Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Summary

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Abstract

Z chęcią zrozumienia wkładu wielu elementów komórkowych w rozwój złożonej tkanki; takich jak liczne typy komórek, które uczestniczą w regeneracji tkanki, tworzeniu guza lub unaczynieniu, opracowaliśmy wielobarwny model rozwoju nowotworu do przeszczepu komórkowego, w którym populacje komórek pochodzą od różnych fluorescencyjnie kolorowych myszy reporterowych i są przeszczepiane, wszczepione lub wstrzyknięte w rozwijający się guz i wokół niego. Te kolorowe komórki są następnie rekrutowane i włączane do zrębu guza. W celu ilościowej oceny komórek zrębu guza pochodzących ze szpiku kostnego, przeszczepiliśmy transgeniczny szpik kostny z ekspresją GFP do śmiertelnie napromieniowanych myszy z ekspresją RFP, zgodnie z aprobatą IACUC. Guzy jajnika, które zostały ortotopowo wstrzyknięte przeszczepionym myszom, zostały wycięte 6-8 tygodni po wszczepieniu i przeanalizowane pod kątem markera pochodzenia szpiku kostnego (GFP), a także markerów przeciwciał w celu wykrycia zrębu związanego z nowotworem za pomocą technik obrazowania wielospektralnego. Następnie dostosowaliśmy metodologię, którą nazywamy MIMicc - Multispectral Interrogation of Multiplexed cellular compositions, używając wielospektralnego rozmieszania fluorosond do ilościowej oceny, która znakowana komórka pochodziła z których populacji wyjściowych (w oparciu o oryginalne etykiety genów reporterowych), a wraz ze wzrostem naszej zdolności do rozmieszania 4, 5, 6 lub więcej widm na szkiełko, dodaliśmy dodatkową immunohistochemię związaną z liniami komórkowymi lub różnicowaniem w celu zwiększenia precyzji. Wykorzystując oprogramowanie do wykrywania kolokalizowanych sygnałów multipleksowanych fluorescencji, można śledzić, wyliczać i charakteryzować populacje zrębu guza na podstawie barwienia markerami. ¹

Introduction

Zrozumienie rozwoju i naprawy tkanek jest ważne dla wyjaśnienia składników komórkowych uczestniczących w gojeniu się ^ran,2,3 medycyny regeneracyjnej, biologii rozwojowej i biologii nowotworów. W warunkach naprawy wiele typów komórek infiltruje otaczające mikrośrodowisko, aby pomóc w unaczynieniu, odkładaniu ECM, proliferacji i restrukturyzacji tkanek. Czynniki i fenotypy komórkowe można zidentyfikować na podstawie wieloparametrowych, multipleksowanych markerów, które mogą określić lokalizację, stan różnicowania i interakcję między składnikami komórkowymi w badanym mikrośrodowisku. W tym artykule opisujemy rozwój guza jako prototypowy przykład tego wielokolorowego modelu przeszczepu wielokomórkowego, po którym następuje obrazowanie wielospektralne i metodologia rozmieszania spektralnego.

Progresja nowotworu to wieloetapowy proces, który charakteryzuje się kilkoma nabytymi zdolnościami, które obejmują zwiększoną proliferację, właściwości antyapoptotyczne, inwazyjne i angiogenne. ⁴ Rozwój guza jest ułatwiony przez komórki nienowotworowe, które są rekrutowane do otaczającego środowiska w celu dostarczenia czynników wzrostu, matryc strukturalnych, sieci naczyniowych i modulacji immunologicznej. ^1,5,6 To mikrosiedlisko składa się z komórek pochodzących z lokalnych, sąsiednich tkanek, takich jak tkanka tłuszczowa i naczynia krwionośne oraz odległych źródeł, takich jak komórki pochodzące ze szpiku kostnego ¹. Stopień włączenia komórek nienowotworowych zależy od zapotrzebowania ze strony guza, które często odpowiada stadium/stopniowi guza. Aby zrozumieć rolę mikrośrodowiska wspierającego nowotwór, należy zrozumieć pochodzenie i potencjał różnicowania populacji komórek nienowotworowych.

Ten protokół został zaprojektowany, aby pomóc w interpretacji progresji nowotworu poprzez wizualizację zarówno składników komórkowych pochodzących ze szpiku kostnego, jak i lokalnych komórek pochodzących z tkanek. Wykorzystując fluorescencyjne myszy transgeniczne z ekspresją genu reporterowego, przeszczepiliśmy szpik kostny GFP (białko zielonej fluorescencji) do śmiertelnie napromieniowanej myszy RFP (białko czerwonej fluorescencji). Po udanym przeszczepie szpiku kostnego syngeniczna linia komórek nowotworowych jest wstrzykiwana ortotopowo i pozostawiana do wszczepienia przez 4-8 tygodni. Powstały guz jest wycinany od myszy i przetwarzany do barwienia immunofluorescencyjnego (IF) w celu uwidocznienia składników zrębu. Multipleksowanie markerów IF jest powszechnie stosowaną techniką, która wiąże się ze znaczną optymalizacją^7-9, jednak użycie wielospektralnej platformy obrazowania/rozmieszania zwiększa potencjał kombinacji markerów fluorescencyjnych, które mają nakładanie się widmowe. W niniejszym artykule przedstawiamy technikę, którą nazywamy MIMicc - wielospektralne badanie multipleksowanych kompozycji komórkowych w celu barwienia i analizy do ośmiu markerów w sekcji guza na jednym szkiełku w celu analizy pochodzenia komórkowego, stanu różnicowania komórkowego i interakcji komórka-komórka składników w mikrośrodowisku guza. Ten uproszczony przykład może zostać rozszerzony w celu analizy pięciu, sześciu lub więcej markerów wykorzystujących przeciwciała lub wewnątrzkomórkową ekspresję fluorescencyjną sterowaną promotorem. W tabeli 1 wymieniono potencjalne kombinacje barwienia przeciwciałami fluorescencyjnymi z uwzględnieniem odpowiednich gatunków.

Protocol

Syngeneic Mysi Przeszczep Szpiku Kostnego (BMT) zatwierdzony przez instytucjonalne protokoły IACUC (Uwaga: Powodzenie tego protokołu wymaga wykorzystania dowolnego oznakowanego typu komórki jako celu do analizy wielospektralnej, a aby ułatwić dalszą analizę, można wykorzystać dowolne genetyczne lub stabilne znakowanie komórkowe. Sugerujemy, że każda komórka, tkanka lub narząd, który ma zostać zastosowany, może być zastosowany do modelu przeszczepu i że przeszczep może zawierać tyle unikalnych oznakowanych populacji, ile badania uznają za użyteczne. Dodatkowo, wieloznakowane systemy komórkowe, takie jak te znalezione u myszy transgenicznych zawierających populacje o ograniczonym pochodzeniu - znakowane fluorescencyjnie - mogą być zaprojektowane w celu wyeliminowania powikłań transplantacyjnych w celu badania pewnych stanów patologicznych.

1. Myszy biorcy BMT należy poddać śmiertelnemu napromienianiu pojedynczą dawką 9,5 Gy na cztery godziny przed rozpuszczeniem w szpiku kostnym dawcy. (Biorcy BMT GFP powinni być w wieku 6-10 tygodni).
2. Zwilż skórę myszy 70% etanolem przed przycięciem i obraniem z powrotem, aby odsłonić tylne kończyny sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi. Usuń całą nogę, w tym grzebień biodrowy w stawie krzyżowo-biodrowym. Odrzuć stopę, przecinając ją tuż nad kostką, a następnie dokładnie usuń wszystkie mięśnie, więzadła i nadmiar tkanki z kości. Przepłukać szpik z kości piszczelowej, strzałkowej i biodrowej za pomocą igły 23 G przy użyciu 2% sterylnego FBS w PBS (PBS-2). (Darczyńcy zapytania ofertowego BMT powinni zostać poświęceni zgodnie ze standardami instytucjonalnymi).
3. Pozostałą kość pokroić i delikatnie rozdrobnić na fragmenty za pomocą skalpela i kleszczy, a następnie umieścić w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 3 μg/ml kolagenazy I na 1 godzinę w temperaturze 37 °C przy 300 obr./min.
4. Uzupełnij probówkę PBS-2 i zbierz supernatant do świeżej probówki i połącz z przepłukanymi komórkami. Wirować z prędkością 250 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
5. Zawieś komórki w PBS-2 i przefiltruj przez filtr komórkowy 40 nm. W tym momencie komórki można oznaczyć do sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS), jeśli chce się manipulować określonymi populacjami dla BMT.
6. Zawieś 2 x 10⁶ komórek na 100 μl PBS na mysz. Za pomocą igły 29 G należy wstrzykiwać ogólnoustrojowo napromieniowanym myszom z GFP za pomocą ogona lub żyły zaoczodołowej skośnie do góry. Wstrzyknąć jednej myszy 100 μl PBS tylko jako kontrolę wszczepienia. Należy użyć lampy grzewczej do rozszerzenia naczyń krwionośnych przed wstrzyknięciem i użyć ogranicznika do wstrzykiwania żyły ogonowej po wstrzyknięciu. Przygotuj sterylną gazę, aby lekko uciskać końcówkę wtrysku.
7. Trzy tygodnie po BMT zbierz krew za orbitą i przeanalizuj ją za pomocą cytometrii przepływowej, aby potwierdzić obecność komórek krążących GFP i brak komórek krążących RFP. Mysz kontrolna umrze w tym momencie.

2. Wszczepienie guza zgodnie z wytycznymi IACUC

1. Hoduj mysie komórki nowotworowe jajnika ID8 in vitro przed wstrzyknięciem in vivo (1 x 10,⁶ komórek na mysz). W dniu wstrzyknięcia trypsynizować komórki, przemyć PBS i ponownie zawiesić w PBS w stężeniu 1 x 10⁶ komórek na 100 μl.
2. Wstrzyknąć komórki nowotworowe do jamy wewnątrzzacierowej myszy, igła powinna być skośnie skierowana do góry. Sterylizuj celownik iniekcyjny za pomocą 70% etanolu. Wstrzyknąć w lewy dolny lub prawy dolny kwadrant brzucha (czaszkowy i lekko przyśrodkowy do dolnego zestawu sutków brzusznych samicy myszy), unikając uderzania w narządy. Powstrzymaj mysz, chwytając za kark i przytrzymując ogon małym palcem lub serdecznym. Myszy można znieczulić izofluranem w tej procedurze.
3. Poświęć myszy, gdy widoczne są oznaki przeszczepu guza, takie jak lekkie wzdęcia brzucha. Nastąpi to w ciągu 4-12 tygodni.
4. Wyciąć guzy z jamy IP. Guzy w jamie będą wyglądać jak białe guzki na powierzchni narządów i wokół niej. Za pomocą skalpela usuń guzy i umieść w tubce/słoiku z 10% formaliną na 24-godzinne utrwalenie. Przygotowanie histologiczne można zlecić patomorfologii/histologii, jeśli odczynniki i materiały nie są łatwo dostępne do zatapiania parafiny i przygotowania szkiełek. Tkankę należy podzielić na plastry o wielkości 5-8 μm na szkiełkach podstawowych w celu przeprowadzenia kolejnych procedur barwienia.

3. Barwienie immunofluorescencyjne wieloparametrowe

1. Przygotuj szkiełka kontrolne pojedynczego koloru dla każdej sondy fluorescencyjnej użytej w eksperymencie. W tym scenariuszu używane są cztery kolory. Dlatego cztery szkiełka dla każdego koloru z osobna, a także jeden slajd do kontroli szumów tła i na koniec jeden slajd do pełnego barwienia kombinowanego. (Łączna liczba slajdów = 6) Wszystkie preparaty będą przetwarzane obok siebie w identyczny sposób, aby zminimalizować różnice eksperymentalne.
2. Piec odcinki parafiny w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę.
3. Umyj szkiełka 3x 10 min w ksylenie.
4. Mycie 2x 5 min 100% etanolu.
5. Mycie 1x 3 min 95%etanol
6. Umyć 1x 2 min90% etanolu.
7. Umyć 1x 2 min70% etanolu.
8. Umyć 1x 2 min w wodzie. Powoli zanurzaj stojak do barwienia w wodzie i wyjmuj go z wody 10 razy.
9. Podczas ostatniej serii prania gotuj wstępnie bufor cytrynianu sodu przez 2 minuty (kuchenka mikrofalowa na wysokich obrotach). (Może zostać zastąpiony buforem tris-EDTA w zależności od stosowanych przeciwciał)
10. Gotuj szkiełka przez 20 minut w buforze cytrynianu sodu (kuchenka mikrofalowa na 10% mocy lub w szybkowarze). Jeśli bufor się zagotuje, wyłącz kuchenkę mikrofalową i odstaw na bok.
11. Zdjąć ze źródła ciepła i pozostawić szkiełka na 30 minut w buforze cytrynianu sodu do ostygnięcia.
12. Opłucz szkiełka w wodzie przez 5 minut.
13. Zaznacz wokół odcinków guza za pomocą Pap Pen i umieść 2% BSA/1% FBS bufor blokujący kwas maleinowy na 1 godzinę. Przygotuj szkiełka indywidualnie, aby nie dopuścić do ich wyschnięcia na tym etapie.
14. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe w optymalnym rozcieńczeniu w buforze blokującym. (Jeśli stosowane przeciwciała należą do różnych gatunków (lub wariant łańcucha IgG - np. IgG1 vs IgG2a tego samego gatunku), można je stosować w połączeniu podczas jednego okresu inkubacji. Jeśli gatunki przeciwciał nakładają się na siebie, inkubacje muszą być przeprowadzane sekwencyjnie, aby zminimalizować reakcję krzyżową przeciwciał).
15. W tym momencie pozostaw dwa slajdy tylko z buforem blokującym. Te dwa szkiełka będą służyć jako nieskalana kontrola i kontrola plam jądrowych. Pozostałe jednokolorowe kontrole będą inkubowane z pojedynczymi przeciwciałami pierwszorzędowymi. Tylko szkiełko analityczne będzie zawierało kombinację przeciwciał pierwszorzędowych.
16. Inkubować szkiełka z przeciwciałem pierwotnym w komorze wilgotnościowej na wolno obracającym się wytrząsarce pod kątem 4 ° przez noc (~16-20 godzin) (Uwaga: podczas pracy z fluoroforami 4+ może być konieczne sekwencyjne barwienie lub bezpośrednia koniugacja w celu zminimalizowania reakcji krzyżowej przeciwciał. W takich okolicznościach powtarzaj kroki 1.16-1.21, aż wszystkie przeciwciała zostaną nałożone na szkiełka.)
17. Myj szkiełka przez 10 minut w PBST (2x) delikatnie na wytrząsarce
18. Podczas płukania przygotuj przeciwciała drugorzędowe Alexafluor 488, 594 i 647 do ostatecznego rozcieńczenia 1:1,000 w buforze blokującym. (Upewnij się, że te przeciwciała i rozcieńczenia są przechowywane w temperaturze 4 °C i w ciemności przez cały czas, aby zachować fluorescencję we wszystkich partiach i w czasie.)
19. Na szkiełkach kontrolnych z pojedynczym kolorem umieścić pojedyncze rozcieńczenia Alexafluoru pasujące do gatunku użytego przeciwciała pierwszorzędowego. Wszystkie przeciwciała drugorzędowe zostaną umieszczone na szkiełku analitycznym. Niezabarwione i zabarwione jądrowo szkiełka kontrolne pozostaną z buforem blokującym przez cały ten krok.
20. Inkubować w komorze wilgotnościowej (pokrytej folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło) na wolno obracającym się wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
21. Myć szkiełka przez 5 minut w PBST (2x) delikatnie na shakerze. Przykryj folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.
22. Dodaj DAPI (1:10 000) na 1 minutę do slajdu tylko DAPI i slajdu analizy. Przykryj folią aluminiową w celu ochrony przed światłem. Pozostałe szkiełka można pozostawić przykryte w pojemnikach do mycia.
23. Umyj dwie szkiełka podstawowe inkubowane przez DAPI w osobnym pojemniku przez pierwsze 5 minut mycia, aby nie zanieczyścić pozostałych szkiełek barwnikiem DAPI. Przy drugim 5 minutowym praniu szkiełka można połączyć w PBST (wszystkie prania powinny być przeprowadzane na shakerze). Przykryj folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.
24. Krótko zanurz szkiełka w wodzie przed założeniem szkiełek nakrywkowych (grubość 1,5 z wodnym medium montażowym w celu zachowania fluorescencji)
25. Pozostaw do wyschnięcia na 3 godziny w ciemności w temperaturze RT.
26. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego utwardzaczem do paznokci. (Nie używaj lakieru do paznokci, ponieważ aceton może wygasić sygnał fluorescencyjny).
27. Preparaty należy analizować natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszej analizy.

4. Obrazowanie wielospektralne

1. Zbieraj obrazy wielospektralne za pomocą kamery Nuance EX (zawierającej przestrajalny filtr ciekłokrystaliczny) na mikroskopie pionowym Olympus X-63 z oprogramowaniem Nuance do zbierania danych.
2. Zbieraj obrazy za pomocą obiektywu olejnego, aby zwiększyć rozdzielczość.
3. Wstępna konfiguracja obejmuje ustawienie zakresu widmowego dla każdego używanego fluoroforu.
   1. Dla 4 kolorów:
      1. DAPI: 420-480nm
      2. AF488: 490-580 nm
      3. AF594: 590-640 nm
      4. AF647: 650-720nm
4. Wykonaj wstępny obraz szkiełka analitycznego, aby uzyskać odpowiednie czasy ekspozycji dla każdego z zakresów spektralnych.
5. Utwórz "bibliotekę spektralną", której oprogramowanie użyje do identyfikacji i oddzielenia stosunku sygnału do szumu fluoroforów od siebie nawzajem i sygnału tła. (Uwaga: Każdy fluorochrom musi mieć swój własny pojedynczy suwak kontrolny koloru, aby złożyć bibliotekę spektralną z odpowiednimi krzywymi długości fali, aby zapewnić prawidłową analizę zestawu danych. Przykład: 3 fluorofory = 4 szkiełka kontrolne; 5 fluoroforów = 6 szkiełek kontrolnych).
   1. Najpierw zobrazuj niepoplamiony slajd. Ten slajd zostanie oznaczony w bibliotece spektralnej jako tło.>
   2. Zobrazuj drugi slajd tylko w formacie DAPI. Szkiełko to zostanie użyte do oznaczenia jąder barwionych DAPI za pomocą narzędzia "rysuj" i zostanie zapisane w bibliotece spektralnej jako DAPI.>
   3. Obraz slajdu tylko dla AF488 jest trzeci. Ten slajd zostanie użyty do oznaczenia obszarów zabarwionych AF488 za pomocą narzędzia "rysuj" i zostanie zapisany w bibliotece spektralnej jako AF488.>
   4. Obraz czwartego slajdu tylko z AF594. Ten slajd zostanie użyty do wyznaczenia regionów zabarwionych AF594 za pomocą narzędzia "rysuj" i zostanie zapisany w bibliotece spektralnej jako AF594.>
   5. Obraz piątego slajdu tylko dla AF647. Ten slajd zostanie użyty do oznaczenia regionów zabarwionych AF647 za pomocą narzędzia "rysuj" i zostanie zapisany w bibliotece spektralnej jako AF647.>
   6. Po zebraniu każdego pojedynczego komponentu spektralnego zapisz bibliotekę spektralną i protokół.>
6. Po skompletowaniu biblioteki spektralnej znajdź interesujące Cię obszary na szkiełku analitycznym na mikroskopie i zbierz/zapisz obrazy.>

5. Analiza ilościowa obrazów wielospektralnych

1. Zaimportuj reprezentatywny asortyment pozyskanych obrazów Nuance za pomocą oprogramowania InForm.
2. Otwórz zapisaną bibliotekę spektralną zgodnie z zaleceniami programu
3. Zidentyfikuj obszary tkanek będące przedmiotem zainteresowania, które mają być analizowane. (np. Tkanka nowotworowa a tkanka tłuszczowa).
4. Zidentyfikuj poszczególne komórki na podstawie barwienia DAPI. Cytoplazma zostanie zdefiniowana automatycznie na podstawie kształtu jądra.
5. Wybierz odczyt intensywności fluorescencji dla każdego parametru fluorescencyjnego (np. średniej, odchylenia standardowego)
6. Zgrupuj uzyskane obrazy i pozwól oprogramowaniu przetworzyć je przy użyciu proponowanego algorytmu.
7. Po zakończeniu przetwarzania obrazu scal pliki wynikowe.
8. Otwórz wyniki w Excelu (lub dowolnym innym pakiecie oprogramowania analitycznego) i wykreśl względem siebie dwie intensywności fluorescencji na osi XY. Każda intensywność fluorescencji jest podawana dla każdej komórki. Podwójnie dodatnie komórki pojawią się w prawym górnym kwadrancie. Użytkownik musi zdefiniować podstawowe natężenia fluorescencji.

Results

Korzystając z techniki obrazowania wielospektralnego do analizy guzów wszczepionych w nasz transgeniczny model myszy BMT, jesteśmy w stanie rozpoznać składniki guza zrębu, które pochodzą ze szpiku kostnego. Początkowy BMT został potwierdzony trzy tygodnie po przeszczepie za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 1). Nieoznakowane guzy jajnika wstrzyknięte ortotopowo po potwierdzeniu wszczepienia BMT zostały wycięte i utrwalone formaliną 6 tygodni po początkowym wstrzyknięciu guza. Skrawki guza zatopione w ...

Discussion

W tym miejscu opisujemy zastosowanie obrazowania wielospektralnego, które opisujemy jako MIMicc - wielospektralne badanie multipleksowanych kompozycji komórkowych, do analizy składników zrębu pochodzących ze szpiku kostnego w mikrośrodowisku guza, jednak ta metodologia i koncepcja mogą być stosowane do rozszyfrowywania innych elementów komórkowych, które składają się na złożone tkanki, takie jak te widoczne podczas reakcji gojenia się ran lub podczas tkanki regeneracyjnej. W tych eksperymentach wykorzystujemy myszy trans...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
.2 μ m filtr	Fisher	09-740-35A
przynęty	BD	309604
25 G igła	Cardinal	BF305122
filtr 40nm	BD	352340
50 ml rurka stożkowa	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-RB	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Szkiełka nakrywkowe	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Etanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Igła do insuliny	BD	329424
Kwas maleinowy	Acros	100-16-7
Pojemnik z komorą wilgotnościową	Evergreen	240-9020-Z10
Nośniki montażowe	dako	S3023
Utwardzacz do paznokci	Sally Hansen	2103
Długopis	Abcam	Ab2601
Długopis/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
Blocking Buffer kwas maleinowy 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH granulki (do 7,5pH) 9 + g Woda destylowana 250 ml *dodać 0,2% Tween-20 do 1x roztwór do blokowania buforu z 2%BSA/2%FBS. Wymieszaj i przefiltruj. do odzyskiwania antygenu: Bufor Tris-EDTA (10 mM zasada Tris, 1 mM roztwór EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9,0) Tris Base 1,21 g EDTA 0,37 g Woda destylowana 1000 ml (100 ml do przygotowania 10x, 50 ml do przygotowania 20x) Tween 20 0,5 ml *Przechowywać w RT przez 3 miesiące lub w temperaturze 4 stopni; C na dłużej
Bufor cytrynianu sodu (10 mM cytrynian sodu, 0,05% Tween 20, pH 6,0)
Cytrynian trisodowy (dwuwodny)	2,94 g
Woda destylowana	1000 ml
HCl (dostosuj pH do 6,0)	1N
Tween 20	0,5 ml