Przygotowanie komórek groniastych trzustki do celów obrazowania wapnia, pomiarów uszkodzeń komórek i infekcji adenowirusowej

Podsumowanie

Opisujemy powtarzalną metodę przygotowania komórek groniastych trzustki myszy od myszy w celu zbadania sygnałów wapniowych komórek groniastych i uszkodzeń komórkowych za pomocą fizjologicznie i patologicznie istotnych bodźców. Podano również metodę infekcji adenowirusowej tych komórek.

Streszczenie

Komórka groniasta trzustki jest główną komórką miąższową zewnątrzwydzielniczej trzustki i odgrywa główną rolę w wydzielaniu enzymów trzustkowych do przewodu trzustkowego. Jest to również miejsce inicjacji zapalenia trzustki. Tutaj opisujemy, w jaki sposób komórki groniaste są izolowane z całej tkanki trzustki i mierzone są wewnątrzkomórkowe sygnały wapniowe. Ponadto opisujemy techniki transfekcji tych komórek konstruktami adenowirusowymi, a następnie pomiaru wycieku dehydrogenazy mleczanowej, markera uszkodzenia komórek, w warunkach, które indukują uszkodzenie komórek groniastych in vitro. Techniki te stanowią potężne narzędzie do charakteryzowania fizjologii i patologii komórek groniastych.

Wprowadzenie

Dynamiczne zmiany w cytozolowym wapniu są niezbędne zarówno dla fizjologicznych, jak i patologicznych zdarzeń międzymiastowych. Uważa się, że te rozbieżne efekty wapnia wynikają z odrębnych przestrzennych i czasowych wzorców sygnalizacji wapniowej ¹. Na przykład wydzielanie enzymów i płynów z komórki groniastej jest związane ze skokami wapnia z ograniczonego obszaru bieguna wierzchołkowego, w którym zachodzi wydzielanie ². W przeciwieństwie do tego, globalna fala wapniowa, po której następują intensywne nieoscylacyjne sygnały wapniowe, wiąże się z wczesnymi zdarzeniami patologicznymi, które prowadzą do ostrego zapalenia trzustki ^3,4. Należą do nich aktywacja proteazy wewnątrzzrazikowej, zmniejszone wydzielanie enzymów i uszkodzenie komórek groniastych. Nasze laboratorium wykorzystuje izolowane acini trzustki do badania tych wczesnych zdarzeń patologicznych, które prowadzą do choroby zarówno in vivo, jak i in vitro ^5-7. Opisane tutaj metody opisują izolację pierwotnych komórek groniastych w celu pomiaru poziomu wapnia cytozolowego i uszkodzenia komórek. Podano również metodę infekcji adenowirusowej tych komórek.

Protokół

1. Przygotowanie komórek acynarnych trzustki do obrazowania wapnia

1. Przygotować bufor inkubacyjny HEPES zawierający 20 mM HEPES, 95 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM MgCl₂, 1,3 mM CaCl₂, 10 mM glukozy, 2 mM glutaminy oraz 1 × nieessentialne aminokwasy z pożywki minimum Eagle's. Dostosować pH końcowego roztworu do 7,4 za pomocą NaOH.
2. Przygotować bufor inkubacyjny BSA, dodając BSA (stężenie końcowe 1% m/v) do 25 ml buforu inkubacyjnego HEPES (opisanego powyżej).
3. Przygotować bufor do trawienia kolagenazą, dodając 1,1 mg/ml (200 j/ml) kolagenazy typu 4 oraz 1 mg/ml inhibitora trypsyny sojowej do 6 ml buforu inkubacyjnego BSA (opisanego powyżej).
4. Przeprowadzić mycie kwasowe szkiełek podstawkowych 22x22 mm poprzez zanurzenie ich w mieszaninie dwóch części HNO₃ i jednej części HCl na 2 h. Następnie opłukać wodą dejonizowaną (DI) i przechowywać w 70% etanolu.
5. Uśmiercić mysz poprzez uduszenie CO₂. Umieścić zwierzę w pozycji grzbietnej i przygotować powierzchnię brzucha, oczyszczając ją 70% etanolem. Wykonać laparotomię, aby odsłonić jamę brzuszną. Wypreparować trzustkę i niezwłocznie przepłukać w małym naczyniu wagowym zawierającym 6 ml buforu do trawienia kolagenazą.
6. Usunąć większe fragmenty tłuszczu lub widoczne naczynia krwionośne, a następnie odlać 5 ml buforu do trawienia kolagenazą i przelać go z powrotem do probówki stożkowej 15 ml.
7. Za pomocą precyzyjnych nożyczek chirurgicznych posiekać trzustkę w małym naczyniu wagowym zawierającym 1 ml buforu do trawienia kolagenazą. Siekać do momentu, aż otrzymany roztwór będzie wyglądał na jednorodnie rozproszony.
8. Przenieść posiekaną tkankę do plastikowej kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml i dodać do naczynia pozostałe 5 ml buforu do trawienia kolagenazą. Upewnić się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w buforze.
9. Umieścić kolbę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przy wstrząsaniu z prędkością 90 rpm przez 30 min. W tym czasie przygotować agonistów aktywujących wapń (np. caeruleinę, karbachol) i opłukać myte kwasem szkiełka podstawkowe 22x22 mm wodą DI. Osuszyć, a następnie ułożyć na płaskiej powierzchni wyłożonej folią laboratoryjną.
10. Po zakończeniu 30-minutowego trawienia przenieść zawiesinę z powrotem do probówki stożkowej 15 ml i pozwolić komórkom osiaść. Ostrożnie odpipetować bufor do trawienia kolagenazą i zastąpić go 6 ml buforu inkubacyjnego BSA. Energicznie wstrząsnąć probówką ręcznie przez 10 s, aby rozbić komórki na mniejsze skupiska. Natychmiast po wstrząśnięciu usunąć duże, pływające zanieczyszczenia z nieosadzonego medium.
11. Pozwolić pozostałym komórkom osiaść i wymienić medium na świeży bufor inkubacyjny BSA.
12. Powtórzyć krok 1.11 dwukrotnie, aż zawiesina będzie składać się wyłącznie z małych skupisk, które są ledwo widoczne gołym okiem. Komórki powinny przypominać te przedstawione na Rysunku 1A (górny rząd).
13. Usunąć bufor inkubacyjny BSA i zastąpić go buforem inkubacyjnym HEPES.
14. Przygotować 100-krotny roztwór stokowy Fluo-4AM o stężeniu 750 μM w 10% DMSO.
15. Załadować barwnik do komórek w probówce stożkowej 15 ml zawierającej zawiesinę komórkową i bufor inkubacyjny HEPES bez BSA. W tym celu dodać do zawiesiny komórkowej odpowiednią objętość roztworu stokowego (rozcieńczenie 1:100). Następnie nanieść 500 μl tej zawiesiny na każde szkiełko podstawkowe 22x22 mm.
16. Przechowywać szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej. Pierwsze pomiary Ca²⁺ wykonać 30 min po załadowaniu barwnika. Barwnik jest automatycznie usuwany z medium po rozpoczęciu perfuzji, która powinna nastąpić 30 min po załadowaniu barwnika.

2. Pomiar stężenia wapnia w komórkachy acynarnych trzustki

1. Przepłucz każdy zestaw perfuzyjny wodą dejonizowaną (DI) i napełnij odpowiednią ilością buforu lub agonisty. Odpowietrz każdą strzykawkę buforem lub agonistą, aby zapewnić prawidłowy przepływ. Przymocuj strzykawki do statywu z pierścieniem na wysokości około 30-60 cm nad stolikiem mikroskopu.
2. Za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie chwyć za krawędź szkiełko nakrywkowe zawierające zawiesinę komórek. Przechyl szkiełko pod kątem 45°, aby nadmiar buforu spłynął. Umieść szkiełko nakrywkowe na gumowej uszczelce tak, aby komórki znajdowały się na górnej powierzchni szkiełka, a następnie złóż komorę (Ryciny 2A i 2B).
3. Zamocuj komorę perfuzyjną do stolika i wprowadź rurkę zawierającą bufor do pierwszego wlotu komory (Rycina 2C). Uruchom strzykawkę z buforem i pozwól, aby bufor przepłynął przez całą powierzchnię szkiełka nakrywkowe. Gdy bufor dotrze do przeciwległego końca komory, wprowadź linię próżni do wlotu próżniowego. Wprowadź pozostałe rurki (zawierające agonistę, inhibitory itp.) w odpowiednie miejsca wzdłuż komory.
4. Wizualizuj komórki, używając obiektywu 200X lub 400X z aperturą numeryczną 1,4 oraz lasera argonowego w celu wzbudzenia barwnika Fluo-4AM przy długości fali 488 nm (Rycina 1A, dół). Ustawienia mocy lasera powinny być dostosowane tak, aby fotopowielacz (PMT) nie był nasycony emitowanym światłem. Ponadto napięcie na PMT musi zostać zoptymalizowane dla maksymalnej detekcji światła.
5. Sygnały emisji długoprzepustowe > 515 nm są zbierane przy prędkościach klatek 2-5 s/klatkę w celu wizualizacji wolnych wzorców oscylacyjnych oraz 0,2-0,3 s/klatkę w celu wizualizacji szybszych, globalnych fal wapniowych (Ryciny 3 i 4).
6. Po zakończeniu obrazowania zamknij strzykawki i usuń wszystkie rurki. Rozmontuj komorę i powtórz kroki 2.2-2.4.
7. Zbierz dane w postaci wartości numerycznych intensywności fluorescencji w czasie i przenieś je do programu Image J (pakiet oprogramowania udostępniony bezpłatnie przez National Institutes of Health, dostępny pod adresem http://rsb.info.nih.gov/ij/).
8. Przeglądaj obrazy komórkowe w czasie rzeczywistym i zidentyfikuj obszary zainteresowania (ROI; np. apikalne, bazolateralne, jądrowe itp.)
9. Wyznacz intensywności fluorescencji dla tych ROI i przedstaw je jako stosunek intensywności fluorescencji do intensywności fluorescencji bazowej (tzn. F/F0).
10. Wygeneruj wykresy, nanosząc F/F₀ w funkcji czasu. Oprócz wykresów zazwyczaj dostarcza się i prezentuje reprezentatywne obrazy z wykorzystaniem pseudokolorów.

3. Przygotowanie komórek acynarnych trzustki do testów uszkodzeń komórkowych

1. Podgrzać pożywkę DMEM F-12 (bez czerwieni fenolowej) do 37 °C.
2. Do pożywki DMEM F-12 dodać BSA (stężenie końcowe 0,1% w/v) oraz HCl (stężenie końcowe 50 μM).
3. Odmiarkować 50 ml DMEM do probówki stożkowej.
4. Przygotować bufor z kolagenazą, dodając 0,5 mg/ml (12 U/ml) kolagenazy typu IV do 10 ml uzupełnionej pożywki DMEM F-12.
5. Uśmiercić jedną mysz poprzez uduszenie CO₂. Umieścić zwierzę w pozycji grzbietnej i przygotować powierzchnię brzucha, oczyszczając ją 70% etanolem. Wykonać laparotomię w celu odsłonięcia jamy brzusznej. Wypreparować trzustkę i niezwłocznie wypłukać w małym naczyniu wagowym zawierającym 6 ml buforu z kolagenazą.
6. Siekać tkankę za pomocą precyzyjnych nożyczek chirurgicznych przez 3-5 min lub do momentu, aż uzyskany roztwór stanie się równomiernie rozproszony.
7. Przenieść posiekaną tkankę do kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml z dodatkowymi 5 ml buforu z kolagenazą, a następnie umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 90 rpm przez 5 min.
8. Zdjąć z wytrząsarki, pozwolić komórkom krótko osiadać i wymienić ciecz na 5 ml świeżego buforu z kolagenazą. Następnie inkubować przez kolejne 35 min w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 90 rpm.
9. Energicznie resuspendować materiał trawiony za pomocą pipety transferowej, aż zawiesina stanie się homogeniczna i pozbawiona widocznych grudek komórek. Następnie ostrożnie przepuścić zawiesinę komórkową przez uprzednio zwilżone nylonowe sito do kolby stożkowej.
10. Energicznie przepipetować przez sito dodatkowe 3 ml świeżej pożywki DMEM F-12 (z kolagenazą), aby wymusić przejście wszystkich pozostałych komórek.
11. Dodać kolejne 6-10 ml pożywki DMEM F-12 i pozwolić komórkom osiadać przez 2-3 min. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, a po ostatnim przemyciu usunąć nadsącz.
12. Dodać świeżą pożywkę DMEM F-12, resuspendować komórki i nanieść 500 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Komórki powinny przypominać te przedstawione na Rysunku 1B.
13. Pozostawić płytkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przy 90 rpm przez 5 min przed dodaniem agonistów.
14. Stymulować komórki różnymi agonistami przez 2-4 h.
15. Przechylić płytkę pod kątem, aby umożliwić osiadanie komórek, ostrożnie odpipetować alykwot pożywki (zazwyczaj 100 μl) i gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie.
16. Gwałtownie zamrozić pozostałą zawiesinę komórkową. Gwałtowne mrożenie nie jest niezbędne dla pomiarów LDH. Alternatywnie próbki można przechowywać w lodzie, jeśli analiza zostanie przeprowadzona tego samego dnia, lub w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.

4. Pomiar wycieku dehydrogenazy mleczanowej

1. Pomiar wycieku dehydrogenazy mleczanowej (LDH) należy przeprowadzić głównie z wykorzystaniem odczynników i instrukcji dostarczonych w zestawie Promega CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (patrz Tabela specyficznych odczynników i materiałów).
2. Substrat LDH (dołączony do zestawu) należy zrekonstytuować w 12 ml buforu do testu (również dołączonego).
3. Zamrożone zawiesiny komórkowe oraz próbki pożywek należy rozmrozić w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej.
4. Do płytki 96-dołkowej należy nanieść po 50 μl każdej próbki pożywki.
5. Do zawiesiny komórkowej należy dodać odpowiednią objętość 10X buforu do lizy, tak aby stężenie końcowe wynosiło 1X. Próbki należy krótko wymieszać w wortexie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 min.
6. Zlizowane próbki należy wirować z prędkością 250 x g przez 4 min w celu osadzenia szczątków komórkowych.
7. W przypadku lizatów komórkowych należy nanieść 50 μl rozcieńczenia 1:10 do każdego dołka płytki 96-dołkowej.
8. Do każdego dołka należy dodać 50 μl zrekonstytuowanego substratu, a następnie inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 min.
9. Reakcję należy zatrzymać, dodając 50 μl roztworu zatrzymującego (dołączonego do zestawu) do każdego dołka.
10. Absorbancję należy zmierzyć przy długości fali 490 nm.
11. Do obliczenia % wycieku LDH należy zastosować poniższe wzory. Poniższe gęstości optyczne (OD) są wartościami skorygowanymi poprzez odjęcie odczytu tła (blank) z dołka zawierającego wyłącznie PBS, substrat i roztwór zatrzymujący.

LDH w medium = (OD492 medium) x (czynnik rozcieńczenia medium) x (obj. medium)*Ponieważ rozcieńczanie próbek medium jest zazwyczaj niepotrzebne, czynnik rozcieńczenia najczęściej będzie równy 1.

Całkowite LDH = ((OD₄₉₀ lizatu) x (czynnik rozcieńczenia lizatu) x (obj. w zawiesinie komórkowej))+ ((OD₄₉₀ pożywki) x (czynnik rozcieńczenia) x (obj. pożywki pobranej do analizy))

5. Zakażanie komórek acynarnych trzustki adenowirusem

1. Przygotować komórki acinarne trzustki zgodnie z opisem w sekcji 3.
2. Po wykonaniu kroku 3.12, dodać 10⁷ jednostek zakaźnych (IFUs) adenowirusa do zawiesiny komórkowej i inkubować przez 30 min w 37 °C.
3. Równomiernie nanieść 2 ml zawiesiny komórkowej na płytkę 6-dołkową.
4. W przypadku większości konstruktów ekspresyjnych komórki powinny zostać odpowiednio zainfekowane w ciągu 18 hr; w przypadku niektórych konstruktów lucyferazy wystarczy 6 hr.

Wyniki

Przykład pomiarów wapnia w komórkach acynarnych w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne przedstawiono na Ryc. 3. Komórki acynarne obciążono barwnikiem wapnia Fluo-4 i poddano perfuzji analogiem acetylocholiny, karbacholem (CCh; 1 μM) ⁸. Komórki zareagowały w formie fali wapniowej, która rozpoczyna się w regionie apikalnym i rozprzestrzenia się do regionu bazolateralnego ^3,9. Reprezentatywne zapisy przedstawione na Ryc. 3B obrazują typowy wzorzec szczyt-plateau często o...

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda izolacji komórek i późniejsze testy stanowią potężne narzędzia do badania fizjologicznych i patofizjologicznych cech zewnątrzwydzielniczej trzustki. Metoda izolowania rozproszonych komórek groniastych trzustki została po raz pierwszy opisana przez Amsterdama i Jamiesona w 1972 ^roku11. Przedstawione tutaj metody zostały zaadaptowane z nowszych metod izolacji opisanych przez Van Ackera i współpracowników ¹². Chociaż techniki te są wysoce powtarzalne i łatwe do nauczenia, każ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy	NCI	N/A	Male 20-30 gramów; praktycznie każda odmiana powinna dać porównywalne wyniki.
HEPES		Amerykański AB00892
Chlorek sodu	J.T. Baker	3624-05
Chlorek potasu	J.T. Baker	3040-01
Chlorek magnezu	Sigma	M-8266
Chlorek wapnia	Fischer	C79
Dekstroza	J.T. Baker	1916-01
L-Glutamina	Sigma	G-8540
1X minimum Eagle's medium endogenna mieszanina aminokwasów	Gibco	11140-050
Wodorotlenek sodu	EM	SX0593
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A7906
Kolagenaza	Worthington	4188
Inhibitor trypsyny sojowej	Sigma	T-9003
Dwutlenek węgla	Matheson Gas	124-38-9
125 ml Plastikowa kolba Erlenmeyer	Crystalgen	26-0005
Zestaw do preparacji	Fine Science Tools	14161-10
70% etanol	LabChem	LC222102
P1000, P100, P10, P10 Pipety	Gilson	FA10005P
Łódź wagowa	Heathrow Scientific	HS1420A
Plastikowe pipety transferowe	USA Scientific	1020-2500
Probówki stożkowe 15 ml	BD Falcon	352095
Probówki stożkowe 50 ml	BD Falcon	352070
Probówka do mikrowirówek 1,5 ml	Fisher	05-408-129
0,65 ml Probówka do mikrowirówek	VWR	20170-293
Szkiełka nakrywkowe szklane 22 x 22 mm	Fisher	032811-9
Kwas azotowy	Fischer	A483-212
Kwas	Fischer	A142-212
Woda dejonizowana	N/	A N/D
szkiełka nakrywkowe 18 x 18 mm	Fischer	021510-9
Folia laboratoryjna	Parafilm	PM-996
Fluo-4AM	Invitrogen	F14201
Dimetylosulfotlenek	Sigma	D2650
Luer lock	Becton Dickinson	932777
strzykawka 60 ml	BD Bioscience	DG567805
23 ¾ rurka do pomiaru	BD Bioscience	9328270
PE50	Glina Adam	PE50-427411
Wkrętak płaski	N/A	N/A
DMEM F-12, bez czerwieni fenolowej	Gibco	21041-025
Igła o rozmiarze 30,5	BD Bioscience	305106
25 ml Kolba Erlenmeyera	Fischer	FB50025
Nylonowy filtr siatkowy	Nitex	03-150/38	150 um wielkość porów
48 dołkowa płytka do hodowli tkankowej	Costar	3548
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej	Costar	3795
6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej	Costar	3506
Ciekły azot	Matheson Gas	7727-37-9
Zestaw do oznaczania cytotoksyczności	Promega	G1782
Adeno-GFP	N/A	N/A	Prezent od J. Williamsa
Equipment
Ring statyw z zaciskami	United Scientific	SET462
Komora peryfuzyjna	N/A	N/A	Zaprojektowany przez S.Z.H i kolegów z Uniwersytetu Yale
Linia próżniowa	Manostat	72-100-000
Łaźnia wodna z wytrząsarką	Precyzyjny mikroskop konfokalny 51220076
	naukowego Zeiss	LSM 710
Czytnik płytek BioTek Synergy H1	BioTek	11-120-534
Kaptur do hodowli tkankowych	Nuaire	NU-425-600
Inkubator do hodowli tkankowych	Thermo	3110

Bioanalityczny solny 5 CC strzykawka BD Bioscience 309603