Artykuł metodologiczny

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

DOI:

10.3791/50415

⸱

23 maja 2013

 ,  ,  , 
1DFG-Center for Regenerative Therapies Dresden, Cluster of Excellence (CRTD) and Biotechnology Center (BIOTEC) of the Technische Universität Dresden

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule demonstrujemy metodę manipulowania ekspresją genów w komórkach komorowych dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego za pomocą antysensownych oligonukleotydów morfolino. Przedstawiamy tę metodę jako skuteczny i szybki protokół, który można wykorzystać do badań funkcjonalnych w mózgu dorosłego kręgowca.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manipulacja ekspresją genów w tkankach jest wymagana do przeprowadzenia badań funkcjonalnych. W tym artykule demonstrujemy technikę mikroiniekcji komorowej mózgu (CVMI) jako sposób modulowania ekspresji genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego. Za pomocą CVMI substancje mogą być podawane do płynu komorowo-komorowego mózgu i dokładnie rozprowadzane wzdłuż osi ogonowej mózgu. Szczególnie skupiamy się na wykorzystaniu antysensownych oligonukleotydów morfolino, które są silnymi narzędziami do obniżania ekspresji genów in vivo. W naszej metodzie, po zastosowaniu, cząsteczki morfolino są wychwytywane przez komórki wyściełające powierzchnię komory. Komórki te obejmują promieniste komórki glejowe, które działają jako neurogenne komórki progenitorowe. W związku z tym obniżenie ekspresji genów w promieniowych komórkach glejowych ma ogromne znaczenie dla analizy powszechnej odpowiedzi neurogenezy u danio pręgowanego, a także dostarczyłoby informacji na temat tego, w jaki sposób kręgowce mogą utrzymać odpowiedź neurogenezy u dorosłych. Takie zrozumienie pomogłoby również w wysiłkach na rzecz zastosowań klinicznych w chorobach neurodegeneracyjnych u ludzi i regeneracji ośrodkowego układu nerwowego. W związku z tym przedstawiamy metodę mikroiniekcji komorowej mózgu jako szybki i skuteczny sposób na zmianę ekspresji genów i odpowiedzi neurogenezy w przodomózgowiu dorosłego danio pręgowanego. Udostępniamy również wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów i inne przydatne informacje na temat przeprowadzania procedury CVMI.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurogeneza u dorosłych jest cechą typową dla kręgowców, jednak jej stopień rozpowszechnienia i skuteczności różni się w zależności od filogenezy 1,2,3,4,5,6. Na przykład mózgi dorosłych ssaków zawierają obszary komórek macierzystych w dużej mierze ograniczone do przodomózgowia 7,8, podczas gdy danio pręgowany teleost zawiera szesnaście różnych domen komórek macierzystych i związanych z nimi stref neurogennych w całym mózgu 4,5,9,10. Ta różnica między ssakami a danio pręgowanymi może odzwierciedlać rozbieżność w mechanizmach utrzymania komórek macierzystych i zdolności neurogennych komórek progenitorowych. Trwająca całe życie zdolność danio pręgowanego do wytwarzania neuronów w mózgu może również mieć konsekwencje kliniczne, ponieważ mechanizmy molekularne wykorzystywane w mózgu danio pręgowanego mogą zostać wykorzystane do zastosowań terapeutycznych w walce z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi u ludzi.

Przeanalizowano kilka stref komórek macierzystych mózgu dorosłego danio pręgowanego i wykazano, że komórki wyściełające powierzchnię komór tych regionów służą jako komórki progenitorowe 9,11-20. Szczegółowe analizy w kresomózgowiu danio pręgowanego, na przykład, zidentyfikowały promieniste komórki glejowe, które wyznaczają powierzchnię komorową tego obszaru mózgu, jako neurogenne komórki progenitorowe 19, 20. Dotyczy to również innych regionów, takich jak móżdżek i tektum nerwu wzrokowego, gdzie komórki neuroepitelistyczne zlokalizowane w komorach dostarczają bodźca neurogennego 16,21. W tym celu zrozumienie mechanizmów molekularnych rządzących powszechną kompetencją neurogenną w mózgu dorosłego danio pręgowanego wymaga manipulacji ekspresją genów w komórkach progenitorowych.

Wcześniej opisano różne metody modulowania funkcji genów u danio pręgowanego. Obejmują one generowanie warunkowych linii transgenicznych wyrażających pożądane warianty pojedynczego białka, iniekcje ogniskowe oparte na plazmidzie sprzężone z elektroporacją lub zabiegami chemicznymi. Wcześniej opracowaliśmy metodę podawania różnych substancji, w tym oligonukleotydów morfolinooligonukleotydów lub białek, do mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji mózgowo-komorowej jako szybkiego i skutecznego sposobu modulowania funkcji genów w komórkach komorowych przodomózgowia dorosłego danio pręgowanego 22. W naszych badaniach morpholinos vivo zostały użyte ze względu na ich chemię obejmującą cząsteczkę morpholino kowalencyjnie połączoną z peptydami dostarczającymi bogatymi w argininę, które umożliwiają skuteczne dostarczanie do komórek będących przedmiotem zainteresowania bez konieczności dodatkowej przepuszczalności, takiej jak elektroporacja 23. Pozwoliłoby to na dokładne ukierunkowanie pożądanej tkanki po wstrzyknięciu, tak jak to zaobserwowaliśmy u dorosłego danio pręgowanego telencephalon 22. Stosowanie morfolinosów in vivo jest zatem lepsze od już istniejących metod celowania w tkanki, takich jak elektroporacja lub ogniskowa iniekcja cząsteczek DNA.

Tutaj pokazujemy wizualnie, jak wykonujemy tę operację i udostępniamy protokół krok po kroku. Zaczynamy od wyjaśnienia przygotowania mieszanki do wstrzykiwań i ryb, które mają być wstrzyknięte, a następnie przechodzimy do pokazania, jak ustawia się aparat do wstrzykiwań. Przedstawiamy opis metody iniekcji komorowej mózgu, która polega na wykonaniu nacięcia w czaszce i wstrzyknięciu morfolinosu za pomocą mikroiniekcji. Omawiamy również krytyczne punkty, na które należy uważać podczas całej procedury, podając je jako przewodniki optymalizacji lub rozwiązywania problemów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie mieszaniny iniekcyjnej

  1. Używaj morfolinosów vivo, ponieważ komórki internalizują je skuteczniej niż normalne cząsteczki morfolino. Szczegółowe informacje można znaleźć w informacjach producenta (Tabela 1: Odczynniki i materiały).
  2. Użyj fluorescencyjnego barwnika śledzącego (np. CellTracker Red CMTPX, Invitrogen), aby zobrazować dokładność wstrzyknięcia. Barwnik ten jest metabolizowany w komórce i staje się fluorescencyjny dopiero w komórce po wychwycie. Dlatego ten krok ma kluczowe znaczenie dla określenia komórek, które są skutecznie celem mikroiniekcji komory mózgowej.
  3. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH: 7.4) do rozcieńczenia roztworu morfoliny. Jeśli wymagane jest rozcieńczenie roztworu morfolino, należy zawsze użyć PBS.
  4. Przygotować 10 μl mieszanki do wstrzykiwań, dodając 9 μl roztworu morfoliny i 1 μl barwnika do śledzenia komórek (rozcieńczonego lub nierozcieńczonego. Stężenie podstawowe roztworu morfolino wynosi 500 μM. Nasze poprzednie wyniki 22 wskazują, że kilka różnych dawek morfolinu - od 50 μM do 500 μM - powoduje różne poziomy knockdownu od skutecznego knockdownu do hipomorficznych fenotypów). 1 μl roztworu wystarcza do wstrzyknięcia do jednego mózgu danio pręgowanego.
  5. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu wstrzyknięcia.

2. Przygotowanie aparatu do iniekcji

  1. Przygotować szklane kapilary iniekcyjne za pomocą ściągacza igłowego. Użyj następujących parametrów: wartość cyklu grzania: 463, wartość cyklu ciągnięcia: 230, prędkość: 1,5 s, czas: 75 ms.
  2. Włącz źródło ciśnienia i dostosuj ustawienia ciśnienia do 50 psi lub 3.5 bara.
  3. Dostosuj ustawienia mikrowtryskiwacza w następujący sposób: ciśnienie podtrzymania 20 psi, ciśnienie wyrzutu 10 psi, wartość okresu 2.5 i zakres bramkowania 100 ms.
  4. Włącz oświetlacz pierścieniowy i umieść pierścień nad stolikiem mikroskopu.
  5. Umieść uchwyt kapilarny w odpowiedniej pozycji obok mikroskopu.
  6. Włóż szklaną kapilarnę do uchwytu. Ustaw kąt wtrysku na 45 stopni.
  7. Oderwij końcówkę szklanej kapilary za pomocą kleszczyków z drobnym końcem i skalibruj ciśnienie wyjściowe z kryzy. Należy to sprawdzić, zanurzając końcówkę igły w wodzie dla ryb i podając ciągły impuls ciśnienia. Powstające pęcherzyki powietrza powinny znajdować się tylko w jednym rzędzie, co wskazuje na optymalne ciśnienie/rozmiar otworu. Zapoznaj się z filmem, aby zademonstrować tę kalibrację.
  8. Napełnić szklaną kapilarnę roztworem do wstrzykiwań, nie zatrzymując pęcherzyków powietrza.
  9. Zastosować ciśnienie, aby usunąć powietrze między końcówką szklanej kapilary a załadowanym roztworem iniekcyjnym.

3. Znieczulenie

  1. Przygotować roztwór podstawowy środków znieczulających (0,1% MESAB - metanosulfonian etylo-m-aminobenzoesanu).
  2. Usuń żądaną liczbę ryb z ich zbiorników do plastikowych klatek na myszy lub innego pojemnika transportowego z wystarczającą ilością wody.
  3. Przygotuj roztwór znieczulający w małym plastikowym pudełku, mieszając 200 ml wody rybnej z 5 ml roztworu podstawowego środka znieczulającego. Końcowe stężenie środków znieczulających: 0,0025% (v/v).
  4. Napełnij do połowy plastikową szalkę Petriego środkami znieczulającymi. Używaj tego naczynia do wstrzykiwań.
  5. Inkubuj rybę w środkach znieczulających, aż ryba się ujarzmi.

4. Nacięcie i mikroiniekcja komorowa mózgu

  1. Wyjmij rybę z pudełka za pomocą siatki na ryby i umieść ją na szalce Petriego.
  2. Delikatnie chwyć rybę kleszczami i ustaw głowę w taki sposób, aby lekko przechyliła się w dół. Ułatwi to nacięcie.
  3. Wygeneruj małą szczelinę na czaszce za pomocą igły z zadziorowym końcem o rozmiarze 30. Używaj tylko końcówki igły i nie wnikaj w głąb mózgu więcej niż wystarczająco, ponieważ spowoduje to uszkodzenie tkanki mózgowej i objawi się krwawieniem.
  4. Trzymaj rybę i włóż końcówkę szklanej kapilary przez miejsce nacięcia.
  5. Skieruj końcówkę szklanej kapilary w stronę kresomózgowia. Należy unikać dotykania tkanki mózgowej, ponieważ powoduje to uszkodzenie tkanki, a także zapobiega dyspersji wstrzykniętego roztworu.
  6. Wstrzyknąć roztwór. Ciecz rozprasza się natychmiast po wstrzyknięciu.

5. Odzyskiwanie i analiza dokładności wtrysku

  1. Wyjąć rybę z zestawu do wstrzykiwań i umieścić w plastikowym pudełku ze świeżą wodą dla ryb.
  2. Zezwalaj na odzyskiwanie.
  3. Ponownie znieczulić rybę 0,0025% MESAB na krótko i sprawdzić rybę pod mikroskopem fluorescencyjnym. Dokładna dyspersja czerwonej fluorescencji wskazuje na szerokie rozprowadzenie wstrzykiwanej cieczy.
  4. Włóż rybę z powrotem do plastikowego pudełka.
  5. Podłącz plastikowe pudełko do systemu cyrkulacji, aby natlenić ryby i utrzymać je przez dłuższy czas.
  6. Wykorzystać ryby do pożądanych celów, takich jak analizy behawioralne lub uśmiercać zwierzęta w pożądanych punktach czasowych po wstrzyknięciu, aby przygotować próbki tkanek do dalszych analiz (barwienia histologiczne, immunohistochemia itp.). Poniższe referencje podają przykłady analizowania mózgu dorosłego danio pręgowanego: 9,11,17-20,24-27. Najszybszy czas zaobserwowania skutecznego knockdownu (ponad 50% knockdown) wynosił 12 godzin w naszych badaniach 22.

6. Sugerowane kontrole naukowe

  1. Użyj cząsteczki morfoliny niedopasowanej, która nie powinna powodować żadnego fenotypu, jako kontroli negatywnej. Użyj standardowej cząsteczki morpholino lub specjalnie zaprojektuj kontrolę morpholino dla każdego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Dodatkowo należy użyć rozpuszczalnika (w tym przypadku PBS) jako dalszej kontroli ujemnej w celu oceny niespecyficznych skutków lub toksyczności wstrzyknięć morfolino w niedopasowaniu/kontroli.
  2. Stosować morfoliny PCNA opisane wcześniej 22 jako kontrole pozytywne. Morfolino ta powoduje skuteczne knockdown w mózgu dorosłego danio pręgowanego (75-95% skuteczności knockdown w ciągu 1 dnia od wstrzyknięcia) 22.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroiniekcja do komór mózgu prowadzi do rozległego rozprowadzenia wstrzykniętego roztworu

Korzystając z przepływu pracy i schematu technicznego mikroiniekcji do komór mózgu przedstawionego na Rysunku 1, wprowadziliśmy oligonukleotydy morpholino do mózgu dorosłego danio przebrzmiałego. Prawidłowy protokół iniekcji prowadzi do rozprzestrzenienia się wstrzykniętego płynu w całym mózgu i efektywnego skierowania preparatu do komórek znajdujących się blisko powierzchni komorowej (Rysunek 2A). W przypadku iniekcji, podczas których kapilara szklana przebija tkankę mózgową, w miejscu wstrzyknięcia pojawi się silny sygnał fluorescencyjny (Rysunek 2B). Jeśli wstrzyknięta ilość będzie niewystarczająca, zaobserwowany zostanie słaby sygnał fluorescencyjny (Rysunek 2C).

Mikrowstrzyknięcia do komór mózgu można wykorzystać do wyciszania ekspresji genów w obrębie obszaru komorowego mózgu dorosłego zebrafisha

Wykazaliśmy, że morfolino vivo mogą przenikać na głębokość kilku średnic komórek w obrębie powierzchni komórkowej i w związku z tym mogą efektywnie celować w komórki komórkowe (Rysunki 3A, 3B). Iniekcja morfolino może prowadzić do wyciszenia ekspresji genów, ograniczając produkcję odpowiedniego białka (przykładem jest PCNA, co przedstawiono na Rysunkach 3C, 3D). Wcześniej wykazaliśmy, że wyciszanie genów przy użyciu tej techniki prowadzi do skutków funkcjonalnych podczas neurogenezy u osobników dorosłych (Rysunki 3E, 3F) lub w odpowiedzi regeneracyjnej (Rysunki 3G, 3H). Wykazaliśmy, że efektywny zakres wyciszenia (wyciszenie powyżej 50%) jest osiągany około 12 hr po iniekcji morfolino 22. Zaobserwowaliśmy również, że okres efektywnego wyciszenia białka PCNA trwa do około 5 dni po iniekcji 22. Wyciszenie na poziomie powyżej 70% odnotowano do 3 dni po iniekcji 22. Krzywe wyciszenia zależą od poziomu ekspresji białek endogennych oraz wydajności cząsteczek morfolino; muszą one być określane przez eksperymentatora dla każdego genu. W naszych badaniach nie stwierdzono, aby procedura CVMI negatywnie wpływała na przeżywalność zwierząt, prawdopodobnie dlatego, że podawanie cząsteczek morfolino ma charakter lokalny i nie wywołuje toksyczności systemowej.

figure-results-1
Rysunek 1. Schematyczny przedstawienie techniki iniekcji do układu komorowego mózgu. (A) Iniekcję wykonuje się z grzbietowej strony dorosłego danio pręgowanego (1) na poziomie wzgórza optycznego (ot, 2). Za pomocą igły 30G (3) wykonuje się nacięcie nad kostną płytką wzgórza optycznego. Przy użyciu szklanych kapilar cząsteczki morfolino wstrzykuje się do płynu komorowego (4). Natychmiast uzyskuje się dokładną dyspersję (5). (B) Kaniula z widocznym ząbkowanym końcem w dużym powiększeniu. (C) Orientacja igły przed nacięciem. (D) Miejsce nacięcia zaznaczono okręgiem i liniami przerywanymi. (E) Kapilara do iniekcji jest umieszczona zgodnie z rysunkiem, a następnie wykonuje się wstrzykiwanie. Wszystkie panele zostały opracowano na podstawie ref. 22. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

figure-results-2
Rycina 2. Porównanie wydajności i dokładności iniekcji. (A) Prawidłowa iniekcja prowadzi do ukierunkowania komórek blisko powierzchni komorowej. (B) Jeśli kapilara szklana zostanie wprowadzona w głąb tkanki mózgowej, wygeneruje to sygnał fluorescencyjny zlokalizowany centralnie. (C) Jeśli ilość wstrzykniętego materiału jest niewielka, doprowadzi to do słabszego sygnału fluorescencyjnego.

figure-results-3
Rycina 3. Przenikanie morfolino, wydajność wyciszania genów i konsekwencje funkcjonalne. (A) Immunobarwienie GFP na przekrojach poprzecznych telencefalonu linii transgenicznej Tg(H2A:GFP) po wstrzyknięciu kontrolnego morfolino, wykazujące jądra GFP-dodatnie. (B) Immunobarwienie GFP na przekrojach poprzecznych telencefalonu linii transgenicznej Tg(H2A:GFP) po wstrzyknięciu antysensownego morfolino przeciwko gfp, wykazujące jądra GFP-dodatnie. Zwrócić uwagę na różnicę w sygnale GFP w obszarze komorowym. v: komora. (C) Immunobarwienie PCNA w mózgach po wstrzyknięciu kontrolnego morfolino, wykazujące szeroki rozkład komórek PCNA-dodatnich. (D) Immunobarwienie PCNA w mózgach po wstrzyknięciu antysensownego morfolino przeciwko pcna, wykazujące znaczną redukcję liczby komórek PCNA-dodatnich, co dowodzi, że CVMI może wyciszać geny endogenne. (E) Immunobarwienie BrdU i HuC/D w mózgach po wstrzyknięciu kontrolnego morfolino w celu oznaczenia nowo powstałych neuronów po eksperymencie pulse-chase z BrdU opisanym wcześniej 22. (F) Immunobarwienie BrdU i HuC/D w mózgach po wstrzyknięciu antysensownego morfolino przeciwko pcna w celu oznaczenia nowo powstałych neuronów po eksperymencie pulse-chase z BrdU opisanym wcześniej 22. (G) Wyciszenie PCNA prowadzi do znacznej redukcji generowania nowo powstałych neuronów, co wskazuje, że CVMI może być stosowane do wyciszania genów endogennych, co wywołuje konsekwencje funkcjonalne. Wszystkie panele zostały zaadaptowane z ref. 22 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycina.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda, którą tutaj opisujemy, pozwala na łatwe i szybkie podanie morfolinosów do mózgu dorosłego danio pręgowanego. Wykazaliśmy, że nasza metoda iniekcji skutecznie blokuje ekspresję genów w komórkach komór i powoduje funkcjonalne konsekwencje w odpowiedzi neurogenezy.

Istnieją ważne punkty, na które należy zachować ostrożność podczas wykonywania mikroiniekcji komorowej mózgu. Na przykład działanie cząsteczek morfolino zależy od zastosowanego stężenia. Stężenie to musi zostać określone przez użytkownika końcowego. Zalecamy rozpoczęcie od roztworu podstawowego (500 μM) i wykonywanie seryjnych rozcieńczeń, a najlepiej wstępne badanie przez wstrzyknięcie do zarodków przy użyciu standardowych protokołów wstrzyknięcia zarodków 28-30. Wcześniej uzyskaliśmy różne poziomy skuteczności wybijania przy stężeniach morfolinosów w zakresie od 50 μM do 500 μM 22. Po drugie, otwór szklanej kapilary nie powinien być duży, ponieważ doprowadzi to do rozległego napływu płynu do mózgu po wstrzyknięciu. Podobnie, otwór nie może być zbyt wąski, ponieważ uniemożliwi to odpowiednie wstrzyknięcie. Optymalna kombinacja kryzy i ciśnienia można określić, pompując powietrze do szalki Petriego z wodą. Powstające bąbelki powinny znajdować się w jednym rzędzie, ale nie w wielu rzędach. Pokazujemy to na filmie. Po trzecie, inkubacja ryb w środkach znieczulających ma kluczowe znaczenie. Ryba nie powinna być trzymana dłużej niż 2 minuty w środkach znieczulających. Utrudni to tempo rekonwalescencji po wstrzyknięciu. Po czwarte, lokalizacja nacięcia ma kluczowe znaczenie dla dokładnego rozproszenia wstrzykniętej cieczy. Obszar komorowy nad tektum nerwu wzrokowego jest większy powyżej linii środkowej i zwęża się bocznie. Dlatego eksperymentator powinien wygenerować szczelinę w czaszce w pobliżu linii środkowej i tylko doogonowo do płytki czaszki pokrywającej obszar kresomózgowia.

Jedną z zalet metody iniekcji komorowej mózgu (CVMI) jest jej szybkość. CVMI to szybka metoda oznaczania funkcji genów. Ta cecha jest ważna i przydatna w porównaniu z generowaniem linii transgenicznych do badań funkcjonalnych, które zwykle trwają kilka miesięcy. Dodatkowo, CVMI prowadzi do równomiernego rozprowadzenia wstrzykiwanej cieczy, a zatem zapewnia stosunkowo dokładną manipulację aktywnością genu w porównaniu z iniekcjami ogniskowymi lub elektroporacją. Dzięki CVMI wiele genów może być jednocześnie obalonych poprzez przygotowanie mieszanek iniekcyjnych zawierających wiele oligonukleotydów morfolinowych. CVMI może być używany do wstrzykiwania różnych stężeń danych oligonukleotydów morfolino, a zatem może być używany do analizy fenotypów hipomorficznych. Wreszcie, ten paradygmat wstrzykiwania nie powoduje toksyczności ani nie zagraża przetrwaniu zwierząt.

Technika CVMI może zostać rozszerzona na inne rodzaje badań, takie jak wstrzykiwanie peptydów modulujących, leków, plazmidowego DNA lub modulujących cząsteczek RNA lub innych substancji, które mogą wpływać na fizjologię komórek. Oznaczanie kombinacji cząsteczek i przeprowadzanie analiz dawka-odpowiedź jest możliwe przy użyciu naszej metody, co pozwala na badanie fenotypów hipomorficznych. Dzięki tym właściwościom CVMI okazuje się być szybkim i łatwym testem do badań ekspresji w mózgu dorosłego danio pręgowanego i otwiera szybkie badania przesiewowe i analizy funkcjonalne.

Mózg dorosłego danio pręgowanego może konstytutywnie wytwarzać nowe neurony wzdłuż całej osi ogonowej, a także może się regenerować po urazach. Jest to wyraźny kontrast z mózgami ssaków z ograniczoną neurogenezą i jeśli w ogóle, raczej słabą zdolnością regeneracyjną. Tak powszechna aktywność komórek macierzystych i zdolność do rekonwalescencji sprawiają, że danio pręgowany jest użytecznym organizmem modelowym do zrozumienia programów molekularnych wymaganych do regeneracji ośrodkowego układu nerwowego, które są obecnie w dużej mierze nieznane. Dlatego badanie molekularnych podstaw zdolności regeneracyjnych mózgu danio pręgowanego jest interesującą dziedziną badań, która może wyjaśnić fundamentalną różnicę, w jaki mózgi ryb i ssaków reagują po urazie, a także otworzyć drogę do regeneracyjnych terapii medycznych u ludzi. Aby zrozumieć molekularną infrastrukturę plastyczności i regeneracji mózgu kręgowców, komórki glejowe służą jako ważny obszar badawczy, ponieważ są neurogennymi prekursorami 3,8,20. Tak więc zastosowanie techniki CVMI do zmiany funkcji genów w promieniowych komórkach glejowych mózgu danio pręgowanego ma zasadnicze znaczenie dla wyjaśnienia, w jaki sposób mózg ryb może łączyć aktywność progenitorów z wydajną neurogenezą i reakcją regeneracyjną u dorosłych. Niedawno wykazaliśmy udział i zapotrzebowanie kilku czynników i szlaków sygnałowych w regeneracyjną odpowiedź neurogenezy mózgu dorosłego danio pręgowanego 24,26,27, a badania te były możliwe dzięki zastosowaniu metody CVMI. Ogólnie rzecz biorąc, wiedza, którą uzyskamy z mózgu danio pręgowanego, może zostać wykorzystana do narzucenia zdolności regeneracyjnych komórkom glejowym ssaków, które reagują na urazy, a tym samym pomoże w projektowaniu terapii klinicznych zaburzeń neurologicznych i ostrych urazów u ludzi.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Firma Gene Tools, LLC ufundowała dodatkowe opłaty za publikację tego artykułu w otwartym dostępie.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) i Unię Europejską (Zf-Health).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik/Materiał
CellTracker Red CMTPXLife Technologies, InvitrogenC34552Stosować w rozcieńczeniu 1:100 do pomiaru dokładności iniekcji
MESAB (methanosulphonate etylo-m-aminobenzoesanu)Sigma-AldrichA5040Do znieczulania ryb
Szalki PetriegoSarstedt821,472Do obróbki ryb podczas wstrzykiwania i obrazowania
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiLife Technologies, GIBCO10010-056Jako sterylne podłoże do rozcieńczania
Vivo morpholinosGene Tools Inc.DostosowaneWięcej informacji na temat morfolinosów vivo: www.gene-tools.com
Equipment
Igła z zadziorowym końcemBecton-Dickinson305178Aby wygenerować nacięcie w czaszce
Mikroskop preparacyjnyOlympus, Leica, ZeissRóżni się w zależności od producentaCzęść Cała konfiguracja wtrysku
Pęseta DumontWorld Precision Instruments501985Aby oderwać końcówkę szklanej kapilary
Aparat fluorescencyjnyZeiss, Nikon, LeicaRóżni się w zależności od producentaAby uwidocznić fluorescencję po wstrzyknięciu
Kleszcze preparacyjne GilliesWorld Precision Instruments501265Aby utrzymać rybę w pozycji
Wstrzykiwanie szkła kapilaryWorld Precision InstrumentsTWF10Do mikroiniekcji
Zestaw dysz PicoNozzle (uchwyt do mikrowtryskiwaczy)World Precision Instruments5430-12Do mikroiniekcji
Pneumatyczna pompa PicoPump (mikrowtryskiwacz)World Precision InstrumentsSYS-PV820Do mikroiniekcji
Iluminator pierścieniowy; Przewodnik po lampie pierścieniowejParkland ScientificILL-RLGDo oświetlania okazu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stocum, D. Regenerative Biology and Medicine. , Academic Press. London. (2006).
  2. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
  3. Doetsch, F., Scharff, C. Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals. Brain Behav. Evol. 58 (5), 306-322 (2001).
  4. Kaslin, J., et al. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
  5. Kizil, C., et al. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev. Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
  6. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev. Genes Evol. , In Press (2013).
  7. Kempermann, G. Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain. , 2nd Edition, Oxford University Press. Oxford. (2010).
  8. Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Cells in the astroglial lineage are neural stem cells. Cell Tissue Res. 331 (1), 179-191 (2008).
  9. Grandel, H., et al. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell. 295 (1), 263-277 (2006).
  10. Chapouton, P., et al. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
  11. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
  12. Byrd, C. A., Brunjes, P. C. Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish. Neuroscience. 105 (4), 793-801 (2001).
  13. Pellegrini, E., et al. Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish. J. Comp. Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).
  14. Lam, C. S., et al. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish. 238 (2), 475-486 (2009).
  15. Wang, X., et al. Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus. Zebrafish. 6 (1), 49-58 (2009).
  16. Kaslin, J., et al. Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche. J. Neurosci. 29 (19), 6142-6153 (2009).
  17. Ganz, J., et al. Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon. Glia. 58 (11), 1345-1363 (2010).
  18. März, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58 (7), 870-888 (2010).
  19. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
  20. Kroehne, V., et al. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  21. Ito, Y., et al. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Dev. Biol. 342 (1), 26-38 (2010).
  22. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395(2011).
  23. Morcos, P. A., et al. Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues. Biotechniques. 45 (6), 613-614 (2008).
  24. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27(2012).
  25. Chapouton, P., et al. her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain. Development. 133 (21), 4293-4303 (2006).
  26. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Developmental Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
  27. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  28. Rosen, J. N., et al. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).
  29. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).
  30. Rikin, A., et al. A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis. J. Vis. Exp. (42), e2020(2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wyciszanie ekspresji gen wkom rki glejowe promienistemikroskopia fluorescencyjnaodpowied neurogennacelowanie w powierzchni kom r splotowychantysensowne morfolinoneurogeneza u rybek zebrafish

Powiązane artykuły