Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Genetyczna modyfikacja określonych regionów rozwijającego się mózgu ssaków jest bardzo potężnym eksperymentalnym podejściem. Jednak generowanie nowych mutantów myszy jest często frustrująco powolne. Wykazano, że możliwy jest dostęp do mózgu myszy rozwijającego się w macicy z rozsądnym przeżyciem pooperacyjnym. Mimo to wyniki tej procedury zostały przedstawione prawie wyłącznie dla najbardziej powierzchownej i łatwo dostępnej części rozwijającego się mózgu, tj. kory mózgowej. Wzgórze, węższy i bardziej przyśrodkowy obszar, okazał się trudniejszy do namierzenia. Transfekcja do głębszych jąder, zwłaszcza do podwzgórza, jest prawdopodobnie najtrudniejsza i dlatego opisano bardzo niewiele wyników. Tutaj demonstrujemy procedurę celowania w cały nabłonek neuronabłonka podwzgórza lub jego część (obszary podwzgórza) w celu transfekcji przez elektroporację. Kluczem do naszego podejścia są dłuższe czasy narkozy, wstrzyknięcie do trzeciej komory oraz odpowiedni rodzaj i ułożenie elektrod. Dodatkowo pokazujemy wyniki celowania, a następnie analizy histologicznej najbardziej zagłębionego jądra podwzgórza, czyli ciała sutkowego.
Wprowadzenie
Manipulacja genetyczna embrionalnego mózgu myszy jest preferowanym podejściem do nauki o regulacji rozwoju. Generowanie zmutowanych linii myszy jest jednak powolne i kosztowne. Jedną z potężnych metod wprowadzania określonych zmian genetycznych w rozwijających się neuronach mózgu ssaków jest elektroporacja in utero. Zasadniczo technika ta polega na transfekcji DNA do embrionalnego nabłonka mózgu za pomocą impulsów elektrycznych, a następnie umożliwieniu zarodkowi przetrwania przez określony czas, pobraniu mózgu i zbadaniu go pod kątem możliwych nowych, informacyjnych fenotypów. W ten sposób eksperymentator może testować hipotezy niemal natychmiast, bez długi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie mikropipet DNA i szklanych do iniekcji
- Dobrej jakości szklane mikropipety są niezbędne do zmniejszenia początkowego wysokiego wskaźnika poronień z powodu utraty płynu owodniowego. Procedura pobierania szklanych mikropipet została dobrze udokumentowana13,18,25. Stosować kapilary o średnicy 1,2 mm wciągnięte w konwencjonalne urządzenie Sutter P-97 o ustawieniach P=500; Ciepło=300; Ciągnięcie = 40; Prędkość=50; Czas=50. Zamontuj ściągacz z filamentami "rynnowymi" 3 mm (Sutter Instrument FT330B). Filamenty o rozmiarze 2 mm przyniosły nam mniej zadowalające efekty. Z drugiej strony, ukosowanie końcówek mikropipet nie wydaje się popra....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Większość neuronów podwzgórza powstaje między E11,5 a E15,2, zgodnie z analizą datowania narodzin u szczura26 przeliczoną na nieco krótszy okres rozwoju myszy27,28. Szczyt neurogenezy podwzgórza przypada na E12,529-31. W związku z tym, w wybranym dla niniejszego badania wieku transfekcji (E12,5), znaczną część neuronów podwzgórza można znakować na dowolnym poziomie w osi rostro-kaudalnej.
Analiza w dniu E18,5 na grubych przekrojach wykonanych za pomocą wibrato.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
O znieczuleniu: Ponieważ elektroporacja in utero do podwzgórza może być technicznie żmudna i wymagać dłuższego czasu narkozy, wolimy indukować i utrzymywać znieczulenie poprzez podawanie mieszaniny tlenu i izofluranu. Z naszego doświadczenia wynika, że zwierzęta mogą pozostać w tym miejscu w odpowiednim znieczuleniu przez okres co najmniej jednej godziny, powrót do zdrowia matki jest bardzo szybki, a przeżywalność zarodka poprawiona. Dostępne są również inne podejścia do znieczulenia. Najprostszy zabieg polega .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Niemiecką Fundację Badawczą (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODCZYNNIKI | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | znieczulenie | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | znieczulenie |
| Ketamin | Pharma GmbH | znieczulenie | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | niesteroidowy przeciwzapalny | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | powidonu i jodu |
| Sól fizjologiczna PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorfina) | Essex Pharma | opioidowy środek przeciwbólowy | |
| Maść do oczu | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Ksylazyna | Bayer | ||
| SPRZĘT | |||
| Anestezjologiczny Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Ściągacz kapilarny P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precyzyjny Instr. | VF-300 | Urządzenie wibratomowe |
| Mikroskop konfokalny | Zeiss | LSM700 | |
| Kriostat | Leica | CM3050S | |
| Elektroporator | Nepa Gene Co., Ltd. | CUY21EDIT | |
| Elektroda 1 | Nepa Gene Co., Ltd. | CUY550-10 | Elektroda igłowa ze stali nierdzewnej, końcówka 10 mm, średnica 0,5 mm |
| Elektroda 2 | Nepa Gene Co., Ltd. | CUY700P4L | Pokrywa Okrągła platynowa płyta o średnicy 4 mm |
| Światłowodowe źródło zimnego światła | Leica | KL2500 LCD | |
| Kapilary szklane | Aparat Harvard | GC120T-15 | 1. 2 mm średnica zewnętrzna x średnica wewnętrzna 94 mm |
| Sterylizator z kulkami szklanymi | Fine Science Tools | FST250 | |
| Poduszka grzewcza | Aparat Harvard | py872-5272 | |
| Urządzenie iniekcyjne | World Precision Instruments | Pneumatyczna pompa Pico PV820 | |
| Nici do szwów powlekane Vicryl | Ethicon | V4914 | Szew otrzewnowy |
| Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Szew do skóry |
Bibliografia
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
- Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
