Zastosowanie obrazowania in vivo do monitorowania postępu eksperymentalnego zakażenia mysim wirusem cytomegalii u noworodków

Podsumowanie

Zakażenie noworodków ludzkim wirusem cytomegalii (HCMV) stanowi ważną przyczynę upośledzenia umysłowego, jednak zdarzenia molekularne prowadzące do patogenezy wywołanej przez wirusa są nadal słabo poznane. Aby zbadać dynamikę infekcji mózgu, dostosowaliśmy obrazowanie in vivo całych zwierząt do przeprowadzenia analizy przebiegu w czasie noworodków zakażonych wirusem rekombinowanym lucyferazy.

Streszczenie

Ludzki wirus cytomegalii (HCMV lub HHV-5) jest zagrażającym życiu patogenem u osób z obniżoną odpornością. W przypadku infekcji wrodzonej lub noworodkowej wirus może zakażać i replikować się w rozwijającym się mózgu, co może wywołać poważne uszkodzenia neurologiczne, w tym głuchotę i upośledzenie umysłowe. Pomimo potencjalnego nasilenia objawów, możliwości terapeutyczne są ograniczone ze względu na niedostępność szczepionki i brak specyficznej terapii przeciwwirusowej. Ponadto nadal brakuje precyzyjnego opisu zdarzeń molekularnych zachodzących podczas zakażenia ośrodkowego układu nerwowego (OUN), ponieważ obserwacje pochodzą głównie z sekcji zwłok zakażonych dzieci. Opracowano kilka modeli zwierzęcych, takich jak CMV makaka rezusa, które dostarczyły ważnych informacji na temat patogenezy CMV w OUN. Jednak pomimo ewolucyjnej bliskości z ludźmi, model ten był ograniczony przez procedurę inokulacji wewnątrzczaszkowej stosowaną do zakażania zwierząt i konsekwentnego wywoływania infekcji OUN. Co więcej, względy etyczne przyczyniły się do opracowania alternatywnych modeli, wśród których zakażenie nowonarodzonych myszy wirusem cytomegalii myszy (MCMV) doprowadziło ostatnio do znacznych postępów. Na przykład dooniesiono, że dootrzewnowe wstrzyknięcie MCMV noworodkom Balb/c prowadzi do infekcji neuronów i komórek glejowych w określonych obszarach mózgu. Odkrycia te sugerują, że eksperymentalna inokulacja myszy może podsumować deficyty wywołane zakażeniem HCMV u dzieci. Niemniej jednak dynamiczna analiza zakażenia MCMV noworodków jest trudna do przeprowadzenia, ponieważ klasyczna metodologia wymaga poświęcenia znacznej liczby zwierząt w różnych punktach czasowych w celu przeanalizowania obciążenia wirusem i/lub parametrów związanych z odpornością. Aby obejść to wąskie gardło i umożliwić przyszłe badania rzadkich zmutowanych zwierząt, zastosowaliśmy technologię obrazowania in vivo w celu przeprowadzenia analizy przebiegu w czasie rozprzestrzeniania się wirusa w mózgu po obwodowym wstrzyknięciu rekombinowanego MCMV eksprymującego lucyferazy do noworodków C57Bl / 6.

Wprowadzenie

Ludzki wirus cytomegalii (HCMV/HHV-5) należy do rodziny β-herpeswirusów. HCMV jest bardzo rozpowszechnionym, oportunistycznym patogenem, który zwykle nabywa się we wczesnym okresie życia jako zakażenie bezobjawowe ¹. Podobnie jak wszystkie herpeswirusy, HCMV utrzymuje się przez całe życie gospodarza, którego układ odpornościowy ściśle kontroluje replikację wirusa. Epizody reaktywacji wirusa występują głównie u osób z obniżoną odpornością, takich jak pacjenci po przeszczepie, otrzymujący leki zapobiegające odrzuceniu przeszczepu ². U dorosłych HCMV jest również powiązany z glejakami ³. Ponadto HCMV jest znaczącym patogenem dla noworodków z niedojrzałą odpornością ^4-6. Pierwotne zakażenie u rozwijającego się płodu lub noworodka może mieć poważne konsekwencje. Zakażenie HCMV jest najczęstszą przyczyną infekcyjną wrodzonych wad wrodzonych i zaburzeń wieku dziecięcego w krajach rozwiniętych. Szacuje się, że częstość występowania zakażenia HCMV u noworodków dotyka 0,5-1% wszystkich żywych urodzeń, z czego 5-10% będzie cierpieć na ciężkie objawy, takie jak małogłowie czy hipoplazja móżdżku. Ponadto u 10% zakażonych niemowląt z subkliniczną infekcją wirusową rozwiną się później następstwa prowadzące do upośledzenia umysłowego, utraty słuchu, wad wzroku lub drgawek i epilepsji ^7,8.

W przeciwieństwie do innych ludzkich herpeswirusów, takich jak Herpes Simplex 1 (HSV-1/HHV-1), które mogą być inokulowane myszom różnymi drogami iniekcji ⁹, replikacja wirusa cytomegalii jest specyficzna dla gatunku. Ta cecha poważnie utrudniła badania patogenezy HCMV, które są przeprowadzane na różnych modelach zwierzęcych (mysz, szczur, świnka morska, rezus) i ich odpowiednich prawdziwych CMV specyficznych dla gospodarza. Wszystkie CMV wykazują znaczące podobieństwa w wielkości i organizacji genomu, tropizmie tkankowym i regulacji ekspresji genów. Wywołują również podobne patologie u swojego gospodarza. Pomimo różnorodności genomowej między HCMV a mysim wirusem cytomegalii (MCMV) (50% ORF obecnych w ludzkim wirusie jest identyfikowanych w mysim CMV), model mysi okazał się ostatnio korzystny, głównie dlatego, że zmutowane szczepy mogą być testowane pod kątem ich zdolności do kontrolowania replikacji wirusa in vivo. Doprowadziło to do genetycznego badania przesiewowego, które umożliwiło oszacowanie liczby genów myszy ulegających ekspresji w stadium dorosłym, które składają się na "rezystom" tego wirusa ¹⁰. Wszystko to wskazuje, że myszy zakażone MCMV stanowią atrakcyjny model do badania interakcji gospodarz-wirus u dorosłych. Badanie wrodzonego zakażenia CMV jest bardziej złożone, ponieważ różnice w organizacji warstwy łożyskowej między człowiekiem a myszami upośledzają transmisję infekcji wirusowej z matki na płód u myszy. Ostatnio bezpośrednie wstrzyknięcie MCMV do łożyska w 12,5 dniu ciąży umożliwiło zakażenie mózgu noworodków myszy, co doprowadziło do upośledzenia słuchu ¹¹. Jednak większość badań wykorzystuje obecnie wstrzyknięcie dootrzewnowe noworodkom w wieku 4-20 godzin, aby zapewnić ogólnoustrojowe rozprzestrzenianie się wirusa, potencjalnie prowadzące do hematogennego zakażenia mózgu, model, który jest bardziej odpowiedni niż wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe. Protokół ten dostarczył ważnych informacji na temat patogenezy CMV, a w szczególności wykazano, że zakażenie MCMV noworodków powoduje replikację wirusa w komórkach neuronalnych i glejowych zlokalizowanych w ogniskach zapalnych, które są naciekane komórkami jednojądrzastymi, takimi jak makrofagi ¹². W raporcie opisano również zmienioną morfogenezę móżdżku, której towarzyszy zmniejszona proliferacja i migracja neuronów ziarnistych oraz indukcja wielu genów stymulowanych interferonem. Zasadnicza rola limfocytów T CD8 + w kontroli MCMV w ośrodkowym układzie nerwowym została również zgłoszona przez tę samą grupę ¹³. Ważnym aspektem, który należy wziąć pod uwagę podczas analizy patologicznego wpływu drobnoustroju, jest dynamika infekcji. W przypadku MCMV szczególnie ważne jest zbadanie i ilościowe określenie progresji rozprzestrzeniania się wirusa w rozwijającym się mózgu, aby zrozumieć i przewidzieć skalę przyszłych urazów neurobiologicznych. Tradycyjnie, kwantyfikacja postępu infekcji wymaga regularnego składania ofiar z zakażonych zwierząt w celu miana patogenu w tkankach, takich jak mózg, które w inny sposób są niedostępne. Ten rodzaj protokołu jest obecnie kwestionowany przez konieczną poprawę dobrostanu zwierząt i zasady 3R (Reduce, Refine, Replace) ¹⁴. Stosowanie technologii obrazowania in vivo może pozwolić na drastyczne zmniejszenie liczby zwierząt, co jest niezbędne w doświadczeniach dotyczących zakażeń in vivo. W tym miejscu przedstawiamy i opisujemy analizę przebiegu czasowego rozprzestrzeniania się wirusa do mózgu po dootrzewnowym wstrzyknięciu MCMV-Luc mysim noworodkom. Korzystając z tych samych zwierząt, śledziliśmy i monitorowaliśmy in vivo miejsca intensywnej replikacji wirusa w okresie 2 tygodni.

Protokół

1. Przygotowanie zawiesiny wirusowej

1. Otrzymaj szczep Smitha lucyferazy eksprymującej MCMV (MCMV-Luc ¹⁵) z laboratorium Ulricha Koszninowskiego. W tym rekombinancie gen lucyferazy jest wstawiany do locus ie2 genomu MCMV.
2. Aby amplifikować MCMV-Luc, należy zainfekować mysią linię komórek zrębu szpiku kostnego (M2-10B4, ATCC #CRL-1972) MCMV przy różnej wielokrotności infekcji (MOI, 0,001 do 1) ¹⁶. W tym celu dodać wirusa do hodowanych komórek w pożywce wolnej od surowicy w temperaturze 37 °C. Po godzinie usuń supernatant i zastąp go DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą cielęcą (FCS). Pięć dni później zebrać pożywkę hodowlaną i przechowywać porcje w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
3. Miareczkowanie zawiesiny wirusa za pomocą testu płytki nazębnej.
   1. Podzielić komórki 3T3 (ATCC #CRL-1658) na 24-dołkowej płytce w 40 000 komórek/dołku w 1 ml DMEM uzupełnionym 10% FCS zawierającym penicylinę (200 IU / ml) i steptomycynę (200 mg / ml) i inkubować 24 godziny w temperaturze 37 °C.
   2. Przygotować seryjne rozcieńczenia (^10-1 do ^10-8) podwielokrotności zawiesiny MCMV w DMEM i zainfekować komórki docelowe (3T3) 200 μl rozcieńczenia po usunięciu pożywki do hodowli komórkowych. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Dodać 1 ml pożywki Top (DMEM 3% FCS, 2% (v/v) gentamycyny, 200 j.m./ml penicyliny, 200 mg/ml streptomycyny, 8 g/l karboksymetylocelulozy) i inkubować przez 5 dni w temperaturze 37 °C.
   3. Utrwal komórki, dodając 200 μl 10% formaldehydu (rozcieńczanie formaldehydu wodą powinno odbywać się w kapturze chemicznym, aby uniknąć toksycznych inhalacji) do każdej studzienki i inkubując 6 godzin w temperaturze pokojowej. Usunąć pożywkę hodowlaną + utrwalacz, pipetując i dodać 200 μl roztworu do barwienia komórek (1% fioletu krystalicznego (w/v) w 20% etanolu). Przed użyciem rozcieńczyć 1 część 9 częściami wody mili-Q. Inkubować 2 minuty w temperaturze pokojowej, umyć płytkę 3-4 razy mocząc ją w wodzie, pozostawić do wyschnięcia i policzyć liczbę blaszek lornetką.
4. Rozcieńczyć MCMV-Luc w DMEM, aby uzyskać 50 PFU w 50 μl i pozostawić na lodzie do dalszego użycia. Stosowanie wyższych inokulów wirusowych indukuje śmiertelność, zanim noworodki osiągną wiek 2-3 tygodni. Z naszego doświadczenia wynika, że 500 PFU wywołuje śmiertelność u każdego noworodka od 5 do 7 dni po wstrzyknięciu.

2. Wstrzykiwanie noworodków

1. Gdy noworodki (myszy w wieku od 4 do 20 godzin) są dostępne, manipuluj ściółką i kałem klatki w rękawiczkach przed ostrożnym obchodzeniem się ze szczeniętami, aby uniknąć zanieczyszczenia "obcymi" zapachami, które mogłyby stresować matkę i wywołać odrzucenie młodych.
2. Wykonać wstrzyknięcie dootrzewnowe za pomocą strzykawki insulinowej (29 G), jak pokazano na rysunku 1A. Przytrzymaj noworodka skórą grzbietową. Brzuszną stroną do góry wprowadź igłę pod przednią nogę i delikatnie wepchnij ją podskórnie, aby dotrzeć do jamy otrzewnej (nieco poniżej pępka). Obecnie wstrzykujemy 1% błękitu metylenowego rozcieńczonego w DPBS i monitorujemy przeżywalność, aby ćwiczyć technikę przed przeprowadzeniem infekcji wirusowych. Ponieważ błękit metylenowy jest wyraźnie widoczny podczas procesu wstrzykiwania, zalecamy wykonanie tego "treningowego" zastrzyku w pierwszej kolejności, aby zapewnić prawidłowe dostarczenie zawiesiny wirusa do jamy dootrzewnowej.
3. Wyeliminuj maleńkie krople krwi, które mogą się pojawić, i umieść noworodka z powrotem w klatce.

3. Obrazowanie in vivo

1. W dniu 7 należy obchodzić się z noworodkami z takimi samymi środkami ostrożności, jak wspomniano wcześniej. Wstrzyknąć dootrzewnowo mieszaninę środków znieczulających (4 mg/ml ketaminy, 0,8 mg/ml ksylazyny) i lucyferyny (0,15 mg/g masy ciała) w 50 μl u każdego zwierzęcia. Średnia masa ciała zwierząt wynosi 1-2 g, a dawka środków znieczulających na zwierzę wynosi: ketamina 40 μg, ksylazyna 8 μg Odczekaj 12-15 minut, aż lucyferyna osiągnie maksymalną emisję. Musi to być wcześniej ustalone i zależy od dostawcy lucyferyny i zastosowanego systemu obrazowania.
2. Podczas gdy młode są znieczulane, oznacz je w celu przyszłej identyfikacji i zbierz mały kawałek tkanki, który można następnie wykorzystać do przyszłego genotypowania, jeśli zostaną użyte zmutowane zwierzęta.
3. Umieść szczenięta w systemie obrazowania i dokonaj akwizycji światła emitowanego przez całe ciało. Siedem dni po zakażeniu wirus replikuje się w licznych kopiach w narządach docelowych, takich jak wątroba, nerki, płuca i gruczoły ślinowe; Dlatego czas ekspozycji powinien być krótki. W naszym przypadku akwizycja trwa od 10 do 20 sekund (rysunek 1B). Platforma w komorze akwizycyjnej urządzenia do obrazowania musi być podgrzewana, aby uniknąć nadmiernego chłodzenia temperatury ciała znieczulonych zwierząt. Ponadto pomocne jest uzyskanie obrazów o niskiej rozdzielczości kilku zwierząt w ciągu jednej rundy akwizycji, a następnie przesunięcie się w górę platformy bliżej obiektywu aparatu, aby skupić się na jednej części konkretnego zwierzęcia lub wyizolowanym narządzie po sekcji. Oprogramowanie musi umożliwiać szybkie zmiany parametrów (czas ekspozycji, odległość, próbka/soczewka, czułość), kwantyfikację zdefiniowanych obszarów zainteresowania i przyszły eksport obrazów migawkowych.
4. Aby uzyskać sygnał świetlny tylko z głowy, przykryj ciało noworodków leżących bocznie grubym, ciemnym papierem, który zamaskuje fotony emitowane na poziomie narządów, w których występuje wysoka replikacja wirusa (wątroba, płuca, gruczoły ślinowe) i wykonuj akwizycję przez 5 do 10 minut (ryc. 1C). Wykonaj przejęcie przeciwnej strony zwierzęcia w tych samych warunkach.
5. Ponownie wprowadź młode do klatki i umieść na niej lampę grzewczą, aby uniknąć nadmiernego wychłodzenia znieczulonych noworodków. Regularnie monitoruj rekonwalescencję po znieczuleniu. Przy wskazanej dawce znieczulenie trwa obecnie 30 minut.
6. Powtórz tę samą procedurę w dniach 9, 11 i 14. W dniach 11 i 14 należy zmienić dawkę środków znieczulających (6 mg/ml ketaminy, 1,2 mg/ml ksylazyny).

Wyniki

Reprezentatywny eksperyment przedstawiono na Rysunku 1. Po podaniu wewnątrzbrzusznym 50 PFU MCMV-Luc (Panel A pokazuje analogiczną iniekcję wykonaną z użyciem błękitu metylenowego w celu wizualizacji podskórnej drogi wprowadzenia igły), noworodki znieczulono i podano im jednocześnie 0,3 mg substratu lucyferazy (Luciferin, Caliper). Piętnaście minut później zwierzęta ułożono stroną brzuszną do góry w komorze akwizycyjnej urządzenia IVIS 50 (In Vivo Imaging System, Caliper), a światło emitowane przez cały ...

Dyskusja

Wykorzystując technologię obrazowania in vivo do monitorowania rozprzestrzeniania się MCMV-Luc u noworodków myszy, byliśmy w stanie zaobserwować rozprzestrzenianie się wirusa do mózgu zmutowanych zwierząt, w przeciwieństwie do typu dzikiego. Dalsza sekcja zwierzęcia i obrazowanie ex vivo mózgu potwierdziły obecność wirusa luminescencyjnego w ośrodkowym układzie nerwowym. Ponadto przeprowadziliśmy również immunohistochemię (nie pokazaną) na cienkich odcinkach mózgu z przeciwciałem specyficznym dla wczesn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik/Materiał
DMEM	Fisher Scientific	W3523A
Methylen blue	Sigma Aldrich	319112
Igły do insuliny	VWR	613-4897
Ketamine	CentraVet	Ket 201
Ksylazyna/Vetranal	Sigma Aldrich	46995
DPBS	DUTSCHER	P0436500
Lucyferin	Caliper	760504
gentamycyna	Sigma Aldrich	G1272
penicylina/streptomycyna	Gibco	15070
karboksymetyloceluloza	Sigma Aldrich	C4888
formaldehyd	Sigma Aldrich	F8775
krystaliczny fiolet	Sigma Aldrich	C3886
Equipment
IVIS 50	Caliper/Perkin Elmer