj 0,8 μg plazmidu kodującego interesujące białko (wstawione do wektora ekspresyjnego ssaków) i 2 μl Lipofectaminy 2000 zgodnie z protokołem Lipofectamine. Zdecydowaliśmy się na użycie szkieletu pcDNA 3.3 przeznaczonego do ekspresji w komórkach ssaków.
  4. Opcjonalnie, po 6 godzinach inkubacji, wymienić pożywki do transfekcji opisane w protokole Lipofectamine na normalne podłoża HEK293.
  5. Aby ocenić ekspresję transfekowanego białka, podzbiór baseników z transfekowanej kultury tkankowej można wykorzystać do immunofluorescencyjnego wykrywania ekspresji białka lub do analizy ekspresji białka metodą western blot przy użyciu standardowych technik.

2. Opcjonalna fiksacja komórek HEK293 wyrażających transfekowane białko

Transfekowane komórki HEK293 mogą być delikatnie utrwalone w celu ułatwienia kokultury w podłożach, które mogą być szkodliwe dla żywych komórek HEK293 (np. krok 3.9 poniżej) lub w celu umożliwienia efektywnego przygotowania płytek do kilku eksperymentów naraz (zobacz też Dyskusja).

  1. Przeprowadzenie badań pilotażowych w celu określenia przebiegu czasowego ekspresji białka w komórkach HEK293.
  2. Po transfekcji warstwy komórkowej HEK293 należy odessać pożywkę z komórek w punkcie czasowym po transfekcji związanym z najwyższym poziomem ekspresji. Jeśli nastąpi to w ciągu pierwszych 24 godzin, nie odsysaj do 24 godzin po transfekcji.
  3. Delikatnie przemyj komórki HEK293 D-PBS, a następnie dodaj 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) i inkubuj w temperaturze RT przez 30 minut. (Aby uzyskać 4% roztwór PFA, zacznij od 16% roztworu w 1X PBS i rozcieńcz 1:4 1X PBS.)
  4. Używając sterylnego PBS, delikatnie umyć komórki 3 razy i inkubować w PBS O/N w temperaturze 4 °C.
  5. Umyć komórki 3 razy sterylnym PBS, następnie dodać PBS i pozostawić w temperaturze 4 °C do momentu uzyskania potrzebnej (maksymalny czas przechowywania może się różnić w zależności od wyrażonego białka. Komórki HEK293 transfekowane w celu ekspresji izoform neuroliginy przechowujemy do 2 tygodni bez istotnych zmian w obserwowanym wpływie na wydzielanie insuliny).

3. Współhodowla komórek beta INS-1 z komórkami HEK293

  1. Przygotuj pożywkę INS-1, dodając do 500 ml RPMI 1640 (z glukozą i czerwienią fenolową oraz bez glutaminy): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicylina/streptomycyna, 5 ml 100X roztwór L-glutaminy, 5 ml pirogronianu sodu, 500 μl amfoterycyny B, 500 μl beta-merkaptoetanolu (jest to prawie identyczne z podłożem zwykle stosowanym do pierwotnej hodowli wysp trzustkowych, z wyjątkiem dodania beta-merkaptoetanolu).
  2. Za pomocą środka do usuwania komórek (lub innego nieenzymatycznego środka do usuwania komórek) zbierz komórki INS-1 z około 70-80% zbieżnością z dna kolby hodowlanej T75. Każda kolba dostarczy mniej więcej wystarczającą ilość komórek na 48 dołków.
  3. Po odwirowaniu komórek w wirówce przez 3 minuty przy 1 200 obr./min, ponownie zawiesić w mieszance 50/50 pożywek INS-1 i HEK. W przypadku 70-80% zlewającej się kolby komórek INS-1 należy ponownie zawiesić w około 25 ml zmieszanych pożywek.
  4. W przypadku używania komórek HEK293, które zostały utrwalone w paraformaldehydzie, a nie w żywych komórkach HEK293, ponownie zawieś komórki INS-1 w 100% pożywce INS-1, a nie w pożywce mieszanej.
  5. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml usunąć komórki z osadu, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.
  6. Odessać, aby usunąć pożywkę z komórek HEK293.
  7. Za pomocą pipety p1000 delikatnie dodaj 500 μl zawiesiny komórek INS-1 na warstwę komórek HEK wzdłuż boków studzienki. Po każdych 6 dołkach użyj pipety o pojemności 10 ml, aby ponownie zawiesić komórki INS-1, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek. Ogólny schemat konfiguracji kokultury przedstawiono na rysunku 1.
  8. Inkubuj komórki przez 24-48 godzin, w zależności od protokołu eksperymentalnego.
  9. Jeśli wymagany jest okres kohodowli dłuższy niż 48 godzin, należy wykonać opcjonalne czynności opisane w sekcji 2 powyżej, aby utrwalić komórki HEK293.
  10. W przypadku stosowania pierwotnych zdysocjowanych wysepek gryzoni lub ludzkich wysepek [np. patrz wcześniejsze protokoły w JoVE11-15], należy upewnić się, że zamiast pożywki INS-1 stosuje się odpowiednie podłoża, takie jak RPMI z 5 ml wstrzykiwacza/paciorkowca, 5 ml L-Glut, 0,5 ml amfoterycyny-B. Chociaż można użyć zdysocjowanych komórek wysp trzustkowych na płytce 24-dołkowej, w praktyce, ze względu na dużą liczbę potencjalnie potrzebnych wysp trzustkowych, zaleca się rozważenie zmniejszenia do płytki 48-dołkowej (co wymaga mniejszej liczby komórek wysp trzustkowych na studzienkę). Na 48-dołkową płytkę dodaj około 100 wysepek zdysocjowanych komórek na płytkę, aby rozpocząć. W zależności od skuteczności dysocjacji i zastosowanej metody, może być wymagana mniejsza liczba wysepek.

4. Wydzielanie insuliny stymulowane glukozą

  1. Preinkubować komórki w 250 μl 2,5 mM glukozy w KRB (bufor wodorowęglanowy Krebsa-Ringera) przez minimum 1 godzinę. Aby przeprowadzić preinkubację, usuń pożywkę kokulturową i natychmiast zastąp ją KRB. Ta wymiana powinna być wykonywana pojedynczo, aby zminimalizować narażenie komórek INS-1 na tlen środowiskowy. Zasysać jedną ręką, a drugą pipetować KRB o niskiej (2,5 mM) glikemii.
  2. Wymieniać preinkubację KRB na 250 μl 2,5 mM lub 20 mM glukozy w buforze KRB po jednym dołku na raz.
  3. Jeśli jest to właściwe dla konkretnego eksperymentu, można dodać dodatkowe leki wydzielające, takie jak 100 μM IBMX, aby wytworzyć silniejszą stymulowaną odpowiedź wydzielania insuliny. W szczególności zdysocjowane pierwotne komórki beta wysp trzustkowych słabo reagują na samo zwiększone stężenie glukozy, dlatego w tym przypadku należy szczególnie rozważyć dodanie IBMX lub innych substancji wydzielających16,17 .
  4. Po 1 godzinie inkubacji przenieś pożywkę do probówek do mikrofuge i wiruj 1 500 x g przez 5 minut.
  5. Usunąć 200 μl supernatantu i użyć go do analizy za pomocą insuliny RIA lub ELISA.
  6. Aby przygotować lizat komórkowy, natychmiast po usunięciu pożywki dodać do płytki 100 μl buforu do lizy komórek RIPA (150 mM NaCl, 1,0% IGEPALCA-630 lub Nonidet P-40, 0,5% deoksycholan sodu, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) z inhibitorami proteazy do płytki i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 min.
  7. Wirować lizat przez 15 minut przy 10 000 x g i usunąć 50 μl supernatantu do analizy za pomocą insuliny RIA lub ELISA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanej tutaj metody, przetestowaliśmy wpływ różnych wariantów białka neuroliginy na wydzielanie insuliny. Uzupełnia to naszą opublikowaną pracę badającą wpływ neuroliginy-2 na funkcję komórek beta10. Rycina 2, na przykład, przedstawia wyniki uzyskane z kokulturacji komórek beta INS-1 z komórkami HEK293 transfekowanymi w celu ekspresji izoformy neuroliginy określanej tutaj jako NL-X. Eksperyment ten został zaprojektowany w celu przetestowania hipotezy, że NL-X angażuje się w int...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda kokultury zapewnia skuteczny sposób określania fizjologicznego znaczenia określonych białek transbłonowych na powierzchni komórki beta, a w szczególności ich domen zewnątrzkomórkowych. Poprzez hodowlę komórek beta lub komórek insulinoma (takich jak zastosowane tutaj komórki INS-1) w kontakcie z komórkami HEK293 wyświetlającymi interesujące białko na powierzchni komórki, można zaprojektować eksperymenty w celu określenia skutków zewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko bez bezpośredniego zakłócani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health R01DK080971 oraz granty Juvenile Diabetes Research Foundation 37-2009-44. Doceniamy również wsparcie otrzymane od UCSD Pediatric Diabetes Research Center (PDRC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pcDNA 3.3 wektor/szkieletInvitrogenK830001
Lipofectamine 2000Invitrogen18324012
DMEMMediatech45001-312
Roztwór dla wstrzykiwaczy/paciorkowcówMediatech45001-652-1
Amfoterycyna BMediatech45001-808-1/30
RPMI-1640Mediatech45001-404
D-PBSMediatech45001-434
Pirogronian soduMediatech45001-710-1
2-Mercapt– thanolInvitrogen21985023
Stripperkomórkowy Mediatech45000-668
T75 KolbaBD1368065
16% ParaformaldehydMikroskopia elektronowa Sciences50980487
10x PBSMediatech45001-130
Surowica bydlęcapłodu MediatechMT35010CV
IBMXSigmaI5879-100MG
Bufor do lizy RIPASigmaR0278

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
  2. Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
  3. Jain, R., Lammert, E. Cell-cell interactions in the endocrine pancreas. Diabetes Obes. Metab. 11, Suppl 4. 159-167 (2009).
  4. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
  5. Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
  6. Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
  7. Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
  8. Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
  9. Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
  10. Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
  11. Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
  12. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125(2009).
  13. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343(2009).
  14. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J. Vis. Exp. (7), e255(2007).
  15. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096(2011).
  16. Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
  17. Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
  18. Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
  19. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
  20. Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

funkcja kom rek betaoddzia ywania transkom rkowemodel kokulturykom rki HEK293sekrecja stymulowana glukozanaliza ekspresji bia ekradioimmunometodaanaliza ekspresji gen wbia ka powierzchniowe kom rek

Powiązane artykuły