Szybkie, wysokoprzepustowe oznaczanie amylozy w liofilizowanych próbkach bulw ziemniaka

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę kolorymetryczną o wysokiej przepustowości, która opiera się na tworzeniu kompleksu pomiędzy jodem a łańcuchami cząsteczek glukozy w skrobi. Jod tworzy kompleksy zarówno z amylozą, jak i długimi łańcuchami w amylopektynie. Po dodaniu jodu do próbki skrobi maksymalne wchłanianie amylozy i amylopektyny następuje odpowiednio przy 620 i 550 nm. Stosunek amylozy do amylopektyny można oszacować na podstawie stosunku wartości absorbancji 620 i 550 nm i porównać je z krzywą standardową, w której określone znane stężenia są wykreślane w stosunku do wartości absorpcji. Ta wysokowydajna, niedroga metoda jest niezawodna i powtarzalna, umożliwiając ocenę dużych populacji klonów ziemniaków.

Streszczenie

Ten protokół opisuje metodę kolorymetryczną o wysokiej przepustowości, która opiera się na tworzeniu kompleksu pomiędzy jodem a łańcuchami cząsteczek glukozy w skrobi. Jod tworzy kompleksy zarówno z amylozą, jak i długimi łańcuchami w amylopektynie. Po dodaniu jodu do próbki skrobi maksymalne wchłanianie amylozy i amylopektyny następuje odpowiednio przy 620 i 550 nm. Stosunek amylozy do amylopektyny można oszacować na podstawie stosunku wartości absorbancji 620 i 550 nm i porównać je z krzywą standardową, w której określone znane stężenia są wykreślane w stosunku do wartości absorpcji. Ta wysokowydajna, niedroga metoda jest niezawodna i powtarzalna, umożliwiając ocenę dużych populacji klonów ziemniaków.

Wprowadzenie

Około 80% świeżej masy bulwy ziemniaka to woda; prawie cała pozostała sucha masa to skrobia¹. Większość skrobi (70%) składa się z amylopektyny, a pozostała część to amyloza. Stosunek amylozy do amylopektyny jest najważniejszą właściwością wpływającą na właściwości fizyczne skrobi. Amyloza jest liniowym łańcuchem glukozy alfa 1-4, podczas gdy amylopektyna jest liniowym łańcuchem alfa 1-4 z gałęziami alfa 1-6². Opracowano metody takie jak wiązanie jodu, różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC), wysokosprawna chromatografia wykluczająca (HPSEC) i interakcje konkanawaliny A do oznaczania skrobi w różnych gatunkach roślin uprawnych^3,4. Każdy protokół wymaga specjalnych umiejętności i sprzętu, co utrudnia zwiększenie skali w celu ilościowego oznaczania wielu próbek jednocześnie. Metoda, którą tutaj prezentujemy, to zmodyfikowany protokół firmy Hovenkamp-Hermelink i wsp.⁵, która jest metodą wiązania jodu o podwójnej długości fali opartą na barwionych granulkach skrobi. Do zalet tej metody w porównaniu z innymi należy oznaczanie amylozy z surowej skrobi bez jej oczyszczania oraz zastosowanie systemu podwójnej długości fali w celu zwiększenia precyzji metody^4,6.

Protokół

1. Oznaczanie amylozy ze skrobi z bulw ziemniaka

1. Świeże bulwy obrać i pokroić w drobną kostkę.
2. Umieść kostki ziemniaczane w małych brązowych torebkach i przechowuj przez noc w temperaturze -80 °C.
3. Przenieś kostki ziemniaczane do nylonowych torebek i do liofilizacji.
4. Po wysuszeniu liofilizowanym zmiel próbkę ziemniaka na proszek za pomocą moździerza i tłuczka lub młynka Wiley.
5. Do probówki o pojemności 50 ml dodać 20-30 mg liofilizowanej, zmielonej próbki bulw.
6. Przygotować roztwór 45% (w/v) kwasu nadchlorowego (wymieszać 24,4 ml 60% kwasu nadchlorowego i 25,6 ml ultraczystej wody.
7. Dodać 500 μl 45% (w/v) kwasu nadchlorowego i wstrząsnąć lub zamieszać, aby rozproszyć granulki skrobi.
8. Po czterominutowym okresie inkubacji w temperaturze pokojowej dodać 16 ml ultraczystej wody do roztworu i wymieszać przez wirowanie.
9. Po opadnięciu nierozpuszczalnego materiału na dno probówki (7-10 minut później) przenieś 40 μl roztworu na płytkę do mikromiareczkowania (unikając pipetowania jakichkolwiek cząstek).
10. Dodać 50 μl roztworu jodu (2 g KI + 1 g I₂ w 900 ml ultraczystej wody) i wymieszać próbkę pipetując.
11. Natychmiast odczytać absorbancję przy 550 nm i 620 nm.
12. Oznaczyć zawartość procentową amylozy po porównaniu stosunku amylozy do amylopektyny w każdej próbce (absorbancja 620 nm/550 nm) z krzywą wzorcową otrzymaną z roztworów amylozy i amylopektyny w zakresie stężeń. Ta procedura zostanie opisana dalej. Odczytać ślepą próbę (roztwór jodu i kwas nadchlorowy) wraz z próbkami testowymi. Do analiz należy używać pustych danych.

2. Krzywa amylozy/amylopektyny

1. W oddzielnych probówkach odważyć 12,5 mg amylozy i 12,5 mg amylopektyny.
2. Dodać do każdej probówki 5 ml 45% (m/v) kwasu nadchlorowego i całkowicie rozpuścić.
3. Dla każdego z roztworów (amylozy i amylopektyny) doprowadzić do końcowej objętości 50 ml ultraczystą wodą.
4. Wymieszaj 6,25 ml bulionu amylozy z poprzedniego kroku z 18,75 ml ultraczystej wody. W ten sposób otrzymamy 6,25 mg/ml roztworu amylozy.
5. Powtórz procedurę dla roztworu amylopektyny.
6. Korzystając z roztworów wzorcowych amylozy i amylopektyny z kroków 2.4 i 2.5, przygotuj procentowe wzorce amylozy, które wynoszą 0-100% amylozy (100-0% amylopektyny) do końcowej objętości 5 ml, aby utworzyć krzywą wzorcową w odstępach 10%.
   Na przykład, aby przygotować:
   Wzorzec 0% amylozy / 100% amylopektyny, pipeta 5 ml roztworu amylopektyny.
   Wzorzec 10% amylozy / 90% amylopektyny, połącz 0,5 ml roztworów amylozy i 4,5 ml amylopektyny.
   Wzorzec 20% amylozy / 80% amylopektyny, połącz 1,0 ml roztworów amylozy i 4,0 ml amylopektyny.
   Wzorzec 30% amylozy / 70% amylopektyny, połącz 1,5 ml roztworów amylozy i 3,5 ml amylopektyny.
   Standardowy 40% amylozy / 60% amylopektyny, połącz 2,0 ml roztworów amylozy i 2,0 ml amylopektyny.
   Wzorzec 50% amylozy / 50% amylopektyny, połącz 2,5 ml roztworów amylozy i 2,5 ml amylopektyny.
   Standard 60% amylozy / 40% amylopektyny, połącz 3,0 ml amylozy i 2,0 ml amylopektyny i tak dalej).
7. Przenieść 40 μl każdej mieszaniny wzorcowej na płytkę do mikromiareczkowania. Jako ślepą próbę należy dołączyć studzienkę z 40 μl 45% (w/v) kwasu nadchlorowego.
8. Dodać 50 μl roztworu jodu (2 g KI + 1 g I₂ w 900 ml ultraczystej wody) i wymieszać każdą próbkę (łącznie z ślepą próbą) przez pipetowanie.
9. Natychmiast odczytać absorbancja przy 550 nm i 620 nm i obliczyć stosunek amylozy do amylopektyny dla każdego stężenia.

Wyniki

Krzywa wzorcowa sporządzona na podstawie danych po odjęciu tła dla roztworów o różnych stężeniach amylozy/amylopektyny wykazuje przybliżone stosunki absorbancji w zakresie od 0,7 do 1,6 (Tabela 1). Linia trendu regresji liniowej uzyskana z tych danych jest następnie wykorzystywana do wyznaczenia zawartości amylozy w liofilizowanych próbkach ziemniaka (Rysunek 1).

Środowisko produkcji roślin ma pewien wpływ na zawartość amylozy w bulwach ziemniaka⁷. ...

Dyskusja

Zawartość amylozy w bulwach ziemniaka waha się zazwyczaj od 20 do 35%^7,8. Jeśli większość wartości wykracza poza ten zakres, należy wziąć pod uwagę następujące możliwe błędy: 1) do budowy krzywej standardowej amylozy/amylopektyny użyto surowych danych zamiast pustych danych; 2) zamiast danych zerowych wykorzystano surowe dane do określenia stosunku amylozy do amylopektyny w próbkach ziemniaków; lub 3) woda użyta do analizy nie była wystarczająco czysta. Zauważyliśmy, że przy użyciu w analizie wody destylowanej...

Materiały

Sprzęt

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
Amyloza	Sigma	859656
Amylopektyna	Sigma	A8515
Kwas nadchlorowy 60%	Sigma	311413	Bardzo niebezpieczny dla skóry i oczu
Jod	Sigma	23214TD
Jodek potasu	Sigma	08625JE
Czytnik płytek	Bio Tek	ELx800

<td colspan="4">