Izolacja rodzimych mikroorganizmów glebowych z potencjałem do rozkładania biodegradowalnych folii ściółkowych z tworzyw sztucznych stosowanych w rolnictwie

Podsumowanie

Folie z tworzywa sztucznego oznaczone jako "biodegradowalne" są dostępne na rynku do użytku rolniczego jako ściółki. Uprawa roli stanowi atrakcyjną metodę utylizacji, ale degradacja w warunkach polowych jest słabo poznana. Celem pracy było opracowanie metod izolacji rodzimych grzybów glebowych i bakterii, które kolonizują plastikowe folie ściółkowe po zakopaniu w polu.

Streszczenie

Grzyby występujące na glebach rolnych, które skolonizowały dostępne na rynku biodegradowalne folie ściółkowe (BDM), zostały wyizolowane i ocenione pod kątem potencjału degradacji tworzyw sztucznych. Zazwyczaj, gdy znane są receptury tworzyw sztucznych i dostępne jest źródło surowca, sproszkowane tworzywo sztuczne można zawiesić w pożywkach na bazie agaru, a degradację określić za pomocą wizualizacji stref oczyszczania. Jednak takie podejście słabo naśladuje degradację BDM in situ. Po pierwsze, BDM nie są rozproszone jako małe cząstki w całej matrycy glebowej. Po drugie, BDM nie są sprzedawane komercyjnie jako czyste polimery, ale raczej jako folie zawierające dodatki (np. wypełniacze, plastyfikatory i barwniki), które mogą wpływać na rozwój drobnoustrojów. Opisane w niniejszym dokumencie procedury zastosowano w odniesieniu do izolatów pozyskanych z zakopanych w glebie folii ściółkowych. Izolaty grzybów pozyskane z wykopanych BDM były testowane indywidualnie pod kątem wzrostu na kawałkach nowych, zniekształconych BDM ułożonych na określonym podłożu nie zawierającym źródła węgla poza agarem. Izolaty, które rosły na BDM, były dalej testowane w ciekłym podłożu, w którym BDM były jedynym źródłem dodanego węgla. Po około dziesięciu tygodniach kolonizację grzybów i degradację BDM oceniano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Izolaty zidentyfikowano poprzez analizę sekwencji genów rybosomalnego RNA. W tym raporcie opisano metody izolacji grzybów, ale bakterie również zostały wyizolowane przy użyciu tych metod, podstawiając pożywki odpowiednie dla bakterii. Nasza metodologia powinna okazać się przydatna w badaniach nad rozpadem nienaruszonych folii z tworzyw sztucznych lub produktów, dla których surowce z tworzyw sztucznych są nieznane lub niedostępne. Jednak nasze podejście nie zapewnia ilościowej metody porównywania tempa degradacji BDM.

Wprowadzenie

Degradacja była historycznie uważana za niepożądaną cechę polimerów plastikowych, ponieważ ich rozpad skraca żywotność i trwałość produktu. W ostatnim czasie świadomość problemów środowiskowych, jakie stwarzają odpady z tworzyw sztucznych w środowisku naturalnym^1,2,3, sprawiła, że biodegradowalne tworzywa sztuczne stały się atrakcyjną alternatywą dla konwencjonalnych tworzyw sztucznych. Degradacja (zdefiniowana jako zmiany strukturalne, fragmentacja i zmniejszenie masy cząsteczkowej, integralności i wytrzymałości^4,5) zachodzi w wyniku szeregu zdarzeń, w tym zarówno procesów abiotycznych (stres termiczny, fotoutlenianie, hydroliza, erozja i naprężenia mechaniczne), jak i degradacji biologicznej⁶. Podczas gdy procesy abiotyczne mogą zmieniać wielkość fragmentów i właściwości tworzyw sztucznych, mikroorganizmy są niezbędne do ich ostatecznej mineralizacji do wody i dwutlenku węgla (w warunkach tlenowych) i/lub metanu (w warunkach beztlenowych).

W rolnictwie istnieje znaczna nisza dla biodegradowalnych tworzyw sztucznych, gdzie plastikowe ściółki są używane do zapobiegania wzrostowi chwastów, zatrzymywania wilgoci w glebie i zwiększania temperatury gleby^7,8 . Setki tysięcy akrów w samych Stanach Zjednoczonych pokryte są plastikowymi ściółkami⁹, w tym ściółkami wykonanymi z biodegradowalnego plastiku. Po zakończeniu sezonu wegetacyjnego możliwości utylizacji ściółki ulegających biodegradacji (BDM) obejmują wywóz na wysypisko śmieci, spalanie w celu odzysku energii¹⁰, degradację poprzez kompostowanie lub degradację w glebie po uprawie^{roli 11}. Spośród nich najmniej pracochłonnym losem jest wciskanie BDM w glebę, ale bez wydajnej degradacji i mineralizacji w miesiącach niezwiązanych z uprawami (zwykle zimą), fragmenty plastiku mogą pozostać i zakłócać pracę sprzętu rolniczego podczas wiosennej uprawy i sadzenia oraz utrzymywać się w środowisku, w którym znacząco wpływają na dziką przyrodę, życie roślin i mikrobiotę^1,2,3,10.

Chociaż wiele produktów z tworzyw sztucznych, w tym rolnicze folie ściółkowe, nosi etykietę "biodegradowalny" lub "kompostowalny", w praktyce degradacja i mineralizacja mogą być zbyt nieefektywne i/lub zbyt niekompletne, aby rozkład w glebie stanowił realną alternatywę dla utylizacji tych produktów. Na przykład oksybiodegradowalne polietyleny osiągnęły tylko 12,4% mineralizacji po roku wietrzenia i trzech kolejnych miesiącach w kompoście o temperaturze 58 °C, a mniej niż połowa tej mineralizacji wystąpiła, gdy temperatura kompostu wynosiła 25 °C¹². Zimą temperatury gleby w większości miejsc byłyby niższe niż którakolwiek z tych temperatur, co prawdopodobnie skutkowałoby jeszcze niższą aktywnością mikrobiologiczną, a co za tym idzie, mniejszą mineralizacją. Oprócz powolnego tempa degradacji, nadużywanie terminu "biodegradowalny" doprowadziło do braku zaufania do tych produktów ze strony konsumentów^13,14, w tym tych z branży rolniczej. Biodegradacja to przemiana polimerów w dwutlenek węgla (i/lub metan) i wodę¹⁴ przez naturalnie występujące mikroorganizmy⁴. Dlatego biodegradacja musi być mierzona chemicznie; Fizyczne powiązanie mikroorganizmów z podłożem nie oznacza degradacji mikrobiologicznej tego materiału.

W ramach starań o zbadanie zrównoważonego wykorzystania BDM w rolnictwie, to badanie skupiło się na odkryciu mikroorganizmów rodzimych dla gleb rolniczych, które kolonizują i rozkładają dostępne na rynku BDM. Opublikowano standardowe metody testowe do chemicznego pomiaru rozkładu biodegradowalnych tworzyw sztucznych za pomocą środków abiotycznych i biologicznych^15,16,17. Metody te nie uwzględniają jednak degradacji tworzyw sztucznych przez poszczególne gatunki drobnoustrojów ani nie zapewniają metod ich izolacji. Metodologia ta jest bardziej zbliżona do standardowych metod opracowanych do oceny tworzyw sztucznych pod kątem odporności na rozkład mikrobiologiczny po zaszczepieniu próbek zarodnikami grzybów^18,19.

Gdy znane są receptury tworzyw sztucznych i dostępne jest źródło surowca, sproszkowany plastik może być zawieszony w pożywkach na bazie agaru i degradacja określona przez wizualizację stref oczyszczania¹³. Metoda ta była wcześniej stosowana do identyfikacji mikroorganizmów rozkładających polimery, takie jak poliuretan²⁰, poli(bursztynian butylenu-ko-adypinian)²¹ i poli(kwas mlekowy)²². Podobna metoda polega na zawieszeniu czystego sproszkowanego tworzywa sztucznego w płynnym podłożu, w którym tworzywo sztuczne jest jedynym źródłem węgla^20,23. Chociaż metody te mają tę zaletę, że mają zdefiniowany system, słabo naśladują degradację BDM in situ. Po pierwsze, powierzchnia jest rozłożona w inny sposób, ponieważ BDM nie są rozproszone w małych cząstkach w całej matrycy glebowej, ale raczej sprzedawane i wykorzystywane jako folie. Po drugie, skład chemiczny BDM różni się od czystych polimerów. BDM na ogół zawierają dodatki, takie jak wypełniacze, plastyfikatory i barwniki, a dodatki te mogą wpływać na rozwój drobnoustrojów, a tym samym na szybkość mineralizacji. Z tego powodu, a także dlatego, że skład niektórych folii komercyjnych w tym badaniu był zastrzeżony, folia z tworzywa sztucznego w formie gotowej do użycia w terenie została wykorzystana do izolacji grzybów i bakterii. Dla uproszczenia poniższe metody są opisane tylko dla grzybów, z modyfikacjami odnotowanymi tam, gdzie jest to właściwe dla izolacji bakteryjnych.

W niedawnym badaniu²⁴, trzy komercyjnie dostępne BDM-y i jeden eksperymentalny film zostały użyte na terenach rolniczych w trzech różnych regionach Stanów Zjednoczonych przez jeden sezon wegetacyjny, a następnie umieszczone w siatkowych (250 mikronów) workach i zakopane na jedną zimę w glebie w tych samych miejscach. Otwory w siatce o średnicy 250 mikronów umożliwiają przenikanie strzępek grzybów, wykluczając korzenie i większość fauny glebowej oraz minimalizując ingerencję w glebę^25,26. Materiały nylonowe zapobiegają degradacji worka w glebie. Po wykopaliskach izolaty grzybów odzyskano z kawałków BDM i oceniono pod kątem wzrostu na minimalnym podłożu bez źródła węgla, z wyjątkiem agaru i kwadratu o wymiarach 5 cm x 5 cm pozbawionego powierzchni nowej, nieużywanej folii BDM, która została wstępnie zdezynfekowana. Większość tworzyw sztucznych używanych jako folie nie może być sterylizowana w autoklawie bez utraty integralności, dlatego światło UV zostało użyte do zabicia wszelkich komórek drobnoustrojów znajdujących się na tworzywach sztucznych. ISO 846¹⁹ zaleca dezynsekcję powierzchni w 70% etanolu, a następnie suszenie, ale w przypadku stosowania tej metody należy upewnić się, że etanol nie ma negatywnego wpływu na żaden składnik ani dodatek do folii. Ponieważ BDM są prawdopodobnie produkowane tak, aby wytrzymać światło słoneczne, jako metodę odkażania wybrano promieniowanie UV.

Izolaty, które lepiej rosły na kawałkach BDM niż na samym minimalnym podłożu, zostały wybrane do dalszych badań. Agar, polisacharyd wytwarzany przez algi morskie, jest używany do zestalania pożywek mikrobiologicznych, ponieważ zwykle nie jest wykorzystywany metabolicznie przez mikroorganizmy godne uwagi z rolniczego i medycznego punktu widzenia; Jednak enzymy hydrolizujące agar zostały wyizolowane z bakterii morskich²⁷, a bakterie hydrolizujące agar zostały również wyizolowane z gleby²⁸. Oczekuje się, że zarówno polimery BDM, jak i agar będą rzadkimi substratami dla enzymów wydzielanych przez grzyby glebowe, które nie wyewoluowały w środowiskach, które zawierają te polimery jako potencjalne źródła składników odżywczych, ale oba substraty są obecne w teście biologicznym na płytce opisanym w niniejszym dokumencie (Krok 7). Grzyby, które używają BDM, ale nie agaru jako źródła węgla, można odróżnić od grzybów, które używają tylko agaru, porównując wzrost na pożywce zestalonej z agarem zawierającej i) brak dodanego źródła węgla z wyjątkiem agaru (kontrola ujemna), ii) folie BDM (eksperymentalne) i iii) glukozę (kontrola pozytywna). Oczekuje się, że wzrost wszystkich izolatów będzie zawierał minimalną ilość glukozy; Grzyby, które nie powstają na płytkach zawierających glukozę, mogą nie być zdolne do wzrostu na określonym minimalnym podłożu użytym w doświadczeniu. Potencjalne degradery BDM powinny lepiej rosnąć na minimalnym podłożu zestalonym agarem + folii BDM niż na samym minimalnym podłożu zestalonym agarem. Grzyby rosnące na minimalnych płytkach pożywki są degraderami agaru lub oligotrofami i oczekuje się, że będą również rosły na agarze związanym z foliami BDM na płytkach do testów biologicznych, ale nie na samych foliach (chyba że przypadkowo rozkładają również polimery BDM).

Aby wyeliminować możliwość zaobserwowania wzrostu mikroorganizmów z powodu użycia agaru, a nie BDM, przeprowadziliśmy nasz wstępny test kolonizacji BDM na płytkach agarowych za pomocą testu biologicznego w określonym podłożu bulionowym (Krok 9). Kawałki BDM stanowiły jedyne znane źródło węgla w probówkach do testów biologicznych.

Po wstępnym badaniu i po ożywieniu zapasów glicerolu w izolatach, niektóre z nich utworzyły skąpe, ale widoczne grzybnie w płynnym pożywce, nie zawierającej żadnego znanego źródła węgla. Wyniki te sugerowały, że niektóre z nabytych izolatów były oligotrofami - organizmami, które rosną poprzez wymiatanie bardzo małych ilości węgla, azotu i innych składników odżywczych rozpuszczonych w środowisku wodnym lub istniejących jako substancje lotne w powietrzu^29,30,31. Identyfikacja gatunków za pomocą analizy rybosomalnego DNA 18S potwierdziła ten pogląd, ponieważ wiele izolatów pasowało do rodzajów grzybów, o których wcześniej informowano, że wykazują oligotrofię³². Oligotrofy, które są zwykle saprofitami, wymagają szerokiego zakresu zdolności metabolicznych do wykorzystania substratu w różnych środowiskach³⁰. Nic więc dziwnego, że te same grzyby, które wyizolowaliśmy z BDM (przypuszczalnie wymagających niezwykłych zdolności enzymatycznych) wykazały zdolności oligotroficzne i były w stanie rosnąć na śladowych zanieczyszczeniach, takich jak oleje skórne z odcisków palców, kurz lub śladowe ilości substancji lotnych w powietrzu. Ze względu na izolację oligotrofów doszliśmy do wniosku, że wzrost na samej powierzchni BDM nie może być wykorzystany do wnioskowania o rozpadzie BDM. Metody opisane w niniejszym dokumencie odzwierciedlają nasze wysiłki mające na celu przesiewanie rodzimych kolonizatorów BDM z gleb rolniczych pod kątem rozkładu BDM w dobrej wierze.

Protokół

Ta procedura wymaga co najmniej kilku miesięcy na inkubację filmów BDM w glebie, oraz kilka kolejnych miesięcy na sekwencyjne testy biologiczne zarówno na płytkach agarowych, jak i w bezagarowym, chemicznie zdefiniowanym bulionie w celu oceny kolonizacji i degradacji. Poszczególne metody są wymienione w kolejności, w jakiej będą wykonywane.

1. Inkubacja folii BDM w glebie

Wprowadź folie BDM do gleby w warunkach naśladujących te, w których spodziewano się ich degradacji. Zdobądź 400 g (ekwiwalent suchej masy) osiadłej gleby i ułóż BDM o wymiarach 10 cm x 10 cm z glebą w torbie z siatki nylonowej o wymiarach 13 x 13 cm (250 mikronów). Zamknij nylonową nicią. Czas inkubacji zależy od uznania eksperymentatora. Monitorować i/lub modyfikować parametry związane z aktywnością mikrobiologiczną (np. temperaturę gleby, składniki odżywcze i wilgotność) w regularnych odstępach czasu przez cały okres inkubacji, w zależności od potrzeb.

2. Przygotowanie pożywek i odczynników

Aby uniknąć przypadkowego wprowadzenia źródeł składników odżywczych do pożywek i probówek hodowlanych, używaj chemikaliów klasy odczynnikowej, nowo zakupionych probówek hodowlanych, ultraczystej (np. NanoPure) wody typu I i starannie umytych naczyń szklanych do mieszania mediów. Unikaj zanieczyszczenia krzyżowego odczynników - najlepiej użyć do tego celu dedykowanego zestawu odczynników i szkła. Należy pamiętać, że możliwe jest, że grzyby mogą zostać wyizolowane, których wzrost jest hamowany przez składnik odczynników wymienionych poniżej. W takim przypadku może być wymagana pewna optymalizacja.

1. Przed przygotowaniem podłoża należy umyć wszystkie niezbędne naczynia szklane detergentem laboratoryjnym, a następnie umyć kwasem (np. namoczyć przez noc w 10% HCl). Spłucz co najmniej dwanaście razy w wodzie destylowanej i dwa razy w wodzie ultraczystej. Przykryj wszystkie szklane naczynia czystą folią aluminiową, aby wykluczyć kurz. Noś rękawiczki i unikaj dotykania wnętrza i krawędzi naczyń, aby wykluczyć oleje skórne z odcisków palców. Aby uniknąć pozostałości mydła i zadrapań w szkle, które ułatwiają kolonizację, hoduj grzyby w nowo zakupionych (nieużywanych), wypłukanych i autoklawowanych szklanych probówkach i nakrętkach do hodowli.
2. Agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) służy do wstępnej izolacji grzybów z gleby oraz do zakładania pojedynczych izolowanych kolonii i generowania inokulum do długotrwałego przechowywania. Przygotować pożywkę zgodnie z instrukcjami producenta i po sterylizacji w autoklawie (po schłodzeniu do 50 °C) dodać chloramfenikol (z roztworu podstawowego o stężeniu 10 mg/ml w EtOH) do końcowego stężenia 30 μg/ml, aby wykluczyć bakterie. To podłoże jest obecnie określane jako PDA chl³⁰.
3. Minimalna pożywka grzybowa (FMM) jest stosowana jako solidna baza dla BDM zaszczepionych potencjalnymi degraderami tworzyw sztucznych grzybów. Oprócz agaru (gdy jest używany do zestalania podłoża), nie zawiera węgla. Do około 800 ml dejonizowanego_H2Ododać 6,0 g NaNO₃, 0,52 g KCl, 0,52 g MgSO₄·_7H2O, 1,52 g KH₂PO₄ i 1 ml roztworu podstawowego pierwiastków śladowych Hutnera (2,2 g ZnSO₄·7H₂O, 1,1 g H₃BO₃, 0,5 g MnCl₂·4H₂O, 0,5 g FeSO₄·_7H2O, 0,16 g CoCl₂·5H₂O, 0,16 g CuSO₄·5H₂O, 0,11 g (NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O i 5,0 g Na₄ EDTA w 100 ml destylowanym H₂O^33,34. Dostosuj pH do 6,5 za pomocą NaOH i zwiększ objętość do 1 l. W przypadku płynnego testu biologicznego należy przefiltrować i wysterylizować FMM, aby uniknąć wytrącania się soli. Jeśli pożądane jest stałe podłoże, dodaj 16 g agaru i autoklawu. Gdy wymagany jest agar półstały, zmniejsz ilość agaru do 8 g/l. Po schłodzeniu do temperatury 50 °C dodać chloramfenikol do końcowego stężenia 30 μg/ml. To medium jest obecnie określane jako FMM chl³⁰. Jako kontrolę, aby upewnić się, że izolaty grzybów rosną w tym podłożu, FMM powinien być wykonany jak powyżej, ale zawierający 10 g glukozy na litr. Nazywa się to minimalnym podłożem glukozy³⁵ (GMM).
4. Sól fizjologiczna ³⁶ (PBS) buforowana fosforanami służy do zawieszania cząstek gleby i komórek drobnoustrojów w początkowym seryjnym rozcieńczaniu BDM wystawionych na działanie gleby. Aby zrobić PBS, dodaj 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ i 0,24 g KH₂PO₄ do 800 ml wody destylowanej. Rozpuść sole i dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl. Zwiększ całkowitą objętość do 1 l za pomocą ultraczystej wody. Napełnij czyste probówki hodowlane 9,5 ml i 4,5 ml PBS na probówkę. Autoklaw.
5. 30% (v/v) glicerol służy do zawieszania kriokonserwowanych komórek bakteryjnych i drożdżowych, zarodników i grzybni grzybów podczas przechowywania w temperaturze -80 °C. Roztwór ten należy przygotować w ultraczystej wodzie. Autoklaw.
6. 0,01% (v/v) Triton X-100 służy do zawieszania zarodników grzybów; detergent działa jako nietoksyczny środek zwilżający zarodniki hydrofobowe. Rozpuścić 100 μl Triton X-100 w 1 l ultraczystej wody. Autoklaw.
7. 0,1 M bufor fosforanowo-sodowy (pH 7,2) jest stosowany jako rozpuszczalnik aldehydu glutarowego podczas utrwalania SEM. Zmieszać 68,4 ml 1 M Na₂HPO₄ i 31,6 ml 1 M NaH₂PO₄ i doprowadzić całkowitą objętość do 1 l z wodą ultraczystą³⁶.

3. Przygotowanie materiałów do testów biologicznych: Dekontaminacja powierzchni folii BDM

1. Ponieważ resztki zanieczyszczeń, takie jak papier i taśma na przyborach do cięcia, są potencjalnym źródłem węgla, używaj nowo zakupionych nożyczek lub świeżych żyletek oraz nieorganicznej powierzchni do cięcia. Nosić rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia folii BDM olejkami do skóry. Pokrój folie BDM na małe kwadraty (4,25 x 4,25 cm). Ten kwadrat o rozmiarze pasuje do standardowej płytki Petriego o wymiarach 100 x 15 mm.
2. Użyj bakteriobójczej lampy UV (długość fali emisji = 253,7 nm) do odkażenia folii BDM. Taka lampa często znajduje się w standardowej szafie bezpieczeństwa biologicznego. Upewnij się, że podczas działania światła UV do komory bezpieczeństwa biologicznego nie ma przepływu powietrza z zewnątrz, które mogłoby zanieczyścić folie BDM.
3. Zwilż powierzchnie wewnątrz okapu 70% EtOH i pozwól dmuchawie pracować przez 15 minut, aby spłukać powietrze. Następnie zamknij skrzydło i odkażaj powierzchnię okapu promieniami UV przez 2 godziny.
4. Umieść folie BDM w odkażonym okapie, w rzędach. Pozwól, aby światło UV świeciło na folie przez 2 godziny.
5. Użyj czystych, wysterylizowanych kleszczy, aby odwrócić folie BDM. Zacznij od pierwszego rzędu i pracuj do tylnego rzędu, aby zminimalizować czas, w którym ręce i ramiona znajdują się bezpośrednio nad nowo odkażonymi powierzchniami BDM. Podczas odwracania BDM połóż nowo odynkowitą stronę w dół na czystym obszarze wystawionym na działanie światła UV, ale nie mającym wcześniej kontaktu z niezainfekowaną stroną folii.
6. Po 2 godzinach obróbki UV z każdej strony, usuń folie BDM z szafki bezpieczeństwa biologicznego za pomocą sterylnych kleszczy, ponownie pracując od przodu do tyłu, aby uniknąć kładzenia rąk i ramion na już odkażonych foliach. Umieść folie BDM w sterylnych, suchych, przykrytych pojemnikach, takich jak zlewki pokryte folią. Przechowywać w RT w ciemności.

4. Konfiguracja testu biologicznego na płytce

Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym kapturze transferowym, stosując technikę aseptyczną.

1. Połóż odynekowane promieniami UV kawałki BDM na powierzchni płytek agarowych. Najpierw połóż jeden róg i delikatnie pozwól, aby reszta kwadratu zetknęła się z agarem. Unikaj zmarszczek. Niektóre folie tworzą zmarszczki, jak podczas przechowywania; Jest to nieuniknione. Szczególnie cienkie folie mogą wymagać użycia dwóch kleszczyków w celu ułożenia elementu płasko.
2. Umieść kulki półstałego agaru FMM chl³⁰ na folii z tworzywa sztucznego, aby zapewnić źródło wody i składników odżywczych do początkowej kolonizacji hydrofobowych tworzyw sztucznych. Koraliki nie są konieczne w przypadku folii przepuszczalnych dla wody. Ponownie rozpuść agar w kuchence mikrofalowej i za pomocą mikropipety przenieś cztery krople stopionego agaru o pojemności 10 μl na ściółkę (po jednej w każdym rogu). Nie dotykaj końcówki pipety bezpośrednio do ściółki, ponieważ może to spowodować przebicie. Nie przekraczaj 10 μl na kroplę, ponieważ nadmierny ciężar na ściółce może oderwać plastik od powierzchni agaru, gdy talerze są odwrócone.
3. Pozostaw płytki na noc prawą stroną do góry z przykrytymi pokrywkami, aby całkowicie zastygły, a następnie przechowuj szczelnie zamknięte rękawy stroną agarową do góry w temperaturze 4 °C w ciemności. Gdy jesteś gotowy do przeprowadzenia testu biologicznego (etap 7), użyj i) jednej płytki FMM^{chl 30} (kontrola ujemna), ii) jednej płytki do testu biologicznego zawierającej cztery 10 μl kropli półstałego FMM chl³⁰ na folii z tworzywa sztucznego oraz iii) jednej płytki GMM (kontrola pozytywna). W ten sposób można przebadać cztery powtórzenia każdego izolatu na płytkę z podłożem.

5. Konfiguracja płynnego testu biologicznego

1. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi cięcia BDM w kroku 3.1. Przed cięciem folii z tworzywa sztucznego do płynnego testu biologicznego wybierz rozmiar, który pasuje do probówki hodowlanej. Powierzchnia niezbędna do uzyskania jednolitej masy wśród kilku rodzajów tworzyw sztucznych będzie zależeć od grubości folii. Odkryliśmy, że kawałki odpowiadające 0,0175 g dobrze mieszczą się w probówkach hodowlanych o wymiarach 15 x 150 mm.
2. Folie należy odkazić powierzchniowo za pomocą światła UV, jak opisano w kroku 3 powyżej.
3. Dla każdej kontrpróby izolatu drobnoustrojów należy przygotować trzy probówki do inokulacji: i) 5 ml FMM zawierającej fragment BDM o z góry określonej wielkości (eksperymentalny), ii) 5 ml FMM bez źródła węgla (kontrola ujemna) oraz iii) 5 ml GMM (kontrola pozytywna). Dodatkowo należy przygotować probówki z replikami FMM zawierające każdy BDM do testowania, ale nie należy ich zaszczepiać. Te probówki kontrolne ujawnią wszelkie drobnoustroje wynikające z zanieczyszczenia.

6. Izolacja grzybów

Po inkubacji gleby i usunięciu próbki, grzyby są izolowane z gleby, która przylega do warstw BDM. W razie potrzeby bakterie można jednocześnie wyizolować tą samą metodą przy użyciu pożywek odpowiednich do izolacji bakterii glebowych, takich jak 1/10X rozcieńczony agar z drożdży sojowych tryptycznych uzupełniony 50 μg/ml cykloheksymidu w celu powstrzymania wzrostu grzybów³⁷. Gdy do izolacji bakterii w krokach 5 i 7 wymagane jest zdefiniowane podłoże, dobrym wyborem jest M9³⁸ (plus cykloheksymid).

1. Przed przetworzeniem próbki należy przygotować PBS i PDA chl³⁰. Pozostaw płytki PDA chl³⁰ do wyschnięcia (bez opakowania) w temperaturze pokojowej przez około 24 godziny, aby wyeliminować kondensację pary wodnej na pokrywkach i powierzchni agaru. Wstępnie oznacz PDA na³⁰ płytach.
2. Wykop worki siatkowe zawierające kawałki BDM z miejsc pochówku wybranych w kroku 1. Wysyłać i przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 48 godzin po wydobyciu z gleby.
3. Za pomocą sterylnej szpatułki i kleszczyków delikatnie usuń brud, aż plastik zostanie odsłonięty, ale nie strzepuj ziemi, która przylega do powierzchni folii BDM. Pokrój folię BDM na 1 cm² kawałki, aż zostanie odzyskane 0,5 g materiału dla każdej z czterech całkowitych replikacji. Przenieś 0,5 g folii BDM i dołączoną glebę do 25 ml probówek hodowlanych zawierających 9,5 ml PBS. Jeśli ściółka jest całkowicie zdegradowana lub przetwarzana jest kontrola tylko glebowa, dodać 0,5 g gleby do PBS; Jeśli to możliwe, wybierz kawałki, które nadal są odbarwione od resztkowej ściółki.
4. Wirować probówki hodowlane zawierające 9,5 ml PBS i 0,5 g ściółki przez 30 sekund z dużą prędkością, sonikować w sonikującej łaźni wodnej przez 10 minut i ponownie wirować przez 30 sekund. Mieszanie ma na celu rozbicie biofilmów, fizyczne usunięcie komórek osadzonych w kawałkach ściółki lub przylegających do nich i stworzenie jednorodnej zawiesiny.
5. Przygotować się do seryjnego rozcieńczania PBS/roztworu glebowego w celu uzyskania pojedynczych jednostek tworzących kolonie z posiewów. Dla każdej próbki umieścić w okapie z przepływem laminarnym jedną probówkę hodowlaną wypełnioną 4,5 ml sterylnego PBS. Dla każdej próbki należy wypełnić trzy studzienki 96-dołkową płytką głębinową wypełnioną 450 μl PBS.
6. Oryginalna zawiesina plastik/gleba (0,5 g ściółki plus 9,5 ml roztworu PBS) stanowi rozcieńczenie 5,0 x ^10-2 materiału mikrobiologicznego przylegającego do tworzywa sztucznego. Dodać 0,5 ml zawiesiny z tej oryginalnej probówki do 4,5 ml sterylnego PBS w probówce hodowlanej, aby uzyskać rozcieńczenie 5,0 x ^10-3. Wiruj przez 30 sekund z dużą prędkością. Dodać 50 μl do 450 μl PBS w 96-dołkowej płytce. Powtórzenia należy powtórzyć dla wszystkich próbek/kontrprób. Do masowego rozcieńczania próbek należy używać pipetora wielokanałowego. Wymieszać każde nowe rozcieńczenie, pipetując w górę i w dół dziesięć razy. Zmieniaj końcówki między rozcieńczeniami. Rozcieńczyć do 5,0 x ^10-6.
7. (Opcjonalnie) Izolaty bakteryjne były liczniejsze niż izolaty grzybów w próbkach opisanych w niniejszym dokumencie; więc jeśli jednocześnie izolujemy bakterie, należy wykonać seryjne rozcieńczenia do 5 x ^10-8 w kroku 6.6 powyżej.
8. Równomiernie rozprowadzić 100 μl z każdego z rozcieńczeń 5,0 x ^10-3 przez 5,0 x ^10-6 na powierzchni agaru płytek PDA chl³⁰ za pomocą sterylizowanych płomieniowo prętów szklanych. Przechowuj płytki w pozycji pionowej przez 30 minut, aby płyn mógł wsiąknąć, a następnie uszczelnij płytki Parafilmem, aby uniknąć ucieczki zarodników z niezidentyfikowanych izolatów. Inkubować odwrócone płytki w temperaturze 20 °C w ciemności przez 5 dni, aby umożliwić zarówno szybkim, jak i wolno rosnącym grzybom utworzenie kolonii.

7. Wstępny wybór grzybów rozkładających plastik

Ważne: Od tego momentu wszystkie kultury powinny być otwierane tylko w komorze bezpieczeństwa biologicznego (nie w kapturze z przepływem laminarnym), aby uniknąć skażenia środowiska zarodnikami o nieznanej tożsamości. Niektóre grzyby i bakterie glebowe są potencjalnymi patogenami dla ludzi.

1. Zbadać płytki rozcieńczające zawierające dobrze wyizolowane kolonie. Wybierz kolonię, która nie styka się z inną kolonią.
2. Używając pojedynczej sterylnej wykałaczki, delikatnie dotknij kolonii, a następnie dotknij agaru z płytkami FMM (wykonanymi w kroku 2.3), FMM + plastik (wykonanymi w kroku 4) i GMM (wykonanymi w kroku 2.3), w tej kolejności. Aby zaszczepić kulki agaru na plastikowych foliach, delikatnie przetrzyj wykałaczką powierzchnię kropki agarowej, a następnie przesuń po plastikowej folii. Powtarzaj inokulację z tej samej kolonii źródłowej, aż na każdej płytce pojawią się cztery powtórzone smugi.
3. Powtarzaj kroki od 7.1 do 7.2, aż z każdej próbki BDM zostanie wybranych kilka powtórzeń każdego wizualnie unikalnego typu kolonii.
4. Uszczelnić płytki Parafilmem, odwrócić i inkubować w temperaturze 20 °C w ciemności przez 5 dni.
5. Zidentyfikuj izolaty, które rosną na BDM lepiej niż na FMM. Jeśli wzrost nie jest oczywisty, obejrzyj próbkę pod mikroskopem preparacyjnym, aby zweryfikować kolonizację lub jej brak (ryc. 1). Trzymaj pokrywkę założoną; Jeśli na pokrywie występuje kondensacja, wymień ją na nową, ale zrób to w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
6. Po wybraniu potencjalnych degraderów BDM, użyj sterylnej wykałaczki, aby zeskrobać inokulum z grzyba kolonizującego sam plastik i smugę do izolacji pojedynczych jednostek tworzących kolonie na płytkach PDA chl³⁰.
7. Uszczelnić płytki Parafilmem i inkubować PDA chl³⁰ płytek inokulowanych izolatami rozkładającymi tworzywa sztuczne w temperaturze 20 °C przez 5 dni w ciemności.
8. Teraz, gdy pojedyncze izolowane kolonie są oczyszczane, upewnij się, że są one naprawdę w stanie skolonizować testowane folie z tworzywa sztucznego. Zbierz inokulum (zarodniki, komórki drożdży lub strzępki) z pojedynczej jednostki tworzącej kolonię za pomocą sterylnej wykałaczki. Powtórz kroki od 7.2 do 7.5. Po 5 dniach inkubacji w temperaturze 20 °C zbadać płytki do testów biologicznych pod kątem wzrostu grzybów. Jeśli izolat rośnie na folii BDM lepiej niż rośnie na FMM zarówno w pierwszej (7,5), jak i drugiej (7,8) próbie, należy przechowywać izolat w sposób opisany poniżej w kroku 8.

8. Długoterminowe przechowywanie degraderów tworzyw sztucznych

Ogólnie, izolaty rozkładające plastik zostaną przetestowane w teście biologicznym na płytce (7.5), ponownie oczyszczone do pojedynczych izolowanych jednostek tworzących kolonie (7.6), ponownie przetestowane w teście biologicznym na płytce (7.8), a na koniec przetestowane w płynnym teście biologicznym (9.1 - 9.5). Podczas badania izolaty powinny być co miesiąc przenoszone na świeże podłoża, a robocze płyty wyjściowe powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C, gdy tylko widoczny jest wystarczający wzrost. Izolaty powinny być również przechowywane w postaci glicerolu w temperaturze -80 °C i/lub jako wysuszone zarodniki na sterylnych krążkach filtracyjnych w temperaturze 4 °C. Obie metody przechowywania zostały opisane poniżej.

1. Dla każdego izolatu, który rósł na folii BDM lepiej niż na FMM zarówno w pierwszych (7,5), jak i drugich (7,8) testach biologicznych na płytce, przygotuj dwie płytki PDA chl³⁰ z dwoma lub trzema wysterylizowanymi krążkami z bibuły filtracyjnej o średnicy około 1 cm na powierzchni. Zaszczepij te dwie płytki z tej samej pojedynczej kolonii wybranej w kroku 7.8 powyżej. Zrób trawnik, równomiernie rozprowadzając inokulum na agrze, aby zmaksymalizować wzrost. Uszczelnić płytki Parafilmem i inkubować w temperaturze 20 °C przez 5 dni. Ten krok można zainicjować jednocześnie z krokiem 7.8 w celu zwiększenia wydajności.
2. Krążek filtracyjny na powierzchni agaru powinien być pokryty grzybnią/zarodnikami. Usuń krążki filtra z powierzchni agaru za pomocą wysterylizowanych kleszczy i umieść w sterylnej probówce Eppendorfa. Dyski filtracyjne należy suszyć na powietrzu przez noc wewnątrz probówek Eppendorfa (ze zdjętą nakrętką) w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub innym suchym, sterylnym środowisku z minimalnym ruchem powietrza, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Następnie uszczelnić Parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Użyj sterylnego bawełnianego wacika lub wykałaczki, aby zebrać zarodniki i grzybnię z płytek trawnika. Zawiesić zarodniki i strzępki w 30% glicerolu w kriowialach, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

9. Rygorystyczne potwierdzenie utylizacji tworzyw sztucznych za pomocą płynnego testu biologicznego

1. Wygeneruj świeże zarodniki i/lub komórki, za pomocą których zaszczepisz płynne kultury: zaszczep płytki PDA chl³⁰ zarodnikami z potencjalnie rozkładających się izolatów plastiku. Uszczelnić płytki parafilmem i inkubować w temperaturze 20 °C, aż do momentu, gdy pojawią się zarodniki grzybów.
2. W komorze bezpieczeństwa biologicznego zbierz zarodniki, myjąc płytkę 0,01% Triton X-100 (dobrze sprawdza się 5 ml na płytkę Petriego 15 x 100 mm) i szorując zarodniki (lub komórki drożdży) z powierzchni za pomocą sterylnego pręta z giętego szkła. Odessać zawiesinę zarodników (lub komórek) i przenieść do sterylnego pojemnika.
3. Policz zarodniki lub komórki za pomocą hemacytometru i określ odpowiednią objętość, aby dodać do 5 ml bulionu FMM, co daje w sumie 1 x 10⁶ zarodników / probówkę. Objętość powinna być mniejsza niż 10 μl. Może być konieczne rozcieńczenie skoncentrowanych zawiesin zarodników w 0,01% Triton X-100.
4. W sterylnym kapturze transferowym zaszczepić probówki hodowlane przygotowane w Kroku 5 zarodnikami 1 x 10⁶ (lub komórkami drożdży). Uszczelnij nakrętki preparatem Parafilm, aby uniknąć ucieczki zarodników, szczególnie w przypadku niezidentyfikowanych izolatów. Inkubować w ciemności w temperaturze 20 °C i co tydzień obserwować próbki pod kątem wzrostu.
5. Wzrost grzybni grzybów na foliach z tworzyw sztucznych może być widoczny w ciągu pierwszego tygodnia po inokulacji, szczególnie na krawędziach folii z tworzywa sztucznego. W przypadku drożdży planktonowych (o czym świadczy mętna pożywka) wzrost można monitorować za pomocą odczytów gęstości optycznej przy 600 nm. Ponieważ grzyby mogą przyczepiać się bezpośrednio do folii z tworzywa sztucznego, wzrost można ocenić na oko i potwierdzić za pomocą mikroskopii świetlnej i/lub skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).
6. W kontrolach tylko FMM należy szukać maleńkich białych plamek, które są zbyt małe, aby zarejestrować zmianę gęstości optycznej za pomocą metod spektrofotometrycznych. Plamki te można odessać za pomocą pipety Pasteura i obserwować za pomocą mikroskopii interferencyjnej (DIC). Plamki są często niezidentyfikowanymi osadami, ale w niektórych przypadkach mogą to być grudki oryginalnego inokulantu, który wykiełkował, ale nie urósł znacząco.
7. Wykorzystaj obserwacje wizualne i mikroskopowe, aby porównać kolonizację próbek eksperymentalnych i kontrolnych oraz przypisać oceny wzrostowi na każdej próbce filmu BDM. Ponieważ wiele BDM ma ciemny kolor i pozwala na minimalną obserwację za pomocą mikroskopii, z wyjątkiem krawędzi, a grubość warstwy uniemożliwia obserwację pod soczewką olejową, SEM jest przydatny do oszacowania i) obecności wzrostu drobnoustrojów, np. za pomocą systemu oceny opisanego w tabeli 1, oraz ii) zakresu degradacji BDM.

10. Przygotowanie próbki SEM

1. Użyj czystych, sterylnych nożyczek, aby wyciąć małe kawałki BDM z powtórzonych próbek. Napraw BDM, zanurzając w 2,5% aldehydzie glutarowym w 0,1 M buforze fosforanu sodu (pH 7,2) na 24-48 godzin.
2. Podczas utrwalania należy odwodnić czysty 100% etanol, dodając 5-10% objętości 3 A sita molekularnego (aktywowanego w piecu suszącym w temperaturze 175-260 °C i schłodzonego w eksykatorze) i pozostawionego na noc w temperaturze pokojowej, aby zapewnić całkowite odwodnienie.
3. Zanurz BDM w 0,1 M buforze fosforanu sodu (pH 7,2) na cztery płukania po 15 minut każde.
4. Zanurz BDM w ultraczystej wodzie na trzy prania po 5 minut każde.
5. Odwodnić próbki BDM w serii etanolu, zanurzając na 20 minut przy każdym stężeniu: 50%, 70%, 80%, 90%, 95% i 100%. Opłucz BDM jeszcze dwa razy w 100% etanolu przez 20 minut na płukanie.
6. Próbki należy poddać suszeniu w punkcie krytycznym i napylaniu natryskowemu.

Wyniki

W niedawnym badaniu²⁴, cztery repliki każdego z trzech dostępnych na rynku BDM-ów oznaczonych jako "biodegradowalne", plus eksperymentalna folia i konwencjonalna plastikowa kontrola, zostały umieszczone na glebie jako ściółka do produkcji pomidorów wiosną 2010 roku w Mount Vernon, WA, Knoxville, TN i Lubbock, TX. Jesienią 2010 r. z każdej zwietrzałej ściółki wycięto kwadraty folii BDM na czterech powtórnych poletkach, a rodzima gleba została usunięta bezpośrednio spod obszaru, z którego wycięto próbkę ściółki....

Dyskusja

Opisana w niniejszym dokumencie procedura stanowi technikę pierwszego przejścia do izolowania potencjalnych degraderów BDM z gleby i została z powodzeniem zastosowana do izolacji grzybów z BDM zakopanych w glebie przez siedem miesięcy. Grzyby rosły po ponownym nałożeniu na świeży materiał BDM tego samego typu, co wskazuje, że izolowane grzyby były rzeczywiście kolonizatorami, a błony nie hamowały wzrostu grzybów. Izolacja grzybów i bakterii rozkładających tworzywa sztuczne może potencjalnie prowadzić do ich wykorzystania...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar z dekstrozą ziemniaczaną	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramfenikol	Acros Organics	200-287-4
Aldehyd glutarowy	Mikroskopia elektroniczna Nauki	16216-10	Toksyczne
sito molekularne	Fisher	M-8892
Etanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Opakowanie z tworzywa sztucznego	S37440
Sole mineralne do i pożywek	Fisher	Various	Różni sprzedawcy sprzedają te odczynniki