Zastosowanie testu ochrony DNA in vitro do wizualizacji właściwości białka DPS w zakresie mediacji stresu

Podsumowanie

Białko wiążące DNA z wygłodzonych komórek (Dps) odgrywa kluczową rolę w zwalczaniu stresu bakteryjnego. W artykule omówiono oczyszczanie z E. coli Dps oraz protokół testu in vitro wykazujący ochronę DNA przed degradacją przez reaktywne formy tlenu za pośrednictwem Dps.

Streszczenie

Stres oksydacyjny jest nieuniknionym produktem ubocznym życia tlenowego. Tlen cząsteczkowy jest niezbędny do metabolizmu ziemskiego, ale bierze również udział w wielu szkodliwych reakcjach w organizmach żywych. Połączenie metabolizmu tlenowego i żelaza, które jest kolejnym związkiem niezbędnym do życia, wystarcza do wytworzenia rodników w procesie chemicznym Fentona i degradacji składników komórkowych. Degradacja DNA jest prawdopodobnie najbardziej szkodliwym procesem z udziałem rodników wewnątrzkomórkowych, ponieważ naprawa DNA jest daleka od trywialnej. Test przedstawiony w tym artykule oferuje ilościową technikę pomiaru i wizualizacji wpływu cząsteczek i enzymów na uszkodzenia DNA za pośrednictwem rodników.

Test ochrony DNA jest prostym, szybkim i solidnym narzędziem do charakteryzowania in vitro właściwości ochronnych białek lub substancji chemicznych. Polega ona na wystawieniu DNA na szkodliwą reakcję oksydacyjną i dodaniu różnych stężeń interesującego związku. Zmniejszenie lub zwiększenie uszkodzeń DNA w funkcji stężenia związku jest następnie wizualizowane za pomocą elektroforezy żelowej. W tym artykule demonstrujemy technikę oznaczania ochrony DNA poprzez pomiar właściwości ochronnych białka wiążącego DNA z zagłodzonych komórek (Dps). Dps to mini-ferrytyna, która jest wykorzystywana przez ponad 300 gatunków bakterii do silnego zwalczania stresorów środowiskowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania Dps oraz zoptymalizowane warunki testowe do oceny ochrony DNA przez Dps.

Wprowadzenie

Organizmy tlenowe muszą nieustannie zmagać się z reaktywnymi formami tlenu, które mogą uszkadzać ich DNA, jak również inne kluczowe makrocząsteczki biologiczne. Jednym z potężnych narzędzi do przeciwdziałania toksycznym skutkom uszkodzeń oksydacyjnych jest białko wiążące DNA z wygłodzonych komórek (Dps). Od czasu odkrycia w 1992 r. w zagłodzonej kulturze E. coli ¹, Dps został zidentyfikowany u ponad 300 gatunków bakterii i archebakterii ². Masywna regulacja w górę Dps w fazie stacjonarnej sprawia, że jest to białko E. coli o najwyższej ekspresji związane z nukleoidami w warunkach głodu ^{3, 4}. Ponadto wykazano, że Dps zachowuje zarówno żywotność bakterii, jak i integralność DNA podczas wielu różnych stresów, w tym głodu, wysokiego stężenia żelaza, ekspozycji na światło UV, szoku cieplnego i stresu oksydacyjnego ^{5, 6}.

Strukturalnie, Dps sam się asocjuje w stabilny homo-oligomeryczny kompleks 12 monomerów, które łączą się w sferyczną, pustą powłokę. Wewnętrzna wnęka o szerokości ~ 4,5 nm jest dostępna dla zewnętrznego rozpuszczalnika przez pory, które umożliwiają przejście małych cząsteczek ⁷ i może sekwestrować zmineralizowane metale, takie jak żelazo ⁸. Ochronne działanie Dps wynika z jego kilku aktywności biochemicznych, które obejmują niespecyficzne wiązanie DNA ¹, aktywność ferroksydazy i magazynowanie żelaza ⁸.

Szczegółowe badanie korzystnych biochemicznych działań Dps wymaga najpierw jego oczyszczenia. Oczyszczanie Dps jest skomplikowaną procedurą, ponieważ Dps musi zostać oddzielony nie tylko od innych białek, ale także od wszelkich związanych DNA ⁷. Nasz zoptymalizowany proces oczyszczania wykorzystuje wiele popularnych technik, składających się z dwóch kolumn jonowymiennych i etapu wytrącania siarczanu amonu. Potrzebnych jest kilka wymian buforowych, ponieważ wysoce skoncentrowany Dps może wytrącać się z roztworu w warunkach niskiej zawartości soli. Po oczyszczeniu białka Dps można je zastosować do testów, które bezpośrednio mierzą jego aktywność ferroksydazy ⁸, stechiometrię wiążącą DNA ⁹ i mechanizmy wiązania żelaza ¹⁰. Oczyszczony Dps ma również inne potencjalne zastosowania. Stabilna, pusta sferyczna struktura Dps została wykorzystana jako rusztowanie do przechowywania cząstek hydrofobowych wewnątrz jamy białkowej ¹¹, a nawet jako komora reakcyjna do syntezy nowych nanocząstek magnetycznych ¹².

Zdolność ochronna Dps do pośredniczenia w uszkodzeniach spowodowanych przez reaktywne formy tlenu może być jasno i bezpośrednio wykazana za pomocą testu ochrony DNA ^{13, 14}. W tej procedurze in vitro rodniki powstają, gdy żelazo katalizuje degradację_H2O2poprzez chemię Fentona. Rodniki te bezpośrednio uszkadzają DNA obecne w reakcji i mogą je całkowicie zdegradować w wysokich stężeniach. Dwa kluczowe działania DPS mogą bezpośrednio przeciwdziałać skutkom produkcji rodników, w której pośredniczy Fenton. Dps obniża stężenie katalitycznego żelaza poprzez mineralizację, zużywając w tym procesie dostępny nadtlenek wodoru. Dodatkowo, wiązanie Dps z DNA może potencjalnie chronić go fizycznie przed radykalnym uszkodzeniem i kondensować go do mniejszej objętości o mniejszej reaktywnej powierzchni. Połączenie tych dwóch właściwości sprawia, że test ochrony DNA dobrze nadaje się do pomiaru ochronnej aktywności Dps.

Test ochrony DNA jest dość wszechstronny i może być używany do różnych zastosowań poza charakterystyką Dps. Radykalne uszkodzenia są powszechną formą stresu w komórkach, a do przeciwdziałania im stosuje się wiele różnych białek i substancji chemicznych. Ogólna zasada testu, wykorzystująca integralność DNA jako marker uszkodzenia rodnikowego, może być stosowana w połączeniu z prawie każdą reakcją wytwarzającą rodniki lub środkiem przeciwdziałającym. Test został z powodzeniem wykorzystany między innymi do określenia właściwości przeciwutleniających ekstraktu z K. paniculata do stosowania w przemyśle spożywczym ¹⁵, do scharakteryzowania wpływu kwasu moczowego na mediację uszkodzeń hydroksylowych ¹⁶ oraz do uzyskania nowych informacji na temat funkcji białek regulatora transkrypcji Fur ¹⁷.

Pomimo licznych zastosowań testu w opublikowanych artykułach, stwierdziliśmy, że wymagane było wiele kroków optymalizacyjnych i rozwiązywania problemów, co sprawia, że konfiguracja testu po raz pierwszy jest niepotrzebnie pracochłonnym procesem dla wielu badaczy. Protokół, który przedstawiamy w tym artykule, ma na celu usunięcie tej bariery wejścia.

Protokół

1. Ekspresja i oczyszczanie DPS

Uzyskanie białka o wysokiej czystości jest niezbędnym pierwszym krokiem do testu ochrony DNA. Oczyszczanie białka Dps można przeprowadzić w ciągu 4 do 5 dni.

1. Przekształć szczep E. coli z niedoborem proteazy (taki jak BL21(DE3) pLysS) w wektor pET (taki jak pET17), do którego sklonowano sekwencję kodującą białko Dps.
2. Przenieść przekształcone komórki na płytki agarowe Luria Bulth (LB) zawierające odpowiednie antybiotyki (takie jak ampicylina i chloramfenikol, dla przykładów podanych w ppkt 1.1). Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
3. Zaszczepić pojedynczą kolonię z płytki w 30 ml pożywki LB zawierającej odpowiednie antybiotyki. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 200-250 obr./min.
4. Zaszczepić 2 x 1 l LB pożywki zawierającej odpowiednie antybiotyki po 10 ml każdej z nocnych kultur. Rosnąć w temperaturze 37 °C, wstrząsając, do średnicy zewnętrznej _około 0,6. (Hodowla komórek do wyższej średnicy zewnętrznej zwiększa wydajność białka, bez zauważalnego pogorszenia czystości produktu końcowego). Wywołać ekspresję Dps przez dodanie IPTG do stężenia 0,3 mM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-4 godziny podczas wstrząsania.
5. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 6 000 x g przez 15 minut. Ponownie zawiesić granulki komórek w 7,5 ml buforu DEAE A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA) na L indukowanej hodowli komórkowej. W razie potrzeby próbki można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Procedura może być następnie kontynuowana przez rozmrażanie próbek w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C.
6. Dodać mieszaninę inhibitorów proteazy (takich jak inhibitory proteazy Calbiochem zestaw III, w stężeniu 0,167 μl na ml zawiesiny komórkowej) do zawiesiny komórkowej, aby zapobiec degradacji nadekspresji Dps.
7. Przygotuj ekstrakt bezkomórkowy za pomocą prasy francuskiej. Zalać prasę francuską 20 ml buforu DEAE A (w przypadku stosowania modelu o ciągłym przepływie), a następnie dwukrotnie rozbić próbkę przy 20 kpsi. Odwirować lizat przy sile 30 000 x g przez 35 minut w temperaturze 4 °C w celu oczyszczenia nierozpuszczalnych cząstek i zachować supernatant. Supernatant można następnie zamrozić przy użyciu ciekłego azotu i w razie potrzeby przechowywać w temperaturze -80 °C.
8. Zrównoważyć 30 ml kolumny DEAE Sepharose CL-6B z buforem DEAE A, używając FPLC. Przepuścić bufor przez kolumnę z prędkością 1-2 ml/min przy maksymalnym ciśnieniu 0,2 MPa nad tłem. Załaduj ekstrakt bezkomórkowy na kolumnę i zacznij zbierać przepływ, gdy sygnał OD ₂₈₀ zacznie rosnąć powyżej linii podstawowej. Przemyć kolumnę buforem DEAE A, aż wartość _OD280 powróci do linii podstawowej, jednocześnie w sposób ciągły zbierając przepływ. Przepływ powinien zawierać większość białka Dps, wolnego od związanego DNA. Przepłukać kolumnę 100% buforem B (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 M NaCl, 0,1 mM EDTA). Ten eluat zawiera kompleksy Dps-DNA, a także inne białka i może być odrzucony.
9. Usunąć dodatkowe białka zanieczyszczające poprzez wytrącanie siarczanu amonu. Określ objętość przepływu w puli. Powoli (przez 10-20 minut) dodawać suchy drobnoziarnisty siarczan amonu do 62% nasycenia (390 mg na ml roztworu) w temperaturze 4 °C, dobrze mieszając. Mieszaj mieszaninę przez dodatkowe 20-30 minut po dodaniu ostatniej porcji siarczanu amonu, aby zapewnić pełną równowagę. Dps pozostanie rozpuszczalny, podczas gdy zanieczyszczające białka wytrącą się z roztworu.
10. Usunąć wytrącone białka przez odwirowanie w temperaturze 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i zachować supernatant.
11. Powoli dodawać dodatkowe 227 mg siarczanu amonu na ml supernatantu, aby osiągnąć 94% nasycenia i mieszać przez 20-30 minut, aby zapewnić pełną równowagę. Dps wytrąca się przy tym wysokim stężeniu soli i może być zbierany przez odwirowanie w temperaturze 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Dps będzie w granulce; Supernatant można odrzucić. W razie potrzeby pellet można przechowywać w temperaturze -80 °C.
12. Zawiesić osad zawierający Dps w buforze do ponownego zawieszania (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Dostosować objętość próbki do 2,5 ml.
13. Wymiana buforu w celu usunięcia siarczanu amonu za pomocą żelowej kolumny filtracyjnej PD-10. Zrównoważyć złoże żelowe za pomocą 25 ml buforu do ponownego spożycia. Nanieść 2,5 ml próbki Dps na górną część kolumny PD-10 i pozostawić do wchłonięcia. Odrzuć przepływ. Zebrać Dps przez elucję za pomocą 3,5 ml buforu do respodencji.
14. Odwirować próbkę wymienioną buforem o masie 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich nierozpuszczalnych składników i rozcieńczyć ją 6-10 ml buforu rozcieńczającego (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 0,1 mM EDTA), aby upewnić się, że stężenie soli jest wystarczająco niskie, aby Dps mógł związać się z kolumną SP Sepharose. Szczególnie skoncentrowane próbki Dps mogą stać się mniej rozpuszczalne po rozcieńczeniu do buforu o niższej zawartości soli, o czym świadczy zmętnienie cieczy, ale mogą być całkowicie rozpuszczalne przez dodanie niewielkiej ilości 5 M roztworu NaCl (dodatkowe 10-20 mM).
15. Zrównoważyć 30 ml SP Sepharose Fast Flow z buforem SP A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Przepuścić bufor przez kolumnę z prędkością 1,5-2 ml/min przy ciśnieniu granicznym 0,3 MPa na tle. Załaduj próbkę do kolumny. Przemyć buforem SP A, aż ślad _OD.280 powróci do linii wyjściowej i odrzucić przepływ. Uruchom gradient liniowy o pojemności 150 ml od 0 do 100% buforu B, zbierając frakcje o objętości 2 ml. Dps wymywa się w ostrym szczycie przy około 50% B, chociaż możliwa jest zmiana o 10%.
16. Uruchom frakcje elucyjne na 15% żelu SDS-PAGE i sprawdź, czy nie ma zanieczyszczenia DNA, mierząc stosunek _O.D.260 / O.D.280 za pomocą spektrofotometru. Żel powinien pokazywać tylko jedno pasmo około 19 kDa, a _OD.260/ _OD.280 wynosi zwykle około 0,7. Zbierz najczystsze frakcje Dps. Użyj odśrodkowego urządzenia filtrującego (takiego jak jednostka filtracyjna Amicon Ultra) z odcięciem masy cząsteczkowej 10K, aby skoncentrować Dps i wymienić go na bufor magazynowy (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl). Podwielokrotnić oczyszczony Dps i zamrozić w ciekłym azocie w celu przechowywania w temperaturze -80 °C.

2. Test ochrony DNA

Test składa się z wielu etapów, w których liczy się czas, i powinien być przemierzony co do sekundy, aby uzyskać powtarzalne wyniki. W grę wchodzi wiele składników i etapów pipetowania, dlatego zaleca się korzystanie z tabeli pipetowania (patrz Tabela 1) w celu śledzenia kroków i objętości. Całkowity czas potrzebny na wykonanie testu wynosi nie więcej niż 3 godziny.

1. Odmierzyć 30 ml wody do hermetycznej fiolki; płukać wodę z_N2 przez 10 minut (używając dwóch igieł strzykawkowych, jednej w płynie, drugiej nad nim) w celu usunięcia tlenu z roztworu. Dodać 0,0168 g FeSO₄•_7H2O do wody, aby otrzymać roztwór podstawowy o stężeniu 2 mM. Zamknąć fiolkę i płukać azotem jeszcze przez 5 minut, a następnie wymieszać. Rozwiązanie musi być jasne; Jeśli wyczuwalna jest jakakolwiek żółta nuta, przygotuj nowy roztwór żelaza.
2. Przygotować roztwór 100 mM_{H 2}O₂ (10,87 μl 9,2 M_{H 2O2} w 1 ml wody); przechowywać na lodzie i chronić przed światłem, zawijając w folię aluminiową. Stosować tylko przez około 1-2 godziny po przygotowaniu z powodu samoistnego próchnicy. Zapas nadtlenku wodoru jest również podatny na rozkład, który może być częściowo złagodzony przez odpowiednie przechowywanie (w ciemności, w temperaturze 4 °C). Zaleca się regularne kontrole stężenia zapasów poprzez pomiar średnicy zewnętrznej ₂₄₀.
3. Szybko rozmrozić porcję oczyszczonego Dps w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej i trzymać na lodzie. Wirować przez 10 sekund przy 4 000 x g w pikocentrycznym stole w celu wytrącenia agregatów. Zmierzyć stężenie po odwirowaniu za pomocą spektrofotometru (OD ₂₈₀ = 1,547 wskazuje stężenie monomeru 100 μM Dps).
4. Rozcieńczyć liniowe DNA z materiału wyjściowego o wysokim stężeniu za pomocą 12-krotnego buforu reakcyjnego (1 M MOPS-KOH pH 7,0, 1 M NaCl) do stężenia 100 ng / μl. Aby ułatwić kwantyfikację, stosuje się liniowe DNA, ale można również użyć plazmidowego DNA.
5. Odpipetować 1 μl mieszaniny DNA z buforem do probówki PCR. Dodać tyle wody do reakcji, aby końcowa objętość reakcji (minus SDS) wynosiła 12 μl. Ilość tę należy obliczyć z wyprzedzeniem, korzystając z tabeli pipetowania. Dodać Dps do końcowego stężenia dodekameru wynoszącego 3 μM. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić Dps związanie się z DNA.
6. Dodaj tyle 2 mM roztworu_FeSO4, aby osiągnąć pożądane stężenie. W typowym eksperymencie wykorzystuje się zakres stężeń od 0 do 1 mM_FeSO4. Wyższe stężenia spowodują bardziej rozległą degradację DNA, ale mogą również prowadzić do powstania osadów żelaza w mieszaninie reakcyjnej. Szybko dodać 1 μl roztworu 100 mM_{H 2}O₂ (do 10 mM stężenia końcowego) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby umożliwić zajście reakcji degradacji za pośrednictwem Fentona.
7. Dodać 0,8 μl 20% SDS (dodecylosiarczan sodu). Mieszać i inkubować w temperaturze 85 °C przez 5 minut w celu rozbicia kompleksów Dps-DNA. SDS destabilizuje kompleks Dps-DNA i zapobiega niepożądanym przesunięciom żelu dla DNA, co poprawia łatwość kwantyfikacji. Opcjonalnym krokiem jest zatrzymanie reakcji poprzez katalityczny rozkład nadtlenku wodoru do nietoksycznych produktów. W przypadku warunków opisanych w tym protokole krok ten nie jest konieczny do uzyskania szerokiego zakresu degradacji DNA.
8. Inkubować na lodzie przez 1 minutę, dodać barwnik ładujący i naładować żel agarozowy. Uruchom żel i wybarwić DNA za pomocą bromku etydyny. Żel powinien być barwiony po elektroforezie, a nie przed elektroforezą, aby zapobiec zakłóceniom SDS w dystrybucji bromku etydyny w żelu.

Wyniki

Proces oczyszczania białka Dps opisany w niniejszej procedurze jest bardzo powtarzalny. Oczyszczanie Dps zgodnie z opisanym protokołem, z wykorzystaniem 2 L kultury E. coli jako materiału wyjściowego, zazwyczaj pozwala uzyskać 2,5 ml białka zawierającego Dps₁₂ w stężeniach od 5 do 12 μM. Dłuższy czas indukcji (4 h) wydaje się ograniczać tę zmienność. Czystość białka stale przekracza 99%, co potwierdzają żele SDS-PAGE (Rysunek 1). Poziom zanieczyszczenia DNA jest konsekwentnie pomijaln...

Dyskusja

Proces oczyszczania Dps, jak opisano w tym artykule, jest bardzo solidny. Czystość utrzymuje się na wysokim poziomie (> 99%); żadne inne białka nie pojawiają się na żelach SDS-PAGE jako widoczne prążki. Mimo to niektóre partie oczyszczonych Dps wydają się mieć aktywność nukleazy, o czym świadczy częściowa degradacja DNA podczas inkubacji z bardzo wysokimi stężeniami Dps. Może to wskazywać na obecność wysoce aktywnych DNaz w niskim stężeniu, których nie byliśmy w stanie usunąć poprzez oczyszczanie. Jednak ta degradacja DN...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BL21(DE3)pLysS kompetentne komórki	Promega	L1195
pET-17b DNA	EMD-Millipore	69663-3
LB bulion w proszku	Sigma-Aldrich	L3022
Sól sodowa ampicyliny	Sigma-Aldrich	A0166
Chloramfenikol	Sigma-Aldrich	C0378
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
HEPES	BDH	441476L
Wodorotlenek potasu	Merck	105033
Chlorek sodu	VWR	443824T
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Zestaw koktajlowy inhibitorów proteazy III	EMD-Millipore	539134
DEAE-Sepharose	Sigma-Aldrich	DFF100
Siarczan amonu	Sigma-Aldrich	A4418
PD-10 Kolumny odsalające	GE Healthcare LS	17-0851-01
SP-Sepharose	Sigma-Aldrich	S1799
Amicon Ultra Centr. Filtr (10K MWCO)	Milipore	UFC901024
siarczanu żelazawego siedmiowodny	Sigma-Aldrich	F8048
Roztwór nadtlenku wodoru	Sigma-Aldrich	216763
MOPS	Calbiochem	475898
roztwór SDS	Bio-Rad	161-0418
Bromek etydyny	Sigma-Aldrich	E1510
Inkubator statyczny	Hettich	INE500
Inkubator z wytrząsaniem	Nowy Brunszwik Sc.	Inova 44
Wirówka z chłodzeniem	Beckman Coulter	Avanti J-E
Wirówka stołowa	Eppendorf	5424
Rozbijacz komórek	Constant Systems Ltd.	TS2/40/AA/AA
FPLC Purifier	General Electric	AKTA
Hermetyczne fiolki	Cole-Parmer	EW-08918-85
Igły strzykawkowe	Pipety BD	305128
	Eppendorf	Z683779-1EA, Z683795-1EA