Pirosekwencjonowanie w celu identyfikacji i charakterystyki drobnoustrojów

Summary

Pirosekwencjonowanie to wszechstronna technika, która ułatwia sekwencjonowanie genomu drobnoustrojów, które może być używane do identyfikacji gatunków bakterii, rozróżniania szczepów bakteryjnych i wykrywania mutacji genetycznych, które nadają odporność na środki przeciwdrobnoustrojowe. W tym filmie zostanie zademonstrowana procedura generowania amplikonów drobnoustrojów, pirosekwencjonowania amplikonów i analizy sekwencji DNA.

Abstract

Pirosekwencjonowanie to wszechstronna technika, która ułatwia sekwencjonowanie genomu drobnoustrojów, które może być wykorzystane do identyfikacji gatunków bakterii, rozróżniania szczepów bakteryjnych i wykrywania mutacji genetycznych, które nadają odporność na środki przeciwdrobnoustrojowe. Do zalet pirosekwencjonowania w zastosowaniach mikrobiologicznych należą szybkie i niezawodne badania przesiewowe o wysokiej przepustowości oraz dokładna identyfikacja drobnoustrojów i mutacji genomu drobnoustrojów. Pirosekwencjonowanie polega na sekwencjonowaniu DNA poprzez syntezę komplementarnej nici pojedynczej zasady na raz, przy jednoczesnym określeniu specyficznego nukleotydu włączanego podczas reakcji syntezy. Reakcja zachodzi na unieruchomionym jednoniciowym matrycowym DNA, w którym cztery dezoksyrybonukleotydy (dNTP) są dodawane sekwencyjnie, a niewłączone dNTP są enzymatycznie degradowane przed dodaniem następnego dNTP do reakcji syntezy. Wykrywanie określonej zasady wbudowanej w matrycę jest monitorowane poprzez generowanie sygnałów chemiluminescencyjnych. Kolejność dNTP, które wytwarzają sygnały chemiluminescencyjne, określa sekwencję DNA matrycy. Zdolność sekwencjonowania w czasie rzeczywistym w technologii pirosekwencjonowania umożliwia szybką identyfikację drobnoustrojów w jednym teście. Ponadto przyrząd do sekwencjonowania pirologicznego może analizować pełną różnorodność genetyczną oporności na leki przeciwdrobnoustrojowe, w tym typowanie SNP, mutacje punktowe, insercje i delecje, a także kwantyfikację wielu kopii genów, które mogą wystąpić w niektórych wzorcach oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Introduction

Pirosekwencjonowanie to szybka i dokładna metoda sekwencjonowania kwasów nukleinowych, która opiera się na zasadzie "sekwencjonowania przez syntezę". "Sekwencjonowanie przez syntezę" polega na użyciu pojedynczej nici matrycy DNA do syntezy nici komplementarnej po jednej zasadzie na raz i wykrywaniu włączonej zasady (A, T, G lub C) na każdym etapie poprzez detekcję sygnału chemiluminescencyjnego. Reakcja pirosekwencjonowania obejmuje matrycę DNA, dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), polimerazę DNA, sulfurylazę ATP, lucyferynę, lucyferazę i apirazę. Reakcja syntezy jest inicjowana przez dodanie jednego z czterech dNTP i polimerazy DNA do jednoniciowego biotynylowanego matrycowego DNA. Polimeraza DNA włącza komplementarny dNTP do matrycy, a następnie uwalnia pirofosforan (ryc. 1). Sulfurylaza ATP proporcjonalnie przekształca pirofosforan w ATP. ATP działa jako katalizator przemiany lucyferyny w oksylucyferynę, w której pośredniczy lucyferazy, co generuje światło (ryc. 2). Intensywność światła jest proporcjonalna do liczby włączonych nukleotydów i określa, czy jeden lub więcej specyficznych dNTP (dATP, dTTP, dGTP lub dCTP) jest kolejno obecne na nici matrycy (ryc. 3). Każdy nieinkorporowany dNTP jest degradowany przez apyrazę przed dodaniem następnego dNTP w celu kontynuacji reakcji syntezy. Tę reakcję "sekwencjonowania przez syntezę" powtarza się z dodaniem każdego z czterech dNTP, aż do określenia sekwencji DNA jednoniciowej matrycy DNA.

Aby zobaczyć animację reakcji pirosekwencjonowania Kliknij tutaj, aby wyświetlić film.

Protocol

Wprowadzenie: Pojedyncza kolonia bakteryjna powinna być użyta do zaszczepienia odpowiedniego bulionu kulturowego, który jest inkubowany przez noc. Osad bakteryjny jest następnie przetwarzany w celu oczyszczenia genomowego DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do izolacji genomu. Oczyszczony genomowy DNA powinien mieć stosunek 260/280 (nm) >1,8, aby zapewnić, że próbka jest wolna od zanieczyszczenia białkowego. Ilość genomowego DNA potrzebna do wytworzenia matrycy do pirosekwencjonowania wynosi 10-20 ng.

A. Wzmocnienie szablonu

(Podręcznik PCR PyroMark; www.qiagen.com/handbooks¹)

Ustawianie reakcji PCR

Uwaga: Jeden starter musi być biotynylowany na końcu 5' i zaleca się, aby został oczyszczony metodą HPLC w celu przygotowania szablonu. Zalecamy oprogramowanie PyroMark Assay Design Software 2.0 do projektowania PCR i sekwencyjnego startera, które jest zoptymalizowane pod kątem sekwencjonowania z krótkim odczytem, jednak Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome) firmy NCBI może być również używany do projektowania starterów.

1. Rozmrozić wszystkie wymagane roztwory (wymienione w tabeli 1) i dokładnie wymieszać. Ustawić reakcję zgodnie z tabelą 1. Wszystkie prace można wykonać w temperaturze pokojowej.

Uwaga: PCR Master Mix zawiera MgCl₂ dla końcowego stężenia 1,5 mM, co zapewnia zadowalające wyniki w większości przypadków. Jeśli wymagane jest wyższe stężenie^Mg2+, do reakcji można dodać do 3,5 μl 25 mM MgCl₂

.

2. Dokładnie wymieszaj mieszaninę reakcyjną, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie dozuj odpowiednie objętości do probówek PCR.
3. Dodaj matrycę DNA do każdej probówki PCR. Zalecamy 10 ng genomowego DNA.
4. Zaprogramować termocykler zgodnie z tabelą 2. Dla wygody zaleca się końcowe trzymanie w temperaturze 4 °C. W przypadku korzystania z termocyklera bez podgrzewanej pokrywy, reakcje należy nałożyć na 100 μl oleju mineralnego.
5. Umieść probówki PCR w cyklerze i uruchom program rowerowy.

B. Protokół stacji roboczej odkurzacza

Unieruchamianie biotynylowanych produktów PCR

1. Przygotuj mieszankę wzorcową zgodnie z rysunkiem 4.

Uwaga: Przed pipetowaniem delikatnie wstrząśnij butelką z kulkami Sepharose pokrytymi streptawidyną, aby zapewnić jednorodną zawiesinę.

2. W zależności od objętości użytego produktu PCR, dozować 60-75 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki PCR, aby uzyskać całkowitą objętość 80 μl na dołek.
3. Do każdej studzienki dodać 5-20 μl biotynylowanego produktu PCR.
4. Uszczelnić studzienki nakrętkami paskowymi i mieszać płytkę PCR z prędkością 1 400 obr./min przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej (15-25 °C) za pomocą wytrząsarki orbitalnej.

Denaturacja DNA i dodanie startera sekwencjonującego

1. Rozcieńczyć startery sekwencyjne do 0,3 μM buforem do wyżarzania i dozować 25 μl do każdego dołka płytki reakcyjnej. Umieść tabliczkę na stacji roboczej.
2. Napełnij koryta stanowiska pracy zgodnie ze schematem Rysunek 5.
3. Włącz pompę próżniową i upewnij się, że przełącznik na przyrządzie próżniowym jest ustawiony w pozycji włączonej (Rysunek 6). Przepłucz sondy filtra wodą o wysokiej czystości (Milli-Q 18.2 MW x cm lub odpowiednik) w rynnie 5 (Rysunek 5). Napełnij koryto świeżą wodą o wysokiej czystości do użycia w kroku 12.
4. Pracując szybko, umieść płytkę PCR z koralikami na stacji roboczej. Upewnij się, że obie płytki są w tej samej orientacji, co w momencie ładowania próbek.
5. Przy włączonym przełączniku podciśnienia opuść narzędzie próżniowe do dołków płytki PCR na 20 sekund lub do momentu, gdy cała objętość zostanie zassana. Koraliki zostaną przechwycone przez narzędzie próżniowe (Rysunek 7).
6. Gdy próżnia jest nadal włączona, przepłukać narzędzie 70% etanolem (koryto 1) przez 20 sekund lub do momentu, gdy cała objętość zostanie zassana.
7. Przy włączonym podciśnieniu przepłukać narzędzie roztworem denaturacyjnym (koryto 2) przez 20 sekund lub do momentu, gdy cała objętość zostanie zassana.

Uwaga: Roztwór do denaturacji zawiera wodorotlenek sodu, który działa drażniąco na oczy i skórę. Zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne.

8. Przy włączonym podciśnieniu płucz narzędzie buforem do płukania (koryto 3) przez 20 sekund lub do momentu, gdy cała objętość zostanie zassana.
9. Przy włączonym podciśnieniu podnieś narzędzie próżniowe poza 90° w pionie na 5 sekund, aby umożliwić spływanie całego płynu z narzędzia próżniowego. Wyłącz pompę i wyrównaj narzędzie próżniowe z płytką reakcyjną. Opuść narzędzie próżniowe do studzienek i delikatnie potrząśnij z boku na bok, aby uwolnić kulki do studzienek zawierających starter sekwencyjny.
10. W celu wyczyszczenia narzędzia próżniowego należy mieszać sondy filtrujące w wodzie o wysokiej czystości (koryto 4) przez 10 sekund.
11. Włącz odkurzacz i przepłucz narzędzie wodą o wysokiej czystości (koryto 5) przez 20 sekund lub do momentu, gdy cała objętość zostanie zassana.
12. Podnieś odkurzacz powyżej 90°C w pionie na 5 sekund, a następnie wyłącz odkurzacz i przechowuj w pozycji "Parking".

Wyżarzanie startera sekwencjonowania nici DNA

1. Umieścić płytkę reakcyjną we wstępnie ogrzanym uchwycie na płytki.
2. Podgrzewać płytkę na bloku grzewczym w temperaturze 80 °C przez 2 minuty.
3. Wyjmij płytkę z uchwytu i umieść na blacie do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 minut.

Operacja Pyromark Q24

Uwaga: Włącz instrument za pomocą przełącznika zasilania znajdującego się nad przewodem zasilającym. Uruchomienie może potrwać do 1 minuty.

1. Napełnij kartusz zgodnie z instrukcjami zawartymi w Podręczniku odczynników PyroMark Gold Q24 2. Aby określić wymagane woluminy, należy skonfigurować plik uruchamiania w oprogramowaniu instrumentu, a następnie w menu Narzędzia wybierz opcję Pre Run Information (Informacje przed uruchomieniem)
2. Jeśli instrument był już włączony, upewnij się, że nie wykonuje biegu, a następnie otwórz pokrywę. Dźwiękowy sygnał ostrzegawczy zostanie wyemitowany, jeśli pokrywa zostanie otwarta, gdy jest to niebezpieczne.
3. Otwórz zasuwę naboju i włóż kasetę z etykietą skierowaną do przodu (Rysunek 8). Upewnij się, że wkład jest prawidłowo włożony (z przodu powinna być widoczna linia) i zamknij zasuwę.
4. Otwórz ramkę mocującą płytkę i umieść płytkę z próbkami wewnątrz urządzenia.
5. Zamknij ramkę przytrzymującą płytę i pokrywę instrumentu (Rysunek 9).

Rozpoczynanie biegu

1. Włóż pamięć USB z plikami uruchamiania utworzonymi za pomocą oprogramowania instrumentu do portu USB z przodu instrumentu.
2. Wybierz "Uruchom" w menu głównym i naciśnij "OK".
3. Użyj strzałek przewijania, aby wybrać żądany plik uruchamiania i naciśnij "Wybierz".

Uwaga: Przyrząd rozpocznie dozowanie odczynników po osiągnięciu wszystkich ustawionych poziomów ciśnienia i temperatury (może to potrwać kilka minut). Podczas biegu na ekranie przyrządu wyświetlany jest pyrogram wybranego odwiertu w czasie rzeczywistym. Użyj strzałek przewijania, aby zobaczyć pirogram innych studni.

Ukończenie biegu

1. Gdy przyrząd potwierdzi, że przebieg został zakończony, a przebieg file został zapisany w pamięci USB, naciśnij "Zamknij".
2. Odłącz pamięć USB. Jeśli została usunięta przed zakończeniem biegu, włóż pamięć USB. Wybierz "Administracja", a następnie "Kopiuj niezapisane przebiegi".
3. Plik roboczy można teraz otworzyć i przeanalizować za pomocą oprogramowania urządzenia i porównać z biblioteką znanych mikroorganizmów za pomocą oprogramowania Identifire.

Results

Wyniki typowego przebiegu pirosekwencjonowania przy użyciu oprogramowania pokazują lokalizację starterów do przodu i do tyłu używanych do generowania amplikonów, oraz startera sekwencjonowania używanego do reakcji pirosekwencjonowania w konserwatywnej sekwencji rybosomalnej 16S (Rysunek 10). Hiperzmienna sekwencja między miejscami starterów pozwala na identyfikację bakteryjną dużej liczby gatunków bakterii przy użyciu konserwatywnego startera sekwencjonowania (5'-TACATGCAAGTCGA). W ramach wewnętrznej kontroli jakości, sekwencja DNA obejmująca region zmienny może być sprawdzona, aby upewnić się, że przeanalizowano właściwy region DNA. Oprogramowanie do sekwencjonowania pirosulacji pozwala na porównanie i dopasowanie wygenerowanej sekwencji do wewnętrznej bazy danych sekwencji rybosomalnych bakterii w celu identyfikacji bakterii. Ponadto sekwencja może być analizowana w celu określenia mutacji, które nadają oporność na antybiotyki. Na przykład analiza mutacji w genach rybosomalnych 23S Helicobacter pylori wykazuje dwa wzorce mutacji (GAA lub AGA), które nadają oporność na antybiotyki (Figura 11). Analiza wielu izolatów od tego samego pacjenta może być jednocześnie badana w celu śledzenia pojawiania się oporności na leki w czasie, aby pomóc w badaniach epidemiologicznych ognisk oporności drobnoustrojów na leki.

Rysunek 1. Biotynylowany produkt PCR jest stosowany jako matryca do włączania dNTP przez polimerazę DNA, co prowadzi do wytworzenia pirofosforanu (PPi).

Rysunek 2. Sulfurylaza ATP proporcjonalnie przekształca pirofosforan w ATP. ATP działa jako katalizator przemiany lucyferyny w oksylucyferynę, w której pośredniczy lucyferazy, co generuje światło proporcjonalne do ilości ATP. Światło jest rejestrowane jako pik na śladzie pirogramu i wskazuje na inkorporację nukleotydów. Niewłączone dNTP są degradowane przez apyrazę przed dodaniem następnego dNTP w celu kontynuacji syntezy.

Rysunek 3. Natężenie generowanego światła wskazuje, czy co najmniej jeden określony dNTP (dATP, dTTP, dGTP lub dCTP) został sekwencyjnie włączony do nici matrycy.

Rysunek 4. Schemat blokowy przygotowania mieszanki wzorcowej w celu unieruchomienia biotynylowanego produktu PCR.

Rysunek 5. Stacja robocza PyroMark, z płytką PCR, płytką PyroMark i lokalizacjami koryt.

Rysunek 6. Lokalizacje pozycji włączania i wyłączania próżni.

Rysunek 7. Narzędzie próżniowe. Prawidłowe obchodzenie się z narzędziem próżniowym.

Rysunek 8. Bramka naboju otwarta z wkładem na miejscu.

Rysunek 9. Wkład prawidłowo włożony z zamkniętą bramką.

Rysunek 10. Wyniki identyfikacji bakterii na podstawie pirosekwencjonowania. Startery PCR są przeznaczone dla konserwatywnych regionów matrycy DNA, a starter sekwencjonowania jest umieszczany bezpośrednio przed dobrze scharakteryzowaną identyfikującą hiperzmienną sekwencją DNA w amplikonie (pokazaną na niebiesko).

Rysunek 11. Wykrywanie antybiotykooporności Helicobacter pylori za pomocą pirosekwencjonowania. Analiza mutacji w genach 23S, które nadają oporność przeciwbakteryjną u Helicobacter pylori zawierającej sekwencje GAA lub AGA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

składnik	Objętość na reakcję	Końcowe stężenie
Pyro PCR Master Mix, 2x	12,5 μl	1x
Koncentrat CoralLoad, 10x	2,5 μl	1x
25 mM MgCl2 (opcjonalnie)	zmienna	≥1,5 mM
Q-Solution, 5x (opcjonalnie)	5 μl	1x
Podkład A/Grunt B	Zmienna/Zmienna	0,2 μM/0,2 μM
Woda wolna od RNaz	zmienna	-
Całkowita objętość (po dodaniu matrycy DNA)	25 μl

Tabela 1. Mieszanina reakcyjna PCR.

			Uwagi dodatkowe
Wstępny etap aktywacji PCR	Czas trwania: 15 min	95 °C	Polimeraza DNA HotStartTaq jest aktywowana
3 kroki na rowerze: Denaturacja	30 sekund	94 °C
Wyżarzanie	30 sekund	60 °C 56 °C	Dla genomowego DNA Dla DNA przekształconego w wodorosiarczyn
rozszerzenie	30 sekund	72 °C
Liczba cykli	Rozdział 45
Końcowe przedłużenie	Czas trwania: 10 min	72 °C

Tabela 2. Specyfikacja cyklu PCR.

Discussion

Skomercjalizowano kilka nowych metod sekwencjonowania nowej generacji. Trzy z najczęściej stosowanych metod to sekwencjonowanie półprzewodników jonowych, sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym i sekwencjonowanie przez syntezę (SBS). ^3-11 Każda z tych metod opiera się na sekwencjonowaniu przez syntezę, ale wykorzystuje nowatorskie platformy do wykrywania włączonych nukleotydów. W sekwencjonowaniu półprzewodników jonowych pojedyncza nić DNA służy jako matryca dla nici sekwencjonowania. ¹² Polimerazę i nukleotydy dodaje się sekwencyjnie, tak jak w przypadku pirosekwencjonowania. Kiedy nukleotyd jest dodawany do rosnącej nici DNA, uwalniany jest jon wodorowy. Jon wodorowy jest wykrywany przez czujnik oparty na tranzystorze polowym.

Sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki w czasie rzeczywistym zależy od falowodu w trybie zerowym (ZMW). ¹³ ZMW jest małą strukturą, w której pojedyncza cząsteczka polimerazy jest przyłączona do dna studni. Jest oświetlony w taki sposób, że można wykryć cząsteczkę fluorescencyjną. Każdy nukleotyd jest oznaczony cząsteczką fluorescencyjną. Po włączeniu fluorescencyjnie znakowanego nukleotydu detektor identyfikuje nukleotyd. Po dodaniu kolejnego nukleotydu cząsteczka fluorescencyjna jest rozszczepiana. ¹⁴

Sekwencjonowanie przez syntezę (SBS) wykorzystuje unikalną metodę amplifikacji docelowego DNA w taki sposób, że generowane są klastry unikalnych sekwencji. Generowanych jest ¹⁵ jednoniciowych szablonów, a następnie syntetyzowana jest nić komplementarna. Każdy nukleotyd jest znakowany cząsteczką fluorescencyjną, a po każdym dodaniu zasady rejestrowana jest fluorescencja dodanej zasady.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PyroMark PCR Master Mix, 2x	Qiagen	978703
CoralLoad Concentrate, 10x	Qiagen	978703, 978705
Q-Solution, 5x	Qiagen	978703, 978705
MgCl2, 25 mM	Qiagen	978703, 978705
Woda bez RNaz	Qiagen	129112
Primers	Startery Qiagen	978776 lub 978777	należy zakupić od uznanego producenta oligonukleotydów (tj. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT itp.). Liofilizowane startery należy rozpuścić w TE, aby uzyskać roztwór podstawowy 100 μM.
Odczynniki Pyromark Gold Q24	Qiagen	970802
Woda o wysokiej czystości (Milli-Q 18,2 MΩ x cm lub odpowiednik)
Streptawidyna Sepharose Wysokowydajne kulki	GE Healthcare	17-5113-07
PyroMark Bufor do wyżarzania	Qiagen	979009
Roztwór do denaturacji PyroMark	Qiagen	979007
Bufor myjący PyroMark	Qiagen	979008
PyroMark Q24	Qiagen	9001514
Wkład PyroMark Q24	Qiagen	979202
PyroMark Q96 HS Skrzynka z uchwytem na końcówki	Qiagen	979105
Stacja robocza PyroMark Q24	Qiagen	9001516
Uchwyt na płytę PyroMark Q24	Qiagen
Wytrząsarka orbitalna	Fisher	11-675-297
Blok grzewczy	Fisher	11-718Q