Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
U roślin kwitnących, zarodek rozwija się w odżywczej tkance - bielmie - otoczonej powłokami nasiennymi matki (lub okrywą nasienną). W związku z tym izolacja zarodków roślinnych we wczesnych stadiach (od 1 komórki do stadium kulistego) jest technicznie trudna ze względu na ich względną niedostępność. Skuteczna ręczna sekcja we wczesnych stadiach jest silnie osłabiona przez mały rozmiar młodych nasion rzodkiewnika i przyleganie zarodka do otaczających tkanek. W tym miejscu opisujemy metodę, która pozwala na skuteczną izolację młodych zarodków Arabidopsis, dając do 40 zarodków w ciągu 1 godziny do 4 godzin, w zależności od dalszej aplikacji. Zarodki są uwalniane do bufora izolacyjnego poprzez lekkie zmiażdżenie 250-750 nasion plastikowym tłuczkiem w probówce Eppendorfa. Szklana mikrokapila podłączona do standardowej pipety laboratoryjnej (za pomocą gumowej rurki) lub hydraulicznie sterowanego mikrowstrzykiwacza służy do pobierania zarodków z kropelek umieszczonych na szkiełku wielodołkowym pod mikroskopem ze światłem odwróconym. Wymagane umiejętności techniczne są proste i łatwe do przeniesienia, a podstawowa konfiguracja nie wymaga kosztownego sprzętu. Pobrane zarodki nadają się do różnych dalszych zastosowań, takich jak RT-PCR, sekwencjonowanie RNA, analizy metylacji DNA, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), barwienie immunologiczne i testy genów reporterowych.
Wprowadzenie
Zarodek kwitnących roślin jest otoczony bielmem, tkanką odżywczą pochodzącą z drugiego zapłodnienia. Zarówno zarodek, jak i bielmo są otoczone kilkoma warstwami komórkowymi okrywy nasiennej. Łącznie tkanki te tworzą nasiona, które rozwijają się wewnątrz owocu. W związku z tym analizy swoiste dla tkanek i komórek zarodków rzodkiewnika są silnie utrudnione ze względu na ich niedostępność. Niemniej jednak zarodki w późnym stadium kulistym lub późniejszym są stosunkowo dobrze podatne na ręczne rozwarstwienie za pomocą cienkich igieł wolframowych pod mikroskopem stereoskopowym lub przez wywieranie lekkiego nacisku na nasiona za pomocą kleszczy w celu ich ekstrakcji. Techniki te z powodzeniem wykorzystano do analiz profilowania transkryptomu lub epigenomu, takich jak hybrydyzacja mikromacierzy, sekwencjonowanie wodorosiarczynów lub sekwencjonowanie RNA (np. 1-3). W przeciwieństwie do tego, badania zarodków w okresie od zygoty do wczesnego stadium kulistego pozostają wyzwaniem technicznym. Do tej pory tylko kilka badań donosiło o analizach transkryptomu na młodych zarodkach przy użyciu mikrodysekcji laserowej (LCM) tkanek embrionalnych z utrwalonych odcinków nasiennych 4 lub ręcznej ekstrakcji pojedynczych zarodków z nasion przy użyciu precyzyjnych narzędzi 5. Jednak sprzęt LCM nie jest powszechnie dostępny, a ręczna ekstrakcja zarodków we wczesnych stadiach jest czasochłonna i wymaga doskonałych umiejętności preparacyjnych, które nie są łatwe do przeniesienia. Oprócz analiz całego genomu, analizy ekspresji genów in situ są również trudne do przeprowadzenia na młodych, całokształtnych zarodkach rzodkiewnika. Do pewnego stopnia, młode zarodki mogą być uwalniane na szkiełkach mikroskopowych poprzez delikatny nacisk na nasiona i wykorzystywane do testów genów reporterowych lub wykrywania białek przez barwienie immunologiczne (na przykład patrz 6,7). Technika ta nie pozwala jednak na wysokoprzepustową izolację zarodków, co utrudnia analizy ilościowe.
Dlatego opracowaliśmy skuteczny i szybki protokół wczesnej izolacji zarodków z nasion Arabidopsis, który jest prosty w konfiguracji, łatwo przenośny i odpowiedni do różnych dalszych zastosowań. Podstawową zasadą jest delikatne rozdrobnienie nasion - wyciętych z młodych łusek w probówce Eppendorfa za pomocą plastikowego tłuczka w odpowiednim buforze izolacyjnym. Ekstrakt z nasion umieszcza się w kropelkach na szkiełku wielodołkowym i bada pod kątem obecności uwolnionych zarodków na pożądanym etapie za pomocą odwróconego mikroskopu. Zarodki pobiera się za pomocą szklanej mikrokapilary podłączonej do mikroiniektora lub standardowej pipety laboratoryjnej. W przypadku zastosowań molekularnych zarodki są dwukrotnie płukane przez wielokrotne uwalnianie do kropli nowego buforu izolacyjnego przed przeniesieniem ich do buforu docelowego w minimalnej objętości. W przypadku zastosowań cytologicznych (testy reporterowe, barwienie immunologiczne, FISH) etapy mycia można pominąć.
Metoda oferuje kilka zalet: (i) daje 25-40 zarodków w ~45 minut dla zastosowań cytologicznych lub w ciągu 3-4 godzin dla zastosowań molekularnych (w tym etapów mycia), (ii) pozwala na izolację określonych stadiów embrionalnych, (iii) jest łatwo przenoszona do innych osób i laboratoriów ze względu na swoją prostą konfigurację, (iv) wymaga niedrogiego sprzętu do podstawowej konfiguracji, która jest podatna na modernizację, oraz (v) został z powodzeniem wykorzystany do różnych dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie RNA 8, analiza metylacji DNA specyficznej dla genu 9, testy reporterowe (10 i Raissig i wsp., w przygotowaniu) oraz FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux niepublikowane, patrz ryc. 5).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedura jest podsumowana na schemacie blokowym pokazanym na rysunku 1. Mikronaczynia włosowate i układ instrumentalny pokazano na rycinie 2 i rycinie 3, a typowe etapy izolacji zarodka przedstawiono na rysunku 4.
1. Przygotowanie materiału i bufora
1.1 Silikonowa powłoka mikrokapilar szklanych
- Umieść mikronaczynia włosowate w 15 ml probówce Falcon z ~5 ml Sigmacote (Sigma) i kilkakrotnie odwróć .
- Usuń roztwór, umieść probówkę Falcon zawierającą kapilary w folii aluminiowej i piecz je przez 3 godziny w temperaturze 60 °C. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
1.2 Uzyskaj końcówki mikrokapilarne o średnicy ~50-100 μm
- Przeciągnij szklane kapilary o średnicy 1 mm ręcznie nad palnikiem Bunsena lub za pomocą dostępnego w handlu ściągacza (pionowego ściągacza do filamentów lub ściągacza do mikropipet).
- Użyj pisaka lub ostrza z diamentową końcówką, aby przeciąć końcówkę ciągniętej kapilary, aby utworzyć pożądany otwór. Wybierz najlepiej ukształtowane naczynia włosowate pod mikroskopem stereoskopowym. Otwór powinien wynosić 50-100 μm (rysunek 2).
1.3 Przygotowanie slajdów
- Silikonować czyste szkiełka, przykrywając wszystkie studzienki Sigmacote (~1 ml/szkiełko) przez 5 minut, usuń. Piec 3 godziny w folii aluminiowej. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Myć wielodołkowe szklane szkiełka mikroskopijne przez 10 minut w 10% SDS, 2 x 2 minuty w wodzie wolnej od nukleaz (autoklawowany DEPC-ddH2O), 2 minuty w 70% etanolu, 2 minuty w 100% etanolu, wysuszyć na powietrzu. Wszystkie kroki odbywają się w autoklawowanych słoikach z koplinu. Szkiełka mogą być wielokrotnie używane, zapewniając dokładne czyszczenie między każdym użyciem.
- Tuż przed izolacją zarodka rozprowadzić ~0,5 μl 10 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) za pomocą pipety na całej powierzchni każdego dołka i wysuszyć na powietrzu.
1.4 Ustawienie mikroskopu i kapilary
- Użyj odwróconego mikroskopu z obiektywem o powiększeniu 10x i 20x. Zoptymalizuj kontrast światła (zarodki są dość przezroczyste).
- Umieść mikromanipulator, aby przytrzymać szklaną kapilarnę obok mikroskopu. Szklana kapilara jest podłączona do mikroiniektora (rysunek 3A) lub do zwykłej pipety P-200 za pomocą gumowej rurki (rysunek 3B, patrz Dyskusja w celu uzyskania szczegółowego opisu tej konfiguracji).
- Umieść kapilarnę nad szkiełkiem mikroskopowym pod kątem ~70° (Rysunek 3) i dostosuj pozycję, aby otwór znajdował się w polu view.
- Tuż przed izolacją zarodka pobierz i uwolnij ~5-10 μl BSA (1 mg / ml) w celu pokrycia naczynia włosowatego.
1.5
Tabela 1 zawiera listę izolacyjnych i docelowych w zależności od aplikacji podrzędnych.
- Przygotować ~ 1 ml buforu izolacyjnego na próbkę świeżo przed użyciem i przechowywać go na lodzie.
- Przygotować bufor docelowy w 0,5 ml probówce Eppendorfa o niskiej wiązalności na lodzie (zastosowania molekularne) lub na szkiełku mikroskopowym (zastosowania cytologiczne) w wilgotnej komorze.
2. Sekcja nasion i ekstrakcja zarodków
2.1 Synchronizacja rozwoju nasion
- Wykastruj kwiaty i trzymaj je 2 dni w komorze wzrostu, unikając kontaktu odsłoniętych słupków z innymi kwiatami, a następnie zapyl je (np. 11).
- Przetestuj etap rozwoju w swoich warunkach wzrostu poprzez mikroskopijne badanie oczyszczonych nasion. Przy naszych warunkach wzrostu (16 godzin światła w temperaturze 21 °C, 8 godzin ciemności w temperaturze 18 °C i 70% wilgotności) nasiona zebrane 2,5 dnia po zapyleniu (DAP) dały głównie zarodki 2-4 komórkowe, a nasiona zebrane 3,5 - 4 DAP dały kuliste zarodki.
2.2 Rozwarstwienie i pęknięcie nasion
- Usuń nasiona z 10-15 krzemionek (~2,5 DAP) pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą kleszczy i igieł insulinowych.
- Zanurz nasiona w 20 μl buforu izolacyjnego w 2 ml okrągłodennej probówce Eppendorfa umieszczonej na lodzie.
- Delikatnie zmiażdż nasiona plastikowym tłuczkiem (wstępnie oczyszczonym 10% SDS, przepłukanym DEPC-ddH2O i umytym 70% etanolem), aby uwolnić zarodki, aż ekstrakt z nasion będzie mętny. Siła, którą należy zastosować, jest określana przez każdego użytkownika podczas próby.
- Przepłukać tłuczek 300 μl buforu izolacyjnego w celu umycia tłuczka i rozcieńczenia próbki.
- Odwiruj ekstrakt w temperaturze 5 000 x g przez 5 sekund. Delikatnie zawiesić granulowany ekstrakt, pipetując w górę i w dół 2-3 razy.
- Przefiltruj ekstrakt za pomocą siatki nylonowej 30 μm (zamontowanej na adapterach rurowych, np. firmy PartecCelltricks). Przepłukać siatkę dodatkowym buforem izolacyjnym o pojemności 200 μl.
3. Izolacja zarodków
3.1 Przygotowanie slajdów
- Umieścić czyste, pokryte BSA i silikonowane szkiełko wielodołkowe na stoliku mikroskopu odwróconego, ponownie zawiesić przefiltrowany ekstrakt z nasion, delikatnie pipetując w górę iw dół, a następnie odpipetować 2 kropelki 40-50 μl ekstraktu z nasion do 1 lub 2 dołków. Przesiewanie tylko 1 lub 2 kropli na raz zapobiega parowaniu próbki.
- Umieścić 50 μl świeżego buforu izolacyjnego (1 kropla do płukania) w studzience z innego szkiełka przygotowanego jak poprzednio. Przechowuj ten szkiełko w zakrytej, wilgotnej komorze, aby zapobiec parowaniu.
3.2 Ekran, czyść, zbieraj
- Przesiewaj kropelki ekstraktu z nasion w poszukiwaniu zarodków na pożądanym etapie za pomocą obiektywu z 10-krotnym powiększeniem. W razie potrzeby potwierdź stolik z 20-krotnym powiększeniem. Zarodki zwykle opadają na dno szkiełka.
- Ręcznie usuń zanieczyszczenia wokół zarodka za pomocą igły wolframowej, igły do insuliny lub podobnego sprzętu.
- Przesuń szklaną kapilarnę w pobliże zarodka za pomocą mikromanipulatora, podnieś zarodek z jak najmniejszą ilością roztworu.
- Zebrać kilka zarodków (np. wszystkie z jednej kropli) i uwolnić je w 1. kropli do płukania (aplikacja molekularna) lub w buforze docelowym (aplikacje cytologiczne). Każda runda pobierania powinna być przechowywana w ciągu 5-10 minut, a zarodki powinny być pobierane w minimalnej objętości (całkowita objętość wszystkich rund pobierania powinna wynosić <5 μl).
- Powtarzaj badanie przesiewowe i pobieranie, aż pożądana ilość zarodków zostanie zebrana w 1. kropli do płukania (centralnie, jeśli to możliwe, w celu ułatwienia zapamiętania).
- Wycofaj wszystkie zarodki naraz z kropli do płukania (jeśli zanieczyszczenia zostaną przeniesione, usuń je igłą przed przypomnieniem).
- Uwolnić zarodki do drugiej kropli do płukania o objętości 50 μl. Powtórzyć czynności 3.2.6.
- Uwolnić zarodki w buforze docelowym. Transfer powinien obejmować jedynie kontakt, a nie zanurzenie końcówki kapilarnej.
- Wymień mikrokapilę na następną próbkę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Nasza procedura izolacji embrionów (Rycina 1) umożliwia wyizolowanie do 40 embrionów w ciągu 4 h, jeśli przeprowadza się przemywanie, np. w zastosowaniach molekularnych, lub w czasie krótszym niż godzina, jeśli pomija się przemywanie, np. w zastosowaniach cytologicznych. Rycina 2 przedstawia końcówki mikrokapilar wysokiej i niskiej jakości, a Rycina 3 pokazuje konfigurację urządzenia do izolacji embrionów. Rycina 4 przedstawia proces iz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowaliśmy protokół izolacji zarodków, który jest szybki, skuteczny i można go łatwo przenieść do innych laboratoriów.
Opisane tutaj urządzenie składa się z mikroskopu odwróconego, mikromanipulatora, szklanych mikrokapilarni, pionowego ściągacza filamentu i mikrowtryskiwacza (ryc. 3A). Konfiguracja jest podobna do opisanej dla izolacji pojedynczych komórek zwierzęcych do analiz transkryptomicznych 17. Z powodzeniem pracowaliśmy również z bardziej podstawową konfi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Talowi Nawy'emu i Martinowi Bayerowi za ich rady dotyczące izolacji zarodków. MTR, VG, UG i CB opracowały sprzęt do izolacji zarodków. MTR, VG i CB opracowały protokół izolacji zarodków. MTR, VG i CB ustaliły protokół, wyizolowały zarodki i wygenerowały cDNA zarodka, VG przeprowadziło PCR, MTR barwienie GUS, JJ eksperymenty FISH. Rękopis napisali MTR, VG, CG i UG. Praca ta została sfinansowana przez Uniwersytet w Zurychu, stypendium Fundacji Badawczej Roche (do MTR) oraz granty ze Szwajcarskiej Fundacji Narodowej (dla UG i CB).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODCZYNNIKI | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| Bufor pierwszej nici | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | zawarty w pakiecie Superscript II |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | zawarte w opakowaniu Indeks górny II |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Różni dostawcy będą również pracować | |
| : Kapilary cienkościenne 1,0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Probówka DNA LoBind 0,5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μ m | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5 dołków Szkiełka o średnicy 10 mm | Mikroskopia elektronowa Sciences | 63421-10 | |
| Roztwór formaldehydu | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Szkiełko Superfrost Plus Thermo | Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Glä ser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| Granulki SDS | Roth | CN30.3 | |
| Micro Potle | VWR | 431-0094 | |
| Mikrodrobne strzykawki insulinowe | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Kleszcze N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalizator Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Mikroskop odwrócony | Nikon TMS (Japonia), | ||
| mikromanipulator | Leitz | ||
| Mikomanipulator Leica Sonda LH1 do montażu na słupku | 39430101 | Leica microsystems | Inna marka również wykona pracę |
| Pionowy ściągacz do filamentów | Instrument Sutter | model P-20 | Inne modele są również odpowiednie |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalizator | Agilent Technologies | 2100 | |
| Fluorometr kubitowy | Invitrogen (technologie |
Bibliografia
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327(2011).
- SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634(2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
