Artykuł metodologiczny

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

65.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50374

⸱

25 czerwca 2014

 ,  ,  , 
1Department of Nutrional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes, and Metabolism, University of Wisconsin-Madison, 3School of Pharmacy, University of Waterloo

W tym artykule

Podsumowanie

Badanie in vitro funkcji komórek β przy użyciu izolowanych mysich wysepek Langerhansa jest ważnym elementem badań nad patofizjologią i terapią cukrzycy. Chociaż dostępnych jest wiele dalszych zastosowań, protokół ten szczegółowo opisuje pomiar wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) jako podstawowego parametru określającego funkcję komórek β.

Streszczenie

Niekontrolowana glikemia jest cechą charakterystyczną cukrzycy i sprzyja chorobom takim jak neuropatia, nefropatia i retinopatia. Wraz z rosnącym rozpowszechnieniem cukrzycy, zarówno typu 1 o podłożu immunologicznym, jak i typu 2 związanego z otyłością, badania mające na celu określenie patofizjologii cukrzycy i mechanizmów terapeutycznych mają kluczowe znaczenie. Komórki β wysp trzustkowych Langerhansa są odpowiedzialne za odpowiednie wydzielanie insuliny w odpowiedzi na podwyższone stężenie glukozy we krwi. Oprócz glukozy i innych składników odżywczych, komórki β są również stymulowane przez specyficzne hormony, zwane inkretynami, które są wydzielane z jelit w odpowiedzi na posiłek i działają na receptory komórek β, które zwiększają produkcję wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP). Zmniejszona funkcja komórek β, masa i reaktywność inkretyn są dobrze poznane, aby przyczyniać się do patofizjologii cukrzycy typu 2, a także są coraz częściej łączone z cukrzycą typu 1. Obecny protokół izolacji mysi wysp trzustkowych i oznaczania cAMP może być narzędziem pomagającym w określeniu mechanizmów sprzyjających postępowi choroby i interwencji terapeutycznych, szczególnie tych, w których pośredniczą receptory inkretynowe lub pokrewne receptory, które działają poprzez modulację wewnątrzkomórkowej produkcji cAMP. Chociaż opisane zostaną tylko pomiary cAMP, opisany protokół izolacji wysp trzustkowych tworzy czysty preparat, który pozwala również na wiele innych dalszych zastosowań, w tym wydzielanie insuliny stymulowane glukozą, inkorporację [3H]-tymidyny, obfitość białka i ekspresję mRNA.

Wprowadzenie

Ścisłe utrzymanie euglikemii jest konieczne, aby zapobiec chorobom takim jak neuropatia, nefropatia i retinopatia, które są cechami charakterystycznymi patologii niekontrolowanej cukrzycy typu 1 i 21. Zmniejszona funkcja i masa komórek β zarówno w cukrzycy typu 1, jak i 2 zaburzają stężenie glukozy we krwi2. Podczas gdy cukrzyca typu 1 o podłożu immunologicznym wynika z druzgocącej utraty komórek β produkujących insulinę, upośledzone wydzielanie insuliny przez β komórek i obwodowa sygnalizacja insuliny w cukrzycy typu 2 razem sprzyjają hiperglikemii, dyslipidemii i zwiększonej produkcji glukozy w wątrobie, co ostatecznie prowadzi zarówno do utraty masy komórek β, jak i zdolności wydzielania insuliny z poszczególnych komórek β3. Miejmy nadzieję, że zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw β-komórkowych w progresji cukrzycy typu 1 i 2 zaowocuje nowymi terapiami w celu zapobiegania i leczenia tych chorób.

Modele hodowli tkanek in vitro, takie jak unieśmiertelnione linie komórek β INS-1 i MIN6, mogą być użytecznymi narzędziami do zrozumienia specyficznych funkcji komórek β. Jednak interakcje między różnymi typami komórek w obrębie wysepki mogą same regulować funkcję komórek β. Na przykład parakrynny wpływ glukagonu (uwalnianego z komórek α) i somatostatyny (uwalnianej z komórek δ) odpowiednio na zwiększanie i zmniejszanie wydzielania insuliny pokazuje znaczenie bliskości komórek komórkowych w odpowiedzi hormonalnej4. Co więcej, połączenia szczelinowe między komórkami β nasilają uwalnianie insuliny5. Ponadto, chociaż poczyniono postępy w generowaniu linii insulinoma, które lepiej replikowały fizjologiczną odpowiedź izolowanych wysp trzustkowych na glukozę (np. linie komórkowe 832/13 i 832/3 pochodzące z INS-1), ich reakcja na glukozę nadal różni się od normalnych wysepek szczurów6,7. Co więcej, odpowiedź tych klonalnych linii komórkowych insulinoma na agonistów glukagonopodobnego peptydu-1 (GLP-1) może się znacznie różnić od siebie, a także od normalnych wysp trzustkowych6. Dlatego unieśmiertelnione linie komórkowe mogą nie stanowić najlepszego modelu do oznaczania środków wpływających na produkcję cAMP.

W przeciwieństwie do linii komórkowych pochodzących z insulinomy, badanie funkcji komórek β wyłącznie na całych modelach zwierzęcych oferuje własny zestaw komplikacji. Jednym z największych wyzwań w pracy z tkanką endokrynną jest pomiar precyzyjnego stężenia uwalnianego hormonu. W szczególności wątroba odgrywa główną rolę w metabolizowaniu insuliny, a przepływ krwi w trzustce trafia bezpośrednio do wątroby. W związku z tym pomiar insuliny w osoczu może nie przedstawiać dokładnie ilości insuliny wydzielanej przez samą trzustkę lub wpływu różnych metod leczenia na szybkość wydzielania insuliny8. Ponadto nerkowy metabolizm glukagonu może ograniczać wiarygodność produkcji glukagonu z komórek α wysp trzustkowych9. W związku z tym wyizolowanie pierwotnych wysepek trzustkowych myszy do eksperymentów in vitro zapewnia bardziej precyzyjne zrozumienie, w jaki sposób wyspa reaguje na określone bodźce, co uzupełnia pomiary wykonane in vivo.

Obecny protokół izolacji mysich wysepek jest dobrze znanym protokołem używanym przez wiele grup (z niewielkimi modyfikacjami, które mogą pomóc w zwiększeniu sukcesu)10,11. Ponadto określenie produkcji cAMP pozwala na bezpośredni odczyt reakcji inkretynowej komórek β. W połączeniu z pomiarem cAMP, zawartość białka i wydzielanie insuliny można również określić ilościowo z tego samego preparatu próbki cAMP, co pomaga określić, czy defekt funkcji komórek β leży proksymalnie czy dystalnie w stosunku do cAMP10. Ostateczna zawartość cAMP i zastosowanie wydzielania insuliny w tym protokole może być bardzo potężnym narzędziem do zrozumienia wpływu składników farmaceutycznych i dietetycznych, między innymi, na cAMP i wydzielanie insuliny. Oprócz stymulacji samą glukozą, inne związki mogą być używane do pomiaru zmian w cAMP i wydzielaniu insuliny10,11.

Na koniec, chociaż insulina jest głównym hormonem, który badamy z izolowanych wysp trzustkowych, inne hormony, takie jak glukagon i somatostatyna, a także cytokiny, eikozanoidy i cykliczny monofosforan adenozyny, mogą być również mierzone, albo przez test przejściowej stymulacji, albo przez ilościowe określenie ich poziomów w pożywce hodowlanej12. Wreszcie, chociaż wykracza to poza zakres tego manuskryptu, izolacja wysp trzustkowych za pomocą opisanej metody izolacji kolagenazy pozwala na zachowanie wysp trzustkowych, dzięki czemu można realizować wiele innych dalszych zastosowań, takich jak przeszczep wysp trzustkowych, izolacja RNA do ilościowych analiz PCR w czasie rzeczywistym lub mikromacierzy, izolacja białek do Western blot, osadzanie wysp trzustkowych i obrazowanie immunofluorescencyjne oraz inkorporacja [3H]-tymidyny jako miara replikacji komórek wysp trzustkowych, niektóre z nich zostały opisane w poprzednich artykułachJoVE 13-16. Ogólnie rzecz biorąc, przestrzeganie procedury izolacji wysp trzustkowych opisanej w protokole może dostarczyć badaczowi ważnych i użytecznych informacji do opracowywania terapii i promowania odkrywania leków mających na celu poprawę funkcji komórek β.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi. Demonstrowany protokół został przeprowadzony pod kierunkiem i za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Wisconsin-Madison.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Metodą eutanazji w tym protokole jest wykrwawienie w znieczuleniu Avertin (przegląd alternatyw znajduje się w Dyskusji). Aby przygotować Avertin, dodać 0,625 g (1,25% lub 44,2 mM) 2-2-2 tribromoetanolu do 1,25 ml 2-metylo-2-butanolu w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i podgrzewać w temperaturze 37 °C przez 20-30 minut. Wirować roztwór na wysokich obrotach przez 10-15 sekund na raz, aby całkowicie rozpuścić 2-2-2 tribromoetanol. Po całkowitym rozpuszczeniu dodać roztwór do 48,75 ml podwójnie destylowanegoH2O, przefiltrować przez filtr 0,45 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, zawinąć stożkową probówkę o pojemności 50 ml w folię aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca. Przynieś probówkę do RT przed wstrzyknięciem myszy.
  2. Aby przygotować Zbilansowany Roztwór Soli Hanksa (HBSS), należy przygotować 1 l 1x HBSS z 10x bulionu (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) w podwójnie destylowanym H2O, dodać 0,35 g (4,2 mM) NaCHO3 i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca. Na każdą mysz wymagane będzie 105 ml tego roztworu (plus dodatkowe 5-10 ml w przypadku błędu pipetowania) w celu odizolowania wysp trzustkowych.
  3. Wyspy trzustkowe są bardzo podatne na uszkodzenia spowodowane hipoksyjnością, dlatego HBSS jest pęcherzykowany 95% O2 / 5% CO2 w celu naśladowania stężeń O2 we krwi. Można zakupić specjalne mieszanki gazów i stację bulgoczącą z pipetą Pasteura podłączoną do elastycznego wężyka. Po bulgotaniu wymaganej ilości HBSS z 95% O2 / 5% CO2 przez 15 minut, dodać 0,02% objętości BSA (albumina surowicy bydlęcej) klasy RIA i trzymać na lodzie przez pozostałą część izolacji wysp trzustkowych.
  4. Do przygotowania Ficoll odważyć 32,5 g Ficoll w zlewce o pojemności 400 ml, dodać 80 ml HBSS i mieszać z prędkością 500-700 obr./min przez 30 min. Po rozpuszczeniu wlej roztwór Ficoll do 250 ml cylindra z podziałką i dodaj HBSS do oznaczenia 130 ml na cylindrze z podziałką, aby uzyskać 25% roztwór Ficollu. Przykryj górną część cylindra z podziałką dwiema porcjami Parafilm® M (Pechiney Plastic Packaging Company, Chicago, IL) i energicznie wstrząśnij kilka razy.
  5. Aby uzyskać 23%, 20,5% i 11% roztwór Ficoll, dodaj odpowiednio 27,6, 24,6 i 13,2 ml 25% Ficoll do 50 ml stożkowych probówek. Następnie doprowadzić każdy roztwór do łącznej objętości 30 ml za pomocą HBSS i dobrze wstrząsnąć, aby wymieszać. Wszystkie cztery roztwory Ficoll należy przechowywać w temperaturze 4 °C i są one dobre do 2 tygodni.
  6. Roztwór kolagenazy, który jest odpowiedni do izolowania aktywnych wysp trzustkowych, przygotowuje się z kolagenazy wyizolowanej z Clostridium histolyticum (tabela materiałów). Każda partia musi zostać przetestowana pod kątem skuteczności enzymów. Zazwyczaj kolagenazę stosuje się w dawce 0,3-0,5 mg na ml HBSS. Wykorzystując stężenia enzymów w tym zakresie (zwykle 3 różne stężenia), określ jakość i ilość izolowanych wysepek od myszy lub rodzeństwa z miotu w tym samym wieku, aby ustawić stężenie enzymu roboczego.
  7. Po ustaleniu prawidłowego stężenia każda mysz potrzebuje 35 ml kolagenazy w HBSS na cały protokół izolacji. Zakręć kolagenazą w HBSS, aby się rozpuściła. Bezpośrednio przed zabiegiem należy wstępnie załadować strzykawkę o pojemności 5 ml roztworem kolagenazy, założyć kaniulę i usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie pozostawić na lodzie do czasu, aż będzie to potrzebne.
  8. Pożywką do hodowli wysp trzustkowych do inkubacji O/N jest uzupełniona pożywka RPMI 1640. W celu uzyskania roztworu podstawowego rozpuścić jedną paczkę RPMI 1640 (Gibco, Nowy Jork) w 1 l podwójnie destylowanegoH2Oi dodać 1,19 g HEPES (5 mM) i 2 g NaCHO3 (24 mM). Ustawić pH na 7,4, przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.
  9. W przypadku pożywek uzupełniających należy dodać odpowiednio 10% FBS i 100 j.m./100 μg/ml penicyliny/streptomycyny do podstawowych pożywek RPMI 1640. Jeśli pożądane jest inne stężenie glukozy, można użyć pożywki RPMI 1640 bez glukozy i dodać określone stężenie glukozy.
  10. W przypadku podstawowego buforu wodorowęglanowego Krebs Ringer (Krebs) dodaj następujące składniki do podwójnie destylowanej wody o następujących stężeniach: NaCl (118,41 mM), KCl (4,69 mM), MgSO4 (1,18 mM), KH2PO4 (1,18 mM) , NaCHO3 (25 mM), HEPES (5 mM) i CaCl2 (2,52 mM) przy pH 7,4. CaCl2 należy dodać jako ostatni, a roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
  11. Aby przygotować zapas roboczy Krebsa, najpierw gaz o zawartości 95% O2/182 5% CO2 przez 10-15 minut za pomocą pipety Pasteura w temperaturze 37 °C, a następnie dodać 0,5% objętościowo BSA klasy RIA. Następnie dodaje się glukozę do pożądanego stężenia do testu in vitro.

2. Przygotowanie narzędzi

  1. Lekko stępić końcówki igieł 30 i 27 G za pomocą kamienia do ostrzenia, aby zaokrąglić ostry koniec. Umieść zgięcie igły pod kątem 45 stopni około 1/4 cala od końcówki za pomocą szczypiec. Uważaj, aby nie ściskać zbyt mocno, co spowoduje zamknięcie wewnętrznej średnicy igły.
  2. Przetnij jedwabną nić do szwów 3/0 na około 4-calowe długości, po jednej na każdą mysz.
  3. Przykryj podstawę mikroskopu preparacyjnego folią i taśmą w dół.
  4. Wytnij kilka kawałków chłonnego papieru ławkowego o wymiarach około 3 x 5 cali, po co najmniej 2 na mysz.

3. Przygotowanie myszy

  1. Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml 1 ml leku Avertin.
  2. Roztwór awertyny wstrzyknąć dootrzewnowo w ilości około 40 μl/gram masy ciała.
  3. Gdy mysz przestanie reagować na szczypanie ogona lub tylnej łapy, ostrożnie przenieś ją do stanowiska roboczego mikroskopu preparacyjnego.
  4. Trzymając mysz w pozycji leżącej na plecach i głowę skierowaną dystalnie, spryskaj ją 70% wodnym roztworem etanolu. Upewnij się, że używasz odpowiedniej ilości 70% etanolu, aby ograniczyć ilość sierści w odsłoniętej jamie klatki piersiowej.

4. Otwieranie klatki piersiowej

  1. Uszczypnij futro i skórę myszy między dwiema tylnymi nogami i wykonaj wstępne cięcie przez naskórek, skórę właściwą i znajdującą się pod nią błonę.
  2. Nadal szczypiąc skórę i leżącą pod nią błonę, tnij w kierunku przedniej kończyny po obu stronach myszy, uważając, aby nie przeciąć żadnych narządów wewnętrznych.
  3. Zawiń płat skóry i błony na klatkę piersiową i usuń wyrostek mieczykowaty, aby umożliwić łatwiejszy dostęp do trzustki w celu napompowania.
  4. Zmień orientację myszy z głową skierowaną proksymalnie i przesuń narządy wewnętrzne w kierunku prawej strony stanowiska pracy, aby odsłonić zstępującą aortę.
  5. O ile nie ma potrzeby pobrania tkanki krwi, aorta zstępująca może zostać przecięta w celu całkowitej eutanazji. Wchłoń nadmiar krwi za pomocą papieru stołowego lub Kimwiste, aby uzyskać łatwiejszy dostęp do wspólnego przewodu żółciowego.

5. Nadmuchiwanie trzustki

  1. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego zmień położenie jelita cienkiego tak, aby wspólny przewód żółciowy tworzył prostopadłą linię z głową myszy.
  2. Weź kleszcze i chwyć jelito cienkie i znajdź zwieracz Oddiego (zwieracz bańki) na końcu wspólnego przewodu żółciowego, który wychodzi na jelito cienkie z przewodu żółciowego, tworząc biały trójkąt na jelicie różowym. Po zlokalizowaniu zwieracza Oddiego weź kleszcze Dumonta #5 i wsuń końcówkę pod wspólny przewód żółciowy jak najbliżej jelita cienkiego, uważając, aby nie przebić kanału.
  3. Po przekłuciu jelita cienkiego i tkanki łącznej użyj końcówki kleszczy Dumonta, aby chwycić szew i wciągnąć go pod wspólny przewód żółciowy. Zawiąż wspólny przewód żółciowy jak najbliżej zwieracza Oddiego, upewniając się, że węzeł jest napięty, aby zapobiec wyciekowi.
  4. Chwyć oba końce szwu i pociągnij w kierunku ogona, aby wywrzeć pewne napięcie na wspólny przewód żółciowy. Wolną ręką wykonaj małe nacięcie mikronożyczkami w wspólnym przewodzie żółciowym tuż nad ostatnim rozwidleniem do wątroby. Uwaga: Ważne jest, aby nie ciąć zbyt blisko zwieracza Oddiego, ponieważ może to spowodować częściowe napompowanie trzustki i uniknąć przecinania wspólnego przewodu żółciowego, ponieważ spowoduje to również słabe napompowanie.
  5. Trzymając dwa końce sznurka z napiętym wspólnym przewodem żółciowym, wyjmij strzykawkę/kaniulę, która została wstępnie załadowana 5 ml roztworu kolagenazy z wiadra na lód, odłóż strzykawkę i włóż igłę 30 G do przeciętego wspólnego przewodu żółciowego, uważając, aby nie przebić przez ściankę kanału. Jeśli igła 30 G nie jest wystarczająco szeroka, aby przewód żółciowy tworzył wokół niej uszczelkę, należy ją usunąć i zastąpić igłą igłą 27 G.
  6. Trzymając igłę na miejscu, zwolnić szew i podnieść strzykawkę o pojemności 5 ml. Powoli wcisnąć tłok strzykawki. Uwaga: Jeśli igła została pomyślnie wprowadzona do wspólnego przewodu żółciowego, rozszerzy się.
  7. Kontynuuj powolne wciskanie tłoka i wypuszczanie go w sposób pulsacyjny, aż pierwsza część trzustki napełni się, a następnie delikatnie i stale naciskaj, aż trzustka przestanie się napełniać. Uwaga: Większość trzustek utrzymuje 3-5 ml przed rozpoczęciem wycieku. Ponadto udana inflacja będzie miała równomierne rozłożenie tkanki zewnątrzwydzielniczej, a część trzustki na szczycie żołądka zostanie napompowana.
  8. Wyjąć igłę ze wspólnego przewodu żółciowego i odsunąć się na bok.

6. Usunięcie trzustki

  1. Weź kleszcze w jedną rękę, a zakrzywione nożyczki w drugą. Za pomocą kleszczy chwyć jelito cienkie przy zwieraczu Oddi. Przy zamkniętych nożyczkach użyj końcówki, aby oddzielić część trzustki od jelita cienkiego.
  2. Rozłóż nożyczki, aby poszerzyć szczelinę między jelitem cienkim a trzustką.
  3. Umieść literę "V" nożyczek w miejscu, w którym jelito cienkie i trzustka łączą się ze sobą po prawej stronie właśnie wykonanej szczeliny. Za pomocą kleszczy delikatnie przeciągnij jelito cienkie obok nożyczek, aby usunąć trzustkę.
  4. Kontynuuj pracę w dół jelita cienkiego do różowej tkanki łącznej. W tym momencie podnieś jelito cienkie w pobliżu miejsca, w którym przyczepia się do żołądka i odetnij trzustkę od reszty jelita cienkiego. Uwaga: Uważaj, aby nie przeciąć trzustki, ponieważ może zacząć opróżniać się.
  5. Delikatnie chwyć kleszczem część trzustki przyczepioną do brzucha (najlepiej sprawdzają się kleszcze płaskie). Delikatnie ciągnąc za trzustkę, użyj zakrzywionych nożyczek, aby odciąć połączenia między trzustką a żołądkiem.
  6. Zlokalizuj śledzionę i przytrzymaj ją kleszczami nad trzustką. Weź zakrzywione nożyczki i odetnij połączenia między śledzioną a trzustką.
  7. Znajdź miejsce, w którym trzustka jest przyczepiona do jelita grubego. Podnieś jelito grube kleszczami i użyj końcówki nożyczek, aby się przebić. Rozłóż nożyczki tak jak poprzednio, aby wytworzyć szczelinę między jelitem grubym a trzustką.
  8. Przytrzymaj jelito grube kleszczami: spowoduje to odpadnięcie trzustki, odsłaniając jej precyzyjne połączenia z jelitem grubym. Odetnij pozostałe połączenia.
  9. Znajdź różową tkankę łączną przyczepioną do trzustki i jelita cienkiego i przetnij jak najbliżej trzustki. Uwaga: Jeśli przekłucie trzustki jest problemem, zaleca się cięcie bliżej jelita cienkiego, ponieważ tkanka łączna zostanie odfiltrowana w późniejszych krokach.
  10. Chwyć jak najwięcej trzustki i delikatnie ją unieś. Zakrzywionymi nożyczkami odetnij pozostałe połączenia między trzustką a klatką piersiową, aby całkowicie usunąć trzustkę. Uwaga: Trzustka powinna być nadal napompowana, jeśli zostanie prawidłowo usunięta.
  11. Przechowuj usuniętą trzustkę w ~ 2,5 ml roztworu kolagenazy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml na lodzie, aż wszystkie inne trzustki zostaną napompowane i usunięte do eksperymentu.

7. Mycie

  1. Weź wszystkie wyizolowane trzustki i przenieś je do oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml, z których każda zawiera 25 ml świeżego roztworu kolagenazy
  2. Umieścić stożkowe probówki o pojemności 50 ml pionowo w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, która może oscylować z prędkością 220-250 obr./min, przy wyłączonej wytrząsarce.
  3. Gazować każdą stożkową probówkę o pojemności 50 ml roztworem 95% O2/5% CO2 przez 5 minut za pomocą pipety Pasteura.
  4. Szczelnie zamknij każdą rurkę i umieść bokiem w trzęsącej kąpieli wodnej pod powierzchnią wody. Wstrząsaj z prędkością 220-250 obr./min przez 20 sekund, co drugą minutę, do 16 minut, zaczynając od min 6. (Wstrząsaj po 6, 8, 10, 12, 14 i 16 minutach)
  5. Natychmiast przenieś probówki do wirówki w temperaturze pokojowej w celu szybkiego odwirowania. Doprowadzić wirówkę do 1 500 obr./min (400-500 g) i natychmiast wyłączyć.
  6. Za pomocą pułapki próżniowej odessać około 22,5 ml roztworu kolagenazy, nie naruszając osadu. Przemyć 10 ml HBSS i delikatnie przemieszać, aby rozbić granulkę.
  7. Wykonaj kolejne szybkie wirowanie w temperaturze pokojowej do 1 500 obr./min (400-500 g).
  8. Odessać około 10 ml roztworu, ponownie nie naruszając osadu.
  9. Umyj kolejnymi 10 ml lodowatego HBSS i delikatnie zwiruj, aby ponownie rozbić osad. Powtórz szybkie wirowanie i odessaj 10 ml roztworu.
  10. Delikatnie rozmieszać osad w pozostałych 2,5 ml roztworu HBSS. Wlać roztwór przez siatkę 1 000 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Spowoduje to usunięcie dużych resztek tkanki, które nie zostały strawione przez kolagenazę.
  11. Opłucz starą stożkową probówkę o pojemności 50 ml 2,5 ml lodowatego HBSS. Za pomocą pipety Pasteura dokładnie wypłukać boki probówki przed przeniesieniem 2,5 ml HBSS przez siatkę do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  12. Wykonaj kolejne szybkie wirowanie w temperaturze pokojowej z prędkością 1,500 obr./min (400-500 g), aby ogarnąć tkankę.
  13. Zassaj cały HBSS, przechylając rurkę w kierunku pułapki próżniowej. Uwaga: Bardzo ważne jest, aby nie naruszać granulki, ponieważ spowoduje to utratę wysepek. Jeśli osad jest luźny lub zaczyna przemieszczać się w kierunku pułapki próżniowej, należy przerwać zasysanie roztworu i ponownie zagnieździć tkankę, a następnie kontynuować zasysanie pozostałego roztworu.
  14. Po usunięciu całego HBSS dodaj 4,8 ml 25% roztworu Ficoll i przemieszaj, aby rozbić osad.
  15. Ostrożnie nałożyć 2,4 ml 23% roztworu Ficollu na 25% roztwór Ficollu, dodając 23% roztwór Ficollu z boku 50 ml stożkowej probówki. Aby zapewnić równomierne nakładanie warstw, podczas dodawania roztworu Ficoll należy obrócić stożkową rurkę o pojemności 50 ml.
  16. Powtórz proces nakładania warstw dla 20,5%, a następnie 11% roztworów Ficoll. Uwaga: Jeśli nie ma 4 odrębnych warstw, dodaj HBSS do oznaczenia 50 ml i odwróć probówkę 4-6 razy lub do momentu, gdy gradient Ficoll przestanie istnieć. Ponownie otocz tkankę i spróbuj ponownie wykonać kroki 7.14-7.16.
  17. Obracać stożkową probówkę o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej przy prędkości 1 820 obr./min (800 g) przez 15 minut.
  18. Wlej cały Ficoll do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, uważając, aby pozostawić osad tkanki zewnątrzwydzielniczej. Dodaj lodowaty HBSS do oznaczenia 50 ml i odwróć probówkę 4-6 razy, aby wymieszać Ficoll i HBSS razem.
  19. Obracać stożkową probówkę o pojemności 50 ml w temperaturze obrotowej 1 820 obr./min (800 g) przez 5 minut.
  20. Ostrożnie odessać większość mieszaniny HBSS/Ficoll za pomocą pułapki próżniowej. Nie należy naruszać granulatu, ponieważ jest on luźny i można go łatwo zassać.
  21. Weź pipetę Pasteura i przenieś osad do jednorazowej probówki hodowlanej.

8. Wybieranie wysepek

  1. Dodać 5 ml pożywki do pobierania (tj. uzupełnionego RPMI 1640 lub buforu wodorowęglanowego Krebsa Ringera) do jednorazowej probówki hodowlanej. Uwaga: Nośniki do kompletacji będą się różnić w zależności od dalszych zastosowań.
  2. Pozwól wysepkom osiąść na dnie probówki hodowlanej przez 5 minut. Przenieś je za pomocą pipety Pasteura na polistyrenową szalkę Petriego o wymiarach 15 mm na 60 mm. Uwaga: Ważne jest, aby używać szalki Petriego, ponieważ nie są one poddawane obróbce i zapobiegną przyleganiu wysepek do szalki.
  3. Na oddzielnej polistyrenowej szalce Petriego o wymiarach 15 mm na 60 mm dodać 5 ml pożywki do hodowli mysich wysp trzustkowych (100 ml pożywki podstawowej RPMI 1640, 10 ml inaktywowanego termicznie FBS, 1 ml wstrzykiwacza/paciorkowca; filtr wysterylizowany).
  4. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego z funkcją podświetlenia użyj pipety P-20, aby pobrać wysepki na szalkę Petriego zawierającą pożywkę do hodowli wysp trzustkowych, uważając, aby uniknąć przenoszenia resztek tkanki groniastej. Po podświetleniu wysepki będą brązowo-złote, a ich zewnętrzna błona może błyszczeć, podczas gdy tkanka groniasta będzie wydawać się jasnoszara i matowa. Jeśli preparat z wysepek zawiera dużą ilość zanieczyszczeń, zaleca się ręczne zbieranie wysepek dwukrotnie na świeże podłoże. Zmniejszenie zanieczyszczenia szczątkami ograniczy zbrylanie się wysp trzustkowych po całonocnej inkubacji. Dodanie DNAzy (3000 U/ml) do buforu trawiennego może również pomóc w ograniczeniu zlepiania się wysp trzustkowych (J.W.J., obserwacja osobista). Uwaga: Ważne jest, aby policzyć liczbę odizolowanych wysepek w celu zaplanowania dalszych eksperymentów.
  5. Inkubować wysepki O/N w inkubatorze ustawionym na temperaturę 37 °C z 5% CO2 .

9. Test cAMP

  1. Oznaczyć 1,7 ml probówek do mikrofuge, po jednej dla każdej kontrpróby testu. Uwaga: Testy cAMP powinny mieć co najmniej duplikaty dla każdego warunku leczenia, ale preferowanych jest więcej powtórzeń na leczenie.
  2. Po zagazowaniu buforu wodorowęglanowego Krebsa Ringera przez 15 minut 95% O2/5% CO2 za pomocą pipety Pasteura, dodać 0,5% BSA klasy RIA i końcowe stężenie glukozy 1,7 mM (roztwór preinkubacyjny). Następnie dodaj 1 ml świeżo zagazowanego Krebsa do każdej probówki do mikrofuge. Wymagane są dwa ml Krebsa na probówkę dla punktów czasowych wstępnej inkubacji i poddawania działaniu substancji; Zaleca się jednak przygotowanie co najmniej 5-10 ml więcej.
  3. Zakręcić wysepkami do środka szalki Petriego i za pomocą pipety P-20 ręcznie pobrać wysepki na nową polistyrenową szalkę Petriego o wymiarach 15 mm na 60 mm zawierającą 5 ml roztworu preinkubacyjnego w celu wypłukania pożywki zawierającej glukozę z wysepek.
  4. Zastosowany zestaw testowy cAMP to GE Healthcare cAMP Direct BioTrak EIA. Zastosowany prokokol jest modyfikacją tego opisanego dla "Wewnątrzkomórkowego pomiaru cAMP przy użyciu procedury EIA bez acetylacji z nowymi odczynnikami do lizy" i został zoptymalizowany do stosowania z minimalną liczbą wysp trzustkowych na probówkę, co pozwala na zwiększenie liczby warunków leczenia i kontrprób technicznych. Za pomocą pipety P-20 przenieść co najmniej 13 wysepek do każdej probówki z kroku 9.2, utrzymując jednolitą wielkość wysepek między probówkami, z 1 ml buforu do wstępnej inkubacji. Uwaga: Zwiększenie liczby powtórzeń jest korzystniejsze niż liczba wysepek na probówkę. Jeśli jednak jest wystarczająco dużo wysepek, aby równomiernie zwiększyć liczbę wysepek na probówkę, zaleca się to zrobić, do 25-50 wysepek na rurkę.
  5. Przy otwartych nakrętkach probówki do mikrofuge przenieść do inkubatora o temperaturze 37 °C ustawionego na 5% CO2 i inkubować przez 45 minut, aby znormalizować wydzielanie insuliny we wszystkich wyspach trzustkowych do poziomu wyjściowego.
  6. Podczas inkubacji próbek należy przygotować zabiegi (tj. 8 mM, 11,1 mM, 16,7 mM glukozy itd.) w gazowanych Krebsach z kroku 9.2 w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml, dodając 1 ml w celu uwzględnienia ewentualnych błędów pipetowania. Dodać 3-izobutylo-1-metyloksantynę (IBMX) do końcowego stężenia 200 μM. IBMX jest ogólnym inhibitorem fosfodiesterazy, który blokuje degradację cAMP, umożliwiając gromadzenie się cAMP w komórce podczas jego wytwarzania. (Uwaga: Jest to prawdziwy test produkcji cAMP. Zapoznaj się z sekcją dyskusji, aby zapoznać się z przykładami, w których pomiar produkcji cAMP może nie być pożądany. Jeśli IBMX zostanie pominięty w teście, potrzeba więcej wysepek na probówkę, aby uzyskać dane cAMP w zakresie liniowym krzywej wzorcowej).
  7. Po 45-minutowej wstępnej inkubacji wyjąć probówki do mikrofuge z inkubatora, nasadkę i wir pulsacyjny każdej próbki (mniej niż 0,5 sekundy). Ma to na celu wymieszanie gradientu insuliny, który prawdopodobnie został wygenerowany w wyniku koncentracji wysepek na dnie rurki. Należy uważać, aby nie wirować zbyt mocno, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na stabilność wysepek (Uwaga: Zamknięte rurki z wysepkami mogą być delikatnie przesuwane lub odwracane, jeśli nie jest możliwe delikatne wirowanie pulsacyjne. Opcje te dodadzą czas do testu, który należy wziąć pod uwagę przy planowaniu eksperymentu).
  8. Przenieś każdą probówkę do wirówki stołowej (RT) i wiruj, aż wysepki osiągną 10 000 obr./min (7 000-7500 g), a następnie natychmiast wyłącz.
  9. Użyj pipety P-1000, aby usunąć większość Krebsa z każdej probówki do mikrofuge, pozostawiając około 10-15 μl Krebsa na osadce wysepki. Użyj pipety P-20, aby usunąć część znajdującą się najbliżej osadu z wysepki. Jeśli osad zostanie zakłócony, odpipetuj Krebsa z powrotem do probówki i ponownie odwiruj.
    (Uwaga: Jeśli eksperymentator uzna, że usunięcie wszystkich Krebsów z osadu wysepek bez jego naruszenia jest zbyt trudne, ostatnie 10-15 μl można pozostawić i uwzględnić w całkowitej objętości w dalszej części protokołu.
  10. Uzyskać odpowiednią ilość ciekłego azotu w izolowanym pojemniku, aby natychmiast zamrozić próbki po inkubacji.
  11. Wyjmij próbki z inkubatora, nakryj, szybko odwiruj (mniej niż 0,5 sekundy), zakręć probówkami do mikrofuge w wirówce stołowej (RT) do 10 000 obr./min (7 000-7500 g), a następnie natychmiast wyłącz. Jeśli insulina lub inny metabolit jest pożądanym zastosowaniem w dalszej kolejności, należy użyć pipety P-1000, aby zebrać porcję pożywki w probówce do mikrofuge i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszej analizy. Jeśli pożywka stymulująca nie jest pobierana, można ją wyrzucić.
    (Uwaga: IBMX jest silnym wzmacniaczem wydzielania insuliny stymulowanej glukozą (GSIS). W związku z tym wyniki GSIS uzyskane z pożywki stymulacyjnej cAMP mogą nie odzwierciedlać dokładnie prawdziwego wpływu określonych zabiegów na GSIS, zwłaszcza jeśli efekty te są subtelne).
  12. Powtórz krok 9.9, aby usunąć jak najwięcej podłoża stymulacyjnego bez naruszania osadu na wyspie trzustkowej. Zamroź osadkę wysepkową w ciekłym azocie, gdy na osadzie wysepki pozostało mniej niż 10-15 μl Krebsa. Po zamrożeniu wszystkich próbek przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu pomiaru cAMP.
  13. W dniu oznaczenia cAMP należy przygotować nowe odczynniki do lizy zgodnie z protokołem producenta. Dodaj 200 ml odczynnika do lizy 1B do każdej probówki do mikrofuge i wiruj z maksymalną prędkością przez 30 sekund. Pozostaw probówki na lodzie na 10 minut, wirując co 2 minuty przez 30 sekund (Uwaga: Protokół zaleca przeprowadzenie analizy mikroskopowej z błękitem trypanowym, aby zapewnić lizę komórek, ale nie jest to wykonywane w przypadku wysp trzustkowych).
  14. Przygotuj normy robocze i ustaw mikropłytkę EIA dokładnie tak, jak opisano w protokole producenta. Po inkubacji substratu enzymatycznego z mikropłytką przez 30 minut, należy wykonać opcjonalny etap kwasu siarkowego 1,0 M i określić absorbancję studzienek mikropłytki przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
  15. Cykliczne wyniki AMP będą rejestrowane jako fmol/well. Wartość tę należy znormalizować do całkowitej objętości pierwotnej próbki (200 μl + wszelkie pozostałości Krebsa pozostawione na wysepkach z kroku 9.9). Następnie wyniki można znormalizować do całkowitej liczby wysp trzustkowych, uzyskując fmol cAMP wytworzony / wyspę, lub próbki lizatu można poddać testowi białkowemu kwasu bicinchoninowego (BCA) w celu znormalizowania wyników do całkowitego białka komórkowego (dając białko fmol / μg). Ta ostatnia metoda jest zalecana, gdy rozmiary wysepek są niespójne między próbkami i może być substytutem wielkości wysepek. Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA został z powodzeniem wykorzystany w tym protokole i wymaga tylko 25 ml próbki. Wzorce BSA należy przygotować w odczynniku do lizy 1B z zestawu do oznaczania cAMP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zapewnić wysoką wydajność izolacji wysepek, należy ściśle przestrzegać technik chirurgicznych opisanych w protokole. Chociaż zaprezentowane tutaj techniki zostaną dostosowane do warunków każdego laboratorium, istnieje kilka krytycznych kroków, które prowadzą do sukcesu izolacji. W celu łatwiejszego dostępu do wspólnego przewodu żółciowego zaleca się przesunięcie organów na prawą stronę myszy (Rysunek 1). Ponadto pozwoli to na nadmuchanie trzustawki przy mniejszym oporze, ponieważ mniejsza masa tkanek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przewiduje się, że cukrzyca dotknie 7,7% światowej populacji, dlatego konieczne jest opracowanie nowych technik badawczych, aby zarówno zrozumieć, jak i leczyć cukrzycę18. Obecna izolacja wysp trzustkowych jest dobrze ugruntowanym protokołem stosowanym do eksperymentów in vitro i została wcześniej przedstawiona z niewielkimi modyfikacjami11,14,16. Chociaż wydzielanie insuliny jest powszechnym zastosowaniem w izolowanych wyspach trzustkowych, skupienie się na składnikach znajdujących się pow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Renee L. Pasker i Harpreet K. Brar za fachową pomoc techniczną w zakresie protokołów opisanych w tej pracy. Ponadto chcielibyśmy podziękować za mentoring Christophera B. Newgarda z Duke University i Alana D. Attie z University of Wisconsin-Madison, wraz ze wsparciem ich członków laboratorium, którzy zapewnili nam czas i wsparcie niezbędne do optymalizacji opisanych protokołów. W szczególności dziękujemy Hansowi Hohmeierowi, Danhong Lu i Helenie Winfield z Newgard Laboratory oraz Mary Rabaglii z Attie Laboratory za owocne dyskusje i rady. Praca ta była wspierana przez grant NIH DK080845 i Juvenile Diabetes 594
Grant Fundacji Badawczej 17-2011-608 (dla M.E.K.)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolagenaza z Clostridium histolyticum odpowiednia do izolowania aktywnych wysepekSigma-AldrichC7657
Ficoll 400Sigma-AldrichF9378
Hanks Zrównoważony roztwór soli 10XInvitrogen (Gibco)14065-056
HEPESSigma-AldrichH3375
RPMI 1640 (proszek)Invitrogen (Gibco)31800-022
Albumina z surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA7888
3/0 Nić do szwów jedwabnychFine Science Tools18020-30
Kleszcze Dumont #5Narzędzia do nauki o naprawie11251-10
Kleszcze 0,8 mm   Narzędzia do nauki11050-10
Nożyczki zakrzywioneNarzędzia do nauki o naczyniu plastycznym14061-10
Vannas-Tü Nożyczki sprężynowe bingen - proste/ostre/8,5 cm/5 mm Krawędź tnącaFine Science Tools15003-08
Nożyczki preparacyjneFine Science Tools14002-14
5 ml BD Luer-Lok StrzykawkaBD309646
1 ml Strzykawka BD309628
30 G BD Igła 1/2" DługośćBD305106
27 G BD Igła 1/2" DługośćBD305109
Kamień do ostrzeniaFine Science Tools29008-01
2-2-2-tribromoetanolSigma-AldrichT48402-25G
2-metylo-2-butanolSigma-Aldrich240486-100mL
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS9888
Chlorek potasuSigma-AldrichP3911
Fosforan monopotasowy (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662
Wodorowęglan sodu (NaCHO3)Sigma-AldrichS6014
CaCl2· 2H2OSigma-AldrichC3881
MgSO4· 7H2OSigma-AldrichM9397
Penicylina-StreptomycynaInvitrogen (Gibco)15140-122
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (HI FBS)Fisher ScientificSH30088.03HI
3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)Sigma-Aldrich5879-100MG
pięknej

Bibliografia

  1. Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
  2. Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
  3. Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
  4. Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
  5. Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
  6. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
  7. Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
  8. Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
  9. Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
  10. Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
  11. Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
  12. Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
  13. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
  14. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
  15. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
  16. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
  17. Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
  18. Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
  19. Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
  20. Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
  21. Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
  22. Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
  23. Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
  24. Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
  25. Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
  26. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja wysepek trzustkowych myszytest immunoenzymatycznytrawienie kolagenazwirowanie w gradiencie g sto cipo ywka do hodowli wysepekstymulowana glukoz sekrecja insulinymyszy typu dzikiegomyszy z nokautem genu

Powiązane artykuły