Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
U roślin kwitnących, zarodek rozwija się w odżywczej tkance - bielmie - otoczonej powłokami nasiennymi matki (lub okrywą nasienną). W związku z tym izolacja zarodków roślinnych we wczesnych stadiach (od 1 komórki do stadium kulistego) jest technicznie trudna ze względu na ich względną niedostępność. Skuteczna ręczna sekcja we wczesnych stadiach jest silnie osłabiona przez mały rozmiar młodych nasion rzodkiewnika i przyleganie zarodka do otaczających tkanek. W tym miejscu opisujemy metodę, która pozwala na skuteczną izolację młodych zarodków Arabidopsis, dając do 40 zarodków w ciągu 1 godziny do 4 godzin, w zależności od dalszej aplikacji. Zarodki są uwalniane do bufora izolacyjnego poprzez lekkie zmiażdżenie 250-750 nasion plastikowym tłuczkiem w probówce Eppendorfa. Szklana mikrokapila podłączona do standardowej pipety laboratoryjnej (za pomocą gumowej rurki) lub hydraulicznie sterowanego mikrowstrzykiwacza służy do pobierania zarodków z kropelek umieszczonych na szkiełku wielodołkowym pod mikroskopem ze światłem odwróconym. Wymagane umiejętności techniczne są proste i łatwe do przeniesienia, a podstawowa konfiguracja nie wymaga kosztownego sprzętu. Pobrane zarodki nadają się do różnych dalszych zastosowań, takich jak RT-PCR, sekwencjonowanie RNA, analizy metylacji DNA, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), barwienie immunologiczne i testy genów reporterowych.
Wprowadzenie
Zarodek kwitnących roślin jest otoczony bielmem, tkanką odżywczą pochodzącą z drugiego zapłodnienia. Zarówno zarodek, jak i bielmo są otoczone kilkoma warstwami komórkowymi okrywy nasiennej. Łącznie tkanki te tworzą nasiona, które rozwijają się wewnątrz owocu. W związku z tym analizy swoiste dla tkanek i komórek zarodków rzodkiewnika są silnie utrudnione ze względu na ich niedostępność. Niemniej jednak zarodki w późnym stadium kulistym lub późniejszym są stosunkowo dobrze podatne na ręczne rozwarstwienie za pomocą cienkich igieł wolframowych pod mikroskopem stereoskopowym lub przez wywieranie lekkiego nacisku na nasiona za pomocą kleszczy w celu ich ekstrakcj....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedura jest podsumowana na schemacie blokowym pokazanym na rysunku 1. Mikronaczynia włosowate i układ instrumentalny pokazano na rycinie 2 i rycinie 3, a typowe etapy izolacji zarodka przedstawiono na rysunku 4.
1. Przygotowanie materiału i bufora
1.1 Silikonowa powłoka mikrokapilar szklanych
- Umieść mikronaczynia włosowate w 15 ml probówce Falcon z ~5 ml Sigmacote (Sigma) i kilkakrotnie odwróć .
- Usuń roztwór, umieść probówkę Falcon zawierającą kapilary w folii aluminiowej i piecz je przez 3 godziny w temperaturze 60 °C. Przec....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Nasza procedura izolacji embrionów (Rycina 1) umożliwia wyizolowanie do 40 embrionów w ciągu 4 h, jeśli przeprowadza się przemywanie, np. w zastosowaniach molekularnych, lub w czasie krótszym niż godzina, jeśli pomija się przemywanie, np. w zastosowaniach cytologicznych. Rycina 2 przedstawia końcówki mikrokapilar wysokiej i niskiej jakości, a Rycina 3 pokazuje konfigurację urządzenia do izolacji embrionów. Rycina 4 przedstawia proces iz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowaliśmy protokół izolacji zarodków, który jest szybki, skuteczny i można go łatwo przenieść do innych laboratoriów.
Opisane tutaj urządzenie składa się z mikroskopu odwróconego, mikromanipulatora, szklanych mikrokapilarni, pionowego ściągacza filamentu i mikrowtryskiwacza (ryc. 3A). Konfiguracja jest podobna do opisanej dla izolacji pojedynczych komórek zwierzęcych do analiz transkryptomicznych 17. Z powodzeniem pracowaliśmy również z bardziej podstawową konfi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Talowi Nawy'emu i Martinowi Bayerowi za ich rady dotyczące izolacji zarodków. MTR, VG, UG i CB opracowały sprzęt do izolacji zarodków. MTR, VG i CB opracowały protokół izolacji zarodków. MTR, VG i CB ustaliły protokół, wyizolowały zarodki i wygenerowały cDNA zarodka, VG przeprowadziło PCR, MTR barwienie GUS, JJ eksperymenty FISH. Rękopis napisali MTR, VG, CG i UG. Praca ta została sfinansowana przez Uniwersytet w Zurychu, stypendium Fundacji Badawczej Roche (do MTR) oraz granty ze Szwajcarskiej Fundacji Narodowej (dla UG i CB).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODCZYNNIKI | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| Bufor pierwszej nici | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | zawarty w pakiecie Superscript II |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | zawarte w opakowaniu Indeks górny II |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Różni dostawcy będą również pracować | |
| : Kapilary cienkościenne 1,0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Probówka DNA LoBind 0,5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μ m | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5 dołków Szkiełka o średnicy 10 mm | Mikroskopia elektronowa Sciences | 63421-10 | |
| Roztwór formaldehydu | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Szkiełko Superfrost Plus Thermo | Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Glä ser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| Granulki SDS | Roth | CN30.3 | |
| Micro Potle | VWR | 431-0094 | |
| Mikrodrobne strzykawki insulinowe | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Kleszcze N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalizator Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Mikroskop odwrócony | Nikon TMS (Japonia), | ||
| mikromanipulator | Leitz | ||
| Mikomanipulator Leica Sonda LH1 do montażu na słupku | 39430101 | Leica microsystems | Inna marka również wykona pracę |
| Pionowy ściągacz do filamentów | Instrument Sutter | model P-20 | Inne modele są również odpowiednie |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalizator | Agilent Technologies | 2100 | |
| Fluorometr kubitowy | Invitrogen (technologie |
Bibliografia
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell s....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
