Method Article

Wizualizacja i analiza cząsteczek mRNA z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ u Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/50382

⸱

June 14th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, 2Graduate Program in Quantitative and Computational Biology, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do liczenia mRNA w pojedynczych komórkach w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) pozwala na wykrycie kwasów nukleinowych w natywnym środowisku komórkowym. W tym miejscu przedstawiamy protokół użycia FISH do ilościowego określenia liczby mRNA w pojedynczych komórkach drożdży. Komórki mogą być hodowane w dowolnym stanie, a następnie utrwalane i przepuszczalne. Następnie do znakowania i wizualizacji mRNA wykorzystuje się wiele jednoniciowych deoksyoligonukleotydów sprzężonych z barwnikami fluorescencyjnymi. Fluorescencja ograniczona dyfrakcją z pojedynczych cząsteczek mRNA jest oznaczana ilościowo za pomocą algorytmu detekcji punktowej w celu identyfikacji i zliczenia liczby mRNA na komórkę. Podczas gdy bardziej standardowe metody kwantyfikacji północnych blotów, RT-PCR i mikromacierzy ekspresji genów dostarczają informacji na temat średnich mRNA w populacji masowej, FISH ułatwia zarówno zliczanie, jak i lokalizację tych mRNA w pojedynczych komórkach w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z technik pomiaru masowego, nie jest możliwe określenie liczby transkryptów lub aktywności transkrypcyjnej w pojedynczych komórkach1. Wykorzystanie białek fluorescencyjnych napędzanych przez promotory będące przedmiotem zainteresowania jako reporterów ekspresji genów może do pewnego stopnia rozwiązać ten problem, ale czas potrzebny do fałdowania białek fluorescencyjnych przesłania wczesną dynamikę. Długożyciowe białka fluorescencyjne również nie mogą zgłaszać czasu życia mRNA. Metoda FISH może być stosowana do oznaczania mRNA podczas jego pełnego cyklu życia, od inicjacji transkrypcji w jądrze po późniejsze dojrzewanie i rozpad w pojedynczych komórkach, z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki.

Oryginalne eksperymenty in situ do wizualizacji kwasów nukleinowych wykorzystywały znakowane radioaktywnie sondy RNA do badania elementów DNA. Obejmowały one wizualizację rybosomalnego DNA w jajnikach żaby Xenopus laevis 2 oraz satelitarnego DNA w tkance myszy3. W pierwszym eksperymencie fluorescencyjnym in situ wykorzystano cząsteczkę RNA oznaczoną fluoroforem do zbadania określonych sekwencji DNA4. Pierwszym zastosowaniem sond fluorescencyjnych do wizualizacji RNA in situ była wizualizacja ekspresji genu aktyny w hodowli tkanki mięśniowej kurczaka5. Niedawno, w pączkujących drożdżach, FISH został wykorzystany do zbadania oscylacji transkrypcji podczas cyklu metabolicznego drożdży6, rozpadu mRNA podczas progresji cyklu komórkowego7 oraz przestrzennej lokalizacji transkryptów mRNA podczas mitozy8. FISH został wykorzystany w drożdżach w celu wykazania, że nieskorelowane fluktuacje w konstytutywnie transkrybowanych genach, które stanowią ponad połowę wszystkich genów drożdży, wynikają z nieskorelowanej inicjacji transkrypcji9. U gatunków innych niż drożdże, FISH został wykorzystany do identyfikacji markerów komórek macierzystych w jelicie myszy10 i do ustalenia, że niepełna penetracja losów komórek może wynikać ze stochastycznych wahań ekspresji genów w zarodkach C. elegans 11.

Opisana tutaj metoda FISH polega na hybrydyzacji znakowanych barwnikiem, jednoniciowych sond DNA z wiadomościami mRNA. Komórki są obrazowane, a mRNA zliczane przy użyciu algorytmu wykrywania punktowego. Sondy jednoniciowe mogą być generowane za pomocą syntezatora DNA, a następnie znakowane (określane tutaj jako sondy Singera) lub zamawiane komercyjnie jako sondy wstępnie znakowane (sondy Stellaris)12,13. Główną różnicą między sondami Singera i Stellaris jest to, że sondy Singera są dłuższe (~50 pz) i są wielokrotnie znakowane, podczas gdy sondy Stellaris są krótkie (~20 pz) z tylko jedną etykietą na sondę, jak opisano przez Raja i wsp. 14. Dodatkowo, podejście Stellaris wykorzystuje znacznie więcej sond na gen niż w przypadku Singera (odpowiednio ~30 i 5 sond na gen). Poniżej przedstawiamy protokół, który opisuje użycie każdego typu sondy. W sekcji 2 przedstawiamy protokół znakowania sond zawierających amino-allilil-tymidynę wybranym barwnikiem Cy. Przegląd kroków obliczeniowych wymaganych do identyfikacji pojedynczych plamek mRNA znajduje się w sekcji 7.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunki 1 i 2 to schematy procedur eksperymentalnych FISH i potoku analizy obrazów używanych do ilościowego określania obrazów FISH.

1. Rozwiązania do przygotowania

*Poniższe rozwiązania są przeznaczone do użytku z sondami Singera. Jeśli używasz sond Stellaris, zastąp "40% formamidu" "10% formamidu" zarówno w buforze hybrydyzacyjnym, jak i buforze do mycia. Dodatkowe zmiany w buforze hybrydyzacyjnym podczas korzystania z sond Stellaris to (1) dodanie 1 g siarczanu dekstranu i (2) niezawieranie 10 mg ssDNA.

Bufor B

8 ml 1 M KH2PO4
41,5 ml 1M K2HPO4
109,3 g sorbitolu

Bufor sferoplastyczny

890 μl Bufor B
100 μl VRC
10 μl 25 000 U/ml Lyticase
2 μl β-merkaptoetanolu

Bufor hybrydyzacyjny (10 ml, objętość końcowa)

10 mg E. coli tRNA
10 mg ssDNA*
100 μl 200 mM VRC stock
40 μl 50 mg/ml BSA
1 ml 20X SSC
4 ml 40% formamidu*
Woda wolna od nukleaz (do 10 ml końcowej objętości)
1 g siarczanu dekstranu*

*Bufor hybrydyzacyjny może być przechowywany w porcjach o pojemności 0,5 ml w temperaturze -20 °C dla wygody.

Bufor do płukania (50 ml, objętość końcowa)

5 ml 20X SSC
20 ml 40% formamidu*
Woda wolna od nukleaz (do 50 ml końcowej objętości)

Bufor etykietowania

1.06 g Węglan sodu
100 ml DEPC Woda
Odczyn pH 9

2. Etykietowanie sondy (tylko sondy Singera)

Uzyskujemy te sondy poprzez wewnętrzną syntezę za pomocą aparatu do syntezy oligonukleotydów ABI. Zazwyczaj syntetyzuje się oligonukleotydy 4-5 ~ 50 pz, które są homologiczne do interesującego genu, zastępując amino-allililową tymidynę kilkoma tymidynami oddalonymi od siebie o co najmniej 8, najlepiej 10+ pz. Ze względu na ich wrażliwość na ozon, przy użyciu barwników CY pracujemy w zakładzie wolnym od ozonu.

  1. Zaopatrz się w ~5 sond i ponownie zanurz je w 100 μl wody - sprawdź stężenie na Nanodrop.
  2. W zależności od liczby sond/gen, połącz w sumie 10 μg oligonukleotydów/gen (np. jeśli masz 5 sond/gen, chcesz 2 μg/sondę).
  3. Użyj kolumn QIAquick do oczyszczania sond zgodnie z protokołem QIAquick Nucleotide Removal Kit Protocol.
  4. Dodaj 10 objętości buforu PN do całkowitej objętości połączonych sond i wymieszaj.
  5. Nanieść próbkę do kolumny QIAquick - jeśli całkowita objętość jest większa niż 750 μl, odwirować dwukrotnie, używając połowy objętości w każdym wirowaniu
  6. Odstawić na 1 min.
  7. Wirować 1 min przy 6 000 obr./min.
  8. Przemyć 750 μl buforu PE.
  9. Wirować 1 min przy 6 000 obr./min.
  10. Przepuścić kolumnę przepływową i ponownie wirującą przez 1 minutę przy 13 000 obr./min do wyschnięcia.
  11. Umieść kolumnę QIAquick w nowej probówce do mikrowirówek i wymyj DNA za pomocą 50 μlH2O- Upewnij się, że pHH2Omieści się w zakresie 7,0 i 8,5 i jest umieszczone bezpośrednio na membranie.
  12. Odstawić na 1 min.
  13. Wirować przez 1 minutę z prędkością 13 000 obr./min, aby wymyć DNA.
  14. Liofilizować DNA w temperaturze 45 °C.
  15. Zawiesić osad w 10 μl buforze do etykietowania i dodać do probówki z barwnikiem bez dotykania barwnika.
  16. Powtórzyć z kolejnym 10 μl buforu do etykietowania.
  17. Wiruj i odwiruj rurkę z barwnikiem i DNA.
  18. Przykryj probówki folią aluminiową i przechowuj w ciemności w temperaturze RT O/N do etykiety.
  19. Powtórz protokół zestawu do usuwania nukleotydów QIAquick. Występ z dwiema różnicami:
    - Dodać 200 μl buforu PN do sond i przepuścić oznaczone sondy przez kolumny 2x.
    - Wykonaj 3 prania z buforem PE, aby zmyć niezwiązany barwnik przed elucją.
  20. Po elucji uzyskać stężenie za pomocą nanokropli. Skuteczność znakowania wynosi zwykle ~0,25 pmol/ng jednoniciowego DNA.

3. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych

  1. Umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach w komorze próżniowej Plasma-preen (http://www.plasmapreen.com/) (im bliżej środka, tym lepiej).
  2. Umieść komorę próżniową w kuchence mikrofalowej i upewnij się, że jest szczelna.
  3. Najpierw włącz pompę, a następnie włącz podciśnienie dopiero po uruchomieniu pompy.
  4. Włącz kuchenkę mikrofalową i zatrzymaj się 5 sekund po wyświetleniu plazmy.
  5. Wyłącz podciśnienie, a następnie pompę.
  6. Wyciągnij komorę próżniową i usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszczy (te, które upadły, należy ponownie wyczyścić).
  7. Szkiełka nakrywkowe ułożyć oczyszczoną stroną do góry na płytkach 12-dołkowych.

4. Procedura utrwalania

  1. Hoduj drożdże do OD600 około 0,1-0,2 w minimalnej pożywce. 10 ml komórek wystarcza na ~10 oddzielnych hybrydyzacji.
  2. Dodać 1/10 objętości 37% formaldehydu bezpośrednio do pożywki wzrostowej (10 ml kultury + 1 ml 37% formaldehydu) i odstawić na 45 minut.
  3. Przemyć 2x 1 ml lodowatego buforu B w probówce mikrowirówki (może wirować z prędkością 13 000 obr./min przez 1 min).
  4. Dodać 1 ml buforu sferoplastycznego.
  5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Sprawdzać komórki co kilka minut pod mikroskopem, aż większość komórek stanie się (tzn. nie będzie miała jasności fazowej).
  6. Umyj 2x lodowatym buforem B, wirując z niską prędkością (~3,500 obr./min).
  7. Dodać 1 ml 70% EtOH, delikatnie zawiesić i pozostawić na noc w temperaturze 4 °C (można przechowywać w nieskończoność w temperaturze -20 °C).

5. Procedura hybrydyzacji

  1. Przygotować roztwór hybrydyzacyjny: do 100 μl buforu hybrydyzacyjnego dodać 1-3 μl sondy, następnie wirować i odwirować. Sondy Singera zużywają łącznie 8-10 ng na zestaw sond (tj. na gen). Zobrazowaliśmy do 3 genów jednocześnie za pomocą 3 różnych znakowanych zestawów sond.

Upewnij się, że roztwór hybrydyzacyjny został podgrzany do temperatury pokojowej przed jego otwarciem.

Dla sond Stellaris zaleca się rozpoczęcie 4 oddzielnych reakcji hybrydyzacji, dodając po 1 μl z 1:10, 1:20, 1:50 i 1:100 roboczych rozcieńczeń sond, aby zobaczyć, która z nich jest optymalna. Rozcieńczenia robocze sond Stellaris przygotowywane są w buforze hybrydyzacyjnym.

  1. Odwirować (dla wszystkich kolejnych etapów; 3 500 obr./min; 5 min) stałe komórki (np. 200 μl) i odessać etanol.
  2. Delikatnie zawiesić ponownie w 1 ml buforu do przemywania zawierającego ten sam procent formamidu co bufor hybrydyzacyjny. Odstawić na 2-5 minut.
  3. Odwirować próbkę i odessać bufor do płukania, a następnie dodać roztwór hybrydyzacyjny. Inkubować w ciemności, delikatnie wstrząsając, O/N w temperaturze 37 °C.

Uwaga: następująca procedura służy do nakładania/obrazowania komórek na szkiełkach nakrywkowych. Aby zapoznać się z myciem/obrazowaniem komórek na płytkach 96-dołkowych, w tym alternatywnym roztworem do usuwania reaktywnych form tlenu, patrz http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.

  1. Następnego dnia lub wcześniej wyczyść (patrz procedura) i potraktuj szkiełka nakrywkowe 150 μl 0,01% poli-L-lizyny przez 5 minut. Aspirować, pozostawić do wyschnięcia, przemyć 3xdH2O i pozostawić do wyschnięcia.
  2. Rano dodać 1 ml buforu do przemywania próbki, delikatnie zawiesić, odwirować i aspirować, a następnie ponownie zawiesić w kolejnym 1 ml buforu do przemywania i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  3. Umyć 2X SSC + 0,1% Triton X-100 w temperaturze RT 15 min na shakerze.
  4. Wyjmij podłoże montażowe z zamrażarki, aby przed zamontowaniem mogło osiągnąć temperaturę względną (RT).
  5. Umyć 1X SSC w temperaturze RT 15 min na shakerze.
  6. Rozcieńczyć DAPI do PBS (0,1 μg/ml final) i ponownie zawiesić komórki w 150 μl.
  7. Umieścić roztwór na oczyszczonych/nasączonych polilizem szkiełkach nakrywkowych na płytce 12-dołkowej; co najmniej 30 minut bez zakłóceń.
  8. Usunąć roztwór (można go umieścić na zapasowym szkiełku nakrywkowym jako kopię zapasową) i przemyć 3x 1 ml 1X PBS.
  9. Umieść 3 μl podłoża mocującego Prolong Gold na szkiełku podstawowym (Invitrogen P36934). Rób to pojedynczo, jeśli masz wiele szkiełek nakrywkowych, aby uniknąć wyschnięcia medium montażowego.
  10. Dodaj ~0,5 ml etanolu do szkiełka nakrywkowego na płytce 12-dołkowej, usuń szkiełko nakrywkowe i wysusz na powietrzu, trzymając pęsetą.
  11. Umieść szkiełko nakrywkowe komórką do dołu na podłożu montażowym i pozostaw do stwardnienia przez kilka godzin lub O/N w ciemności.
  12. Uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci i przystąp do obrazowania.

6. Obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu odwróconego Olympus IX-81 Przegląd

  1. Do pozyskiwania obrazów używamy oprogramowania Slidebook (intelligent-imaging.com) i obiektywu olejowego 100X, 1,45 NA, TIRFM. W przypadku szeregowego obrazowania GFP, DAPI, Cy3, Cy3.5 i Cy5: zestawy filtrów chrominancji (patrz odczynniki).
  2. Użyj filtru DAPI, aby znaleźć i skupić się na komórkach.
  3. Ustaw to jako punkt odniesienia.
  4. Wykonaj z-stos obrazów wokół punktu odniesienia, w którym całkowita odległość wynosi 5 μM przy rozmiarze 0,2 μM (25 płaszczyzn). Powtórz te czynności dla każdego kanału barwnikowego (tj. każdego zestawu sond).
  5. Eksport jako 16-bitowy plik TIFF w celu analizy obrazu.

7. Przegląd analizy obrazu (sondy Singera)

Poniżej przedstawiamy zarys metod obliczeniowych, których używamy do analizy obrazów FISH w MATLAB. Odpowiednie używane funkcje MATLAB są ujęte w nawiasy po prawej stronie. Algorytmy i progi są obecnie dostrojone do danych z sond w stylu Singera. Korzystanie z sond w stylu Stellaris będzie wymagało pewnych dostosowań, szczególnie w końcowym kroku filtrowania (7.8).

Identyfikacja komórki15

  1. Oddziel komórki od tła za pomocą globalnego progu na obrazach DAPI16 [graythresh].
  2. Identyfikuj jądra za pomocą rozszerzonej funkcji maksimów [imextendedmax].
  3. Segmentuj komórki za pomocą jąder jako zalążków algorytmu zlewni [zlewnia].

Znajdź plamki w każdym kanale fluorescencji

  1. Wykonaj transformację cylindra, aby znormalizować tło i poprawić stosunek sygnału do szumu [bwmorph].
  2. Znajdź maksima, aby zidentyfikować warstwę ostrości (w płaszczyźnie z) dla każdego punktu [imregionalmax].
  3. Filtruj potencjalne punkty za pomocą modelu dopasowania liniowego do gradientu radialnego.

Zmierz intensywność spotu i filtruj sygnały pojedynczej i wielokrotnej sondy

  1. Dopasuj profil Gaussa 2D do miejsca we wcześniej zidentyfikowanej warstwie ostrości i oszacuj intensywność17.
  2. Odfiltruj słabe punkty za pomocą progu (na podstawie histogramu). W przypadku sond typu Singer jest to ważne, ale w przypadku sond Stellaris jest to jeszcze mniejsze.
  3. Policz plamy w każdej komórce.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 3 pokazuje typowe histogramy obliczone na podstawie obrazów FISH i użyte do określenia liczby mRNA obecnych w pojedynczych komórkach. Ważną zaletą kwantyfikacji RNA opartej na mikroskopii jest to, że można uzyskać informacje na temat lokalizacji transkryptów. Na przykład użyliśmy FISH do identyfikacji mRNA w pojedynczych komórkach z indukowalnym allelem CBF1 (Figura 4). Ponieważ wiele cząsteczek mRNA jest obecnych w miejscu transkrypcji, jesteśmy w stanie zidentyfikować obecność i lokalizację miejsc transkrypcji w jądrze.

Używając różnych barwników do oznaczania mRNA różnych genów, można określić ilościowo wiele gatunków mRNA w tych samych komórkach. Aby to wykazać, komórki drożdży inkubowano w obecności czynnika α i sorbitolu. Transkrypcja FUS1 (barwnik Quasar670, czerwony) jest indukowana przez czynnik α. Transkrypcja STL1 (barwnik Quasar 570, zielony) jest indukowana przez wzrost osmolarności zewnątrzkomórkowej (ryc. 5). Rysunek 4 przedstawia przykład FISH z sondami Singera. Rysunek 5 przedstawia przykład FISH z sondami Stellaris.

figure-results-1
Rysunek 1. Schemat procedury doświadczalnej FISH. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

figure-results-2
Rysunek 2. Schemat potoku analizy obrazu. Ostatnie miejsca są wyznaczone na rysunku po prawej stronie.

figure-results-3
Rysunek 3. Histogram intensywności plamki dla określonego genu przy użyciu sond Singera. Intensywności sondy są obliczane zarówno wewnątrz (czerwone), jak i na zewnątrz (niebieskie) komórki. Punkty o niskiej intensywności to albo szumy, albo pojedyncze sondy. Prawdziwe wiadomości mRNA są oznaczane wieloma sondami. W przypadku korzystania z sond Stellaris, pojedyncze sondy są mniej wykrywalne, dlatego progi i filtrowanie muszą być odpowiednio dostosowane.

figure-results-4
Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki zabiegu Singer FISH. W tym eksperymencie transkrypcja CBF1 jest aktywowana za pomocą indukowalnego promotora18. Jądra są zabarwione na niebiesko za pomocą DAPI. MRNA CBF1 są znakowane sondami znakowanymi Cy3. Białe strzałki podkreślają obecność miejsc transkrypcji CBF1 w jądrze. Pojedyncze transkrypty mRNA są widoczne w cytoplazmie.

figure-results-5
Rysunek 5. Reprezentatywne wyniki zabiegu Stellaris FISH. Komórki drożdży MATa poddano jednocześnie działaniu czynnika α o stężeniu 30 ng / ml i 0,75 M sorbitolu przez 10 minut i jednocześnie badano pod kątem transkryptów FUS1 (Quasar 670, czerwony) i STL1 (Quasar 570, zielony). W podświetlonym polu widzimy, że jedna komórka reaguje tylko na feromon (miejsce startowe FUS1, kolor czerwony), a druga głównie reaguje na sorbitol (miejsce startowe STL1, kolor zielony).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tej pory metoda FISH była przede wszystkim metodą o niskiej przepustowości. Zastosowanie barwników Cy3, Cy3.5 i Cy5 ogranicza liczbę genów, które można badać w pojedynczych komórkach do trzech na raz. Opracowano kilka dodatkowych sond (Stellaris), ale liczba rozróżnialnych sond nadal wynosi co najwyżej siedem. Aby obejść to ograniczenie, zastosowano kombinatoryczne strategie znakowania przy użyciu wielu fluoroforów do tworzenia kodów kreskowych dla różnych gatunków mRNA19,20. Ostatnio Lubeck i Cai wykorzystali optyczne i spektralne kodowanie kreskowe do ilościowego oznaczania 32 różnych gatunków jednocześnie z FISH w pojedynczych komórkach drożdży19. Jednym z ograniczeń tego najnowszego podejścia kombinatorycznego jest to, że wymaga ono użycia mikroskopii superrozdzielczej. Analiza potrzebna do rozróżnienia sond z kodami kreskowymi jest również dość złożona.

Odkryliśmy, że Cy3 i Cy3.5 są lepsze od Cy5 w eksperymentach FISH. Jednym z ograniczeń barwnika Cy5 jest jego wrażliwość na fotowybielanie. Jednak Stellaris opracował ostatnio warianty Cy5, które są reklamowane jako bardziej odporne na fotowybielanie i mogą złagodzić ten problem techniczny. Warto również zauważyć, że FISH jest kosztowną metodą do wdrożenia i że zarówno sondy Singera, jak i Stellaris zazwyczaj kosztują 700 - 1000 USD za zestaw sond, chociaż ceny dostępnych na rynku sond powinny spaść w przyszłości. Oszczędność odczynników i wydajne etykietowanie sprowadza sondy Singer do niższego przedziału cenowego.

Jednym z głównych wyzwań technicznych jest rozdzielenie pojedynczych i wielu plamek sondy, co wymaga wdrożenia zaawansowanych algorytmów określania plamek. Może to wymagać obszernego ręcznego przeglądu w celu dostrojenia parametrów analizy obrazu do określonych konfiguracji eksperymentalnych. Zarys naszego potoku obliczeniowego z odpowiednimi funkcjami MATLAB znajduje się w sekcji 7 protokołu. Ten problem jest nieco złagodzony przez sondy Stellaris, które mają tylko jedną etykietę na sondę. W związku z tym wymaga kolokalizacji wielu sond, aby zobaczyć sygnał.

Ponieważ FISH wymaga utrwalania komórek, nie ułatwia śledzenia pojedynczych komórek w czasie. Wcześniej wykorzystaliśmy dane z migawki FISH, aby zrekonstruować dynamikę ekspresji genów w poszczególnych populacjach drożdży o cyklicznych cyklach metabolicznych6. Cykl metaboliczny obserwuje się w wcześniej wygłodzonych, ciągłych kulturach i charakteryzuje się zbiorowymi oscylacjami zużycia tlenu w całej populacji. Oscylacje te są związane z oscylacjami transkryptów obejmującymi cały genom, które występują dla połowy wszystkich genów drożdży w różnych fazach zużycia tlenu. Staraliśmy się ustalić, czy cykl metaboliczny był obecny w niezsynchronizowanych, ciągłych kulturach drożdży. Jeśli są obecne, transkrypty, które są antyskorelowane w populacjach synchronicznych, powinny być również antyskorelowane w niezsynchronizowanych pojedynczych komórkach i odwrotnie w przypadku skorelowanych transkryptów.

Aby zrekonstruować dynamikę produkcji mRNA w czasie, obserwowane dane migawkowe muszą zostać porównane z tym, czego oczekuje się od modelu podstawowego zachowania. Istnieją teoretyczne ograniczenia co do tego, kiedy takie "migawki" danych o ekspresji genów mogą być wykorzystane do określenia podstawowej dynamiki ekspresji genów i jakie rodzaje modeli można rozróżnić21. W przypadku danych dotyczących cyklu metabolicznego, zamiast bezpośrednio pokazywać obecność oscylacji czasowych, zaimplementowano pomiary statystyczne w celu udowodnienia, że rzeczywiście istnieje autonomiczny program oscylacyjny komórki zgodny z masowymi pomiarami mikromacierzy.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty GM046406 (dla D.B.) oraz przez National Institute of General Medical Sciences Center for Quantitative Biology (GM071508). R.S.M. dziękuje za finansowanie z NSF Graduate Research Fellowship. M.N.M. jest wspierany przez Lewis-Sigler Fellowship. Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Botstein za pomocne dyskusje oraz byłym członkom Allegrze Petti i Nikolaiowi Slavovowi za ich wkład w projekt cyklu metabolicznego. Dziękujemy Danielowi Zenklusenowi i Robertowi Singerowi za rozpoczęcie pracy z metodą FISH.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kompleks rybonukleozydów wanadyluNEBS1402S
LyticaseSigmaL5263
E. coli tRNARoche1010954001
BSA (bez RNazy)Ambion
Beta-mercapt– tanolFisher03446l
DAPI, dilactateSigmaD9564
PBS 10X (bez RNaz)AmbionAM9624
Triton X-100Shelton Scientific
Siarczan dekstranuSigmaD6001Lub równoważny
Sól fizjologiczno-sodowa (SSC) 20XVWR82021-484
Formamid (dejonizowany)AmbionAM9342
Woda wolna od nukleazAmbionAM9932
Alfa-D-glukozaSigma158968Do roztworu GLOX
1 M Tris-HCl, pH 8,0AmbionAM9855G
100% etanol
Oksydaza glukozowaSigmaG0543Do roztworu
KatalazaSigmaC3155Do roztworu GLOX
Concanavalin AMP Biomedicals150710
Polilizyna (0,01%)SigmaP8920
Szkiełka nakrywkoweWarner InstrumentsCs-18R15
Prolong Gold Medium montażoweInvitrogenP36934
QIAquick Zestaw do usuwania nukleotydów QIAGEN28304
FISH SondesBiosearch TechnologiesNiestandardowe zamówienie dla żądanej sekwencji mRNA
Szklane dno 96-dołkowe płytkiNunc265300Alternatywa dla szkiełek nakrywkowych
Płytki 12-dołkoweBD Falcon351143
Cy3, Cy3.5, Cy5 barwnikiGE Healthcaremonofunctional NHS-ester
WYPOSAŻENIE
Plasma-Preen I CleanerTerra Uniwersalnysterownik 9505-00(opcjonalnie Cat #9505-17)
Pompa próżniowaAlcatel205SDMLAMPlasma-Preen
OlympusIX81Lub równoważny
obiektyw 100XŹródło
X-CiteXCT 10-Alub równoważne
Zestawy filtrówChromaU-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.
Cooled CCD lub EMCCDHamamatsuC4742-98-24ER
GLOX Do obsługi szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego światła Olympus 1-UB617R

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  2. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 63, 378(1969).
  3. Jones, K. W. Chromosomal and Nuclear Location of Mouse Satellite DNA in Individual Cells. Nature. 225, 912(1970).
  4. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  5. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7331-7335 (1982).
  6. Silverman, S. J., et al. Metabolic cycling in single yeast cells from unsynchronized steady-state populations limited on glucose or phosphate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6946-6951 (2010).
  7. Trcek, T., Larson, D. R., Moldon, A., Query, C. C., Singer, R. H. Single-molecule mRNA decay measurements reveal promoter- regulated mRNA stability in yeast. Cell. 147, 1484-1497 (2011).
  8. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
  9. Gandhi, S. J., Zenklusen, D., Lionnet, T., Singer, R. H. Transcription of functionally related constitutive genes is not coordinated. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 27-34 (2011).
  10. Itzkovitz, S., et al. Single-molecule transcript counting of stem-cell markers in the mouse intestine. Nature Cell Biology. 14, 106-U193 (2012).
  11. Raj, A., Rifkin, S. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature. 463, 913-U984 (2010).
  12. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), 365-386 (2010).
  13. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
  14. Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
  15. Cell segmentation | Steve on Image Processing [Internet]. , The MathWorks, Inc.. Available from: http://blogs.mathworks.com/steve/2006/06/02/cell-segmentation/ (2006).
  16. Otsu, N. A Tlreshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).
  17. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
  18. McIsaac, R. S., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22, 4447-4459 (2011).
  19. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9, 743-U159 (2012).
  20. Levsky, J. M., Shenoy, S. M., Pezo, R. C., Singer, R. H. Single-cell gene expression profiling. Science. 297, 836-840 (2002).
  21. Wyart, M., Botstein, D., Wingreen, N. S. Evaluating Gene Expression Dynamics Using Pairwise RNA FISH Data. Plos Computational Biology. 6, (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence In Situ HybridizationmRNA QuantificationYeast CellsSingle Molecule DetectionFluorescence MicroscopySpot Detection AlgorithmProbe HybridizationCell PermeabilizationRNA LocalizationTranscription Analysis

Related Articles