Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Podsumowanie

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Streszczenie

Danio pręgowany to potężne narzędzie do badania biologii rozwojowej i patologii in vivo. Niewielki rozmiar i względna przezroczystość zarodków danio pręgowanego sprawiają, że są one szczególnie przydatne do wizualnego badania procesów, takich jak rozwój serca i naczyń krwionośnych. W kilku ostatnich badaniach transgeniczny danio pręgowany, który wykazuje ekspresję EGFP w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych, wykorzystano do obrazowania i analizy złożonych sieci naczyniowych w mózgu i siatkówce za pomocą mikroskopii konfokalnej. Opisy służą do przygotowania, leczenia i obrazowania zarodków danio pręgowanego, które wykazują ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP), a następnie wygenerowania kompleksowych renderingów 3D układu naczyniowo-mózgowego. Protokoły obejmują leczenie zarodków, obrazowanie konfokalne i protokoły fiksacji, które zachowują fluorescencję EGFP. Ponadto podano przydatne wskazówki dotyczące uzyskiwania wysokiej jakości obrazów struktur naczyniowo-mózgowych, takich jak usuwanie oka bez uszkadzania pobliskiej tkanki nerwowej. Omówiono potencjalne pułapki związane z obrazowaniem konfokalnym, a także kroki niezbędne do generowania rekonstrukcji 3D ze stosów obrazów konfokalnych przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania open source.

Wprowadzenie

Danio pręgowany dostarcza potężnego systemu do badania biologii rozwojowej, a względna przejrzystość ich zarodków jest podatna na badania oparte na obrazowaniu¹. Danio pręgowany jest obecnie od dziesięcioleci wykorzystywany jako model rozwoju kręgowców. Teleosty, w tym danio pręgowany, mają uproszczony układ naczyniowy kręgowców, który nie ma rozsądnego homologu u bezkręgowców. Krew jest pompowana z przedniej komory dwukomorowego serca przez skrzela, gdzie jest natleniona. Krew ze skrzeli zbiega się w aorcie grzbietowej i przechodzi przez tętnice, które rozgałęziają się na coraz mniejsze naczynia, docierając ostatecznie do naczyń włosowatych w tkankach narządów. W naczyniach włosowatych uwalniany jest tlen i pochłaniany jest dwutlenek węgla. Po żylnej stronie naczyń włosowatych krew przepływa do coraz większych żył i ostatecznie jest wciągana do tylnej komory serca, gdzie cykl się powtarza.

Dorosły danio pręgowany może złożyć 200 lub więcej jaj na raz, a po zapłodnieniu szybko się rozwijają². W ciągu jednego dnia oś ciała jest dobrze rozwinięta, w tym mięśnie, które kurczą się i poruszają zarodkiem wewnątrz błony kosmówkowej. Od 2 do 7 dni po zapłodnieniu (dpf) rozwija się większość układów organizmu, w tym oczy i ośrodkowy układ nerwowy, który może koordynować pływanie w kierunku pożywienia lub z dala od jasnego światła. Do 7 zarodków dpf jest wystarczająco małych, aby umożliwić wizualizację za pomocą mikroskopii. Linie transgeniczne, które wyrażają białka fluorescencyjne, można obrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej lub fluorescencyjnej. Obrazowanie konfokalne można połączyć z oprogramowaniem typu open source³ w celu tworzenia renderingów 3D kompletnych struktur naczyniowych w zarodkach danio pręgowanego, które zapewniają perspektywę biologii systemowej rozwoju naczyniowego. Badania dotyczące zmian w złożoności naczyń krwionośnych i naczyń mózgowych skorzystają z tego protokołu, ponieważ pozwala on na analizę sieci naczyniowych na poziomie systemowym^4,5. Przedstawiono kompilację metod i zasobów, aby umożliwić łatwe przyjęcie tych technik w badaniach, które wymagają obrazowania struktur naczyniowych u embrionalnego danio pręgowanego. Efektywność kosztowa danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego łączy się z nowymi technologiami obrazowania, aby zapewnić nowe platformy do oceny angiogennego wpływu szlaków molekularnych na rozwój kręgowców i homeostazę.

Protokół

1. Hodowla danio pręgowanego, tworzenie zarodków i leczenie

1. Przeprowadź następujące protokoły dotyczące danio pręgowanego pod kierunkiem instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania (IACUC) oraz w ramach wytycznych NIH lub innych organów regulacyjnych/wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami.
2. Szczepy danio pręgowanego, które eksprymują białka fluorescencyjne w określonych tkankach, komórkach lub narządach, są dostępne w Międzynarodowym Centrum Zasobów Danio Pręgowanego (ZIRC). Na przykład Tg (kdr:EGPF)s843 wyraża EGFP w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych⁶, które można wykorzystać do produkcji kompletnych struktur naczyniowych 3D, jak pokazano w tym protokole. Inne linie transgenicznych danio pręgowanego są dostępne w ZIRC.
3. Trzymanie dorosłych danio pręgowanego w odpowiednim systemie akwakultury, który monitoruje pH, zasolenie, temperaturę, rozpuszczony tlen, światło i inne czynniki środowiskowe⁷. Pokazany tutaj danio pręgowany był trzymany w systemie Aquaneering Inc. (San Diego, Kalifornia) w temperaturze 28,5 °C z 14-godzinnym cyklem świetlnym / 10-godzinnym ciemnym cyklem. Karm dorosłe danio pręgowane zbilansowaną dietą składającą się z krewetek solankowych i pokarmu dla ryb NRD 4/6 (Brine Shrimp Direct, Ogden, Utah).
4. Dorosłe samce i samice danio pręgowanego w wieku rozrodczym powinny być trzymane oddzielnie, aby zwiększyć udane krycie.
5. Stymuluj składanie jaj i zapłodnienie, umieszczając samice (2-4) i samce (4-6) razem w pojemniku godowym, który ma siatkowe dno z otworami wystarczająco dużymi, aby jaja mogły przez nie wpaść, ale zbyt małymi, aby dorosłe rybki danio pręgowany mogły przejść. Ustaw krycie poprzedniego wieczoru; jaja są składane o świcie, zwykle podczas gdy cykl światła w ciągu dnia powoli zwiększa swoją intensywność (świt). Co 15-30 minut sprawdzaj, czy na dnie pojemnika do krycia nie ma jaj.
6. Zebrać jaja za pomocą sitka siatkowego i oczyścić buforem E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM_MgSO4). Przenieść jaja na 100-milimetrowe płytki hodowlane wypełnione buforem E3 i przechowywać w inkubatorze o temperaturze 28 °C.
7. Aby zbadać substancje chemiczne, które zmieniają rozgałęzienia naczyń mózgowych, dodaj pożądane stężenia chemiczne. Na przykład rozgałęzienie neowaskularne można indukować za pomocą inhibitora γ-sekretazy (GSI IX/DAPT/N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-fenyloglicyno-estru butylowego) rozpuszczonego w DMSO⁴, rozpoczynającego się 24 godziny po zapłodnieniu (hpf). W tym momencie zarodki nadal znajdują się w kosmówce i wiele substancji chemicznych może przez nią^{przechodzić8}. Jeśli stan leczenia ma skutki neuronalne lub motoryczne, które mogą upośledzać zdolność zarodków do uwolnienia się od kosmówki, wówczas zarodki powinny zostać zdekorionowane między 24 a 48 hpf, co można zrobić za pomocą kleszczy pronazy². Zarodki pokazane na dostarczonych zdjęciach zostały poddane dechorionacji poprzez delikatne złapanie kosmówki dwoma zaostrzonymi kleszczami i rozerwanie jej.
8. W razie potrzeby/pożądania, tworzenie pigmentu można zahamować, dodając 0,003% N-fenylotiomocznika (PTU) do buforu E3 przy 24 hpf.

2. Konfokalne obrazowanie struktur naczyniowo-mózgowych w utrwalonych zarodkach danio pręgowanego

1. Zarodki należy umieścić w 250 mg/l metanosulfonianu trikainy, a następnie utrwalić je przez zanurzenie w 2 - 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C. Pojemniki z fluorescencyjnymi zarodkami należy zawinąć w folię. Po utrwaleniu zarodki należy przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C do czasu zobrazowania - intensywność fluorescencji EGFP staje się mniej rozdzielcza po około tygodniu, ale morfologia (widziana w jasnym polu) jest zachowana znacznie dłużej.
2. Przygotuj się do zamontowania zarodka, najpierw usuwając jedno oko za pomocą zaostrzonej igły wolframowej. Najpierw przetnij tkankę łączącą oko, następnie przetnij mięśnie, a na koniec przetnij nerw wzrokowy, aby przemieścić oko. (Uwaga: Jeśli pożądane jest obrazowanie po obu stronach, usuń oba oczy.)
3. Po usunięciu oka zamontuj zarodek na szkle nakrywkowym za pomocą kropli 3% metylocelulozy. Ustaw zarodek tak, aby strona z usuniętym okiem była skierowana w stronę szkła nakrywkowego i znajdowała się jak najbliżej szkła. Przykryj cały zarodek metylocelulozą, aby zapobiec wysuszeniu podczas obrazowania.
4. Natychmiast zobrazuj zamontowany zarodek za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w wysokiej jakości obiektyw Plan Apo 20x (apertura numeryczna = 0,75 lub lepsza). Ta konfiguracja jest lepsza niż mikroskop nieodwrócony, który wymagałby umieszczenia zarodka między dwiema szklanymi płaszczyznami i dociśnięcia zarodka do górnej szklanki.
5. Zbieraj warstwy optyczne w odstępach co 1 μm, używając średniego lub dużego ustawienia przysłony. Można również zastosować większe kroki 2,5 μm, ale określenie kolejności przestrzennej mniejszych obiektów może być trudniejsze. Małe otwory przysłony zapewniają ostrzejsze szczegóły, ale wymagane dłuższe skany mogą wybielić EGFP, a także ograniczyć głębokość obrazowania zarodka, którą można uzyskać. Mikroskop konfokalny pozwala na obrazowanie mniej więcej w połowie zarodka.
6. Jeśli pożądane jest obrazowanie całej ryby, należy na początku usunąć oboje oczu (patrz uwaga w kroku 3.2), obrócić zarodek po obrazowaniu z jednej strony i powtórzyć kroki 2.3 - 2.5 dla drugiej strony.

3. 3D Rekonstrukcja embrionalnej naczyniowości mózgowej danio pręgowanego

1. Skorzystaj z dystrybucji^{Fiji 3} oprogramowania ImageJ (http://fiji.sc o otwartym kodzie źródłowym, która jest zoptymalizowana pod kątem renderowania 3D, bezpłatna i kompatybilna z komputerami PC, Mac i Linux.
2. Zaimportuj stosy konfokalne na Fidżi, przechodząc do Plugins>LOCI>BioFormats Importer ⁹, a następnie wybierz plik konfokalny, np. name.ids dla stosów Nikon (Rysunek 2A). Wybierz Wyświetl stos za pomocą Hyperstack, Tryb koloru: skala szarości, sprawdź autoskalowanie, sprawdź podział kanałów.
3. Te wybory otworzą cztery oddzielne panele kanałów; dla EGFP potrzebny będzie tylko jeden, zwykle trzeci w dół. Zamknij pozostałe trzy panele (czerwony, niebieski i alfa), pozostawiając 16-bitowy obraz z długą nazwą, po której następuje C=1 (rysunek 2A).
4. Dostosuj próg, skanując obraz za pomocą zakładki przewijania u dołu, aby znaleźć wycinek z interesującym Cię regionem lub strukturą, a następnie przejdź do opcji Image>Adjust>Threshold (Obraz)AdjustThreshold (Rysunek 2C).
5. W panelu, który się pojawi, przesuń górny pasek (poziom) w lewo, tak aby struktura była dość dobrze widoczna przez tło, a dolny slajd (biały poziom) pozostaw tam, gdzie jest (Rysunek 2D). Wybierz opcję Czarno-białe, a następnie wybierz opcję Ciemne tło. Nie wybieraj opcji Oblicz próg dla każdego obrazu, chyba że wymagane są różne korekty dla każdego plasterka, wybierz opcję Czarne tło. Ten proces tworzy nowy 8-bitowy obraz.
6. OSTRZEŻENIE: Progu nie można cofnąć ani zapisać w ImageJ, więc stos konfokalny będzie musiał być ponownie ładowany za każdym razem, gdy potrzebna jest zmiana. Zapisz liczby i wypróbuj różne ustawienia, aż do osiągnięcia pożądanego rezultatu.
7. Przejdź do Plugins>3D Viewer>Threshold 0, Resampling factor 1 (najlepszy) lub 2 (dobry), odznacz pola koloru czerwonego i niebieskiego, aby utworzyć zielony wynik 3D - w przeciwnym razie spowoduje to renderowanie bieli - wybierz Zastosuj (nie automatycznie) (Rysunek 2E).
8. Obracaj, obracaj i powiększaj obraz 3D za pomocą elementów sterujących myszą i klawiaturą (Rysunek 2F).
9. Zdjęcia można zapisywać w dowolnym momencie, korzystając z opcji przechwytywania w menu. Rozmiar pola obrazu na ekranie dyktuje wymiary utworzonego obrazu w pikselach, więc jeśli pożądany jest obraz o wysokiej rozdzielczości, powiększ pole, przeciągając prawy dolny róg.
10. Utwórz obracający się film 3D, wybierając opcję Widok>Nagraj obrót o 360 stopni (Rysunek 2G). Obrót jest domyślnie ustawiony na 2 stopnie na krok, ale można go zmienić na przykład na 5 stopni, co spowoduje utworzenie znacznie mniejszych rozmiarów plików, ale może spowodować szarpnięcie animacji.
11. Zapisz plik w jednym z kilku dostępnych formatów do późniejszego wyświetlenia za pomocą odtwarzaczy multimedialnych, przesłania do Internetu lub użycia w prezentacjach PowerPoint. Odtwarzacz multimedialny o otwartym kodzie źródłowym, VLC (http://www.videolan.org/vlc/index.html), jest bezpłatny i bardzo dobrze radzi sobie z tymi filmami.

Wyniki

Rekonstrukcja 3D struktur naczyniowych zapewnia kompleksową i interesującą wizualnie perspektywę rozwoju danio prążkowanego. Ryciny 1 i 2 przedstawiają metody w sposób, w jaki są one zazwyczaj wykonywane. Rycina 3 pokazuje kilka kątów struktur naczyniowych w embrionie danio prążkowanego w 6 dpf, który wykazuje ekspresję EGFP w komórkach śródbłonka. Przy jednolitym zielonym lub białym kolorze trudniej jest ocenić intensywność sygnału; pseudokolorowanie przypisuje intensywność obrazu na podstawie tabeli przeglądowej i pozwala na lepsze postrzeganie głębi, gdy struktury na siebie nachodzą. Przykład pseudokolorowanego obrazu 3D naczyń w 6 dpf danio prążkowanego przedstawiono na Rycynie 4. Obrazowanie fluorescencyjne żywych embrionów może być wykorzystane do badania charakterystyk fizjologicznych, obejmujących ruch oka i ciała oraz aktywność serca. Ryciny 3 i 4 pokazują reprezentatywne wyniki uzyskane tymi metodami z użyciem opisanej transgenicznej linii danio prążkowanego. Rozdzielczość obrazowania zależy od charakterystyki mikroskopu, jednak jasność sygnału EGFP jest wystarczająca do uzyskania dobrej jakości obrazu w większości systemów komercyjnych. Rekonstrukcja i renderowanie reprezentacji 3D są powtarzalne, a opcje dostępne w tym oprogramowaniu open-source zapewniają konsekwentnie dobre wyniki.

Rysunek 1. Usunięcie oka. A) Utrwalony zarodek w 3 dpf z igłą wolframową umieszczoną obok oka. Z tej pozycji nacinana jest tkanka wokół oka. B) Oko wypada, a znajdujące się pod nim mięśnie gałkowe i nerw wzrokowy zostają przecięte. Pusty oczodół zaznaczono przerywanym okręgiem. C) Ten sam zarodek zostaje odwrócony i zamontowany w metylocelulozie, tak aby nienaruszone oko było skierowane do góry. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Krok po kroku rekonstrukcja 3D stosu obrazów konfokalnych. A) Otwarcie pliku (4104.1.ids) załadowanego w programie Fiji za pomocą Plugins>LOCI>Bioformat w celu wyboru. B) Po zlokalizowaniu przekroju z obszarem zainteresowania wybrano regulację progu, jak pokazano. C) Próg został ustawiony na 214 za pomocą górnego suwaka, a następnie wybrano opcję apply. D) Wywołano widok 3D, jak pokazano. E) Przedstawiono rekonstrukcję 3D danio przebrzuchłego z nienaruszonym okiem w celu orientacji. F) Obraz został powiększony i obrócony. G) Utworzono film z obrotem o 360 stopni, jak pokazano. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rycina 3. Perspektywy z rekonstrukcji 3D. A) Widok przyśrodkowy zarodka w 6 dpf obrazowany obiektywem 10x; otwór gębowy znajduje się po prawej stronie, wewnątrz nie widać skrzeli. B) Widok boczny tego samego zarodka, zwróć uwagę, że płetwa tworzy pętlę w środku. C) Ten sam zarodek obrazowany obiektywem 20x, widok przyśrodkowy, zwróć uwagę na rozdzielczość skrzeli. D) Widok boczny obrazowania obiektywem 20x. Płetwa znajduje się na prawej krawędzi panelu. E) Widok przednio-przyśrodkowy obrazowania obiektywem 20x, zwróć uwagę na skrzela wewnątrz otworu gębowego. F) Brzuch tego samego zarodka obrazowany obiektywem 20x, głowa skierowana w prawo. Zwróć uwagę na układ naczyniowy na worku żółtkowym w dolnym prawym rogu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4. Różnice w intensywności w embrionie w 6 dpf. Obraz rekonstrukcji w 6 dpf z wykorzystaniem pseudokolorowej tabeli wyszukiwania (LUT) dla intensywności sygnału. W celu orientacji zaznaczono jamę ustną, mózg, skrzela i worek żółtkowy. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Rysunek 5. Film zrekonstruowanego układu naczyniowego u 4 dpf zebrafish. Ryba została zobrazowana w rozdzielczości 2.5 μm. Obrazy przedstawiają jedną połowę zarodka. Porównaj struktury naczyniowe ze strukturami u zebrafish poddanego działaniu GSI, przedstawionymi na Rysunku 6. Zwróć uwagę na niższą gęstość naczyń krwionośnych w głowie oraz większe skrzela. (Patrz plik uzupełniający „Zfish_spin.avi” w sekcji Pobieranie)

Rysunek 6. Film 3D układu naczyniowego w embrionie traktowanym GSI w 4. dniu po zapłodnieniu (dpf). Obrazowanie ryby wykonano w odstępach 2,5 μm od strony bocznej do linii środkowej. Porównaj struktury naczyniowe z rybą kontrolną w 4. dniu po zapłodnieniu przedstawioną na Rysunku 5. Wygięty grzbiet i mniejszy rozmiar są typowe dla embrionów traktowanych tym związkiem chemicznym. (Patrz plik uzupełniający „GSI-treated_4dpf_fish.avi” w sekcji Downloads)

Dyskusja

Opisane tutaj metody stanowią podstawę do wizualnych badań układu naczyniowego w rozwoju danio pręgowanego. Żywe próbki można wykorzystać do oceny parametrów fizjologicznych, takich jak tętno i objętość udaru serca, podczas gdy próbki utrwalone można wykorzystać do obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości. Drosophila i C. elegans pozwalają na obrazowanie całego ciała, ale danio pręgowany są kręgowcami i stanowią użyteczny model dla tkanek kręgowców, w tym układu naczyniowego wyściełanego komórkami śródbłonka. Badania te mogą obejmować znaczące linie transgeniczne i zasoby genomiczne pochodzące ze społeczności badawczej danio pręgowanego. Rekonstrukcja 3D i renderowanie obrazów konfokalnych z embrionalnego danio pręgowanego, jak opisano tutaj, pozwala na podejście biologii systemowej do rozgałęzień naczyń krwionośnych i gęstości naczyń krwionośnych, co nie jest możliwe w przypadku większych modeli zwierzęcych, takich jak szczury i myszy. Ponadto, jako owodniowce, danio pręgowany rozwija się w modyfikowalnym środowisku (bufor E3), w którym można łatwo dodać substancje chemiczne, które hamują określone enzymy lub inne procesy wpływające na rozwój naczyń krwionośnych. Stężenie i czas dostarczania substancji chemicznej mogą być zmieniane, co umożliwia badaczowi precyzyjne dostrojenie warunków leczenia.

1. Modyfikacje i rozwiązywanie problemów

Modyfikacje tego systemu mogą obejmować transgeniczne linie danio pręgowanego, które wyrażają EGFP lub inne białka fluorescencyjne w różnych wzorcach specyficznych dla tkanek, narządów lub regionów¹⁰. Ponadto niedawno opublikowano analizę zmian neowaskularnych w siatkówce danio pręgowanego⁵. Problemy z pigmentacją u starszych zarodków i dorosłych danio pręgowanego można skompensować poprzez krzyżowanie z liniami transgenicznymi, które nie wytwarzają pigmentów łuskowatych ani pigmentu siatkówki. Problemy ze zmniejszoną fluorescencją zwykle wynikają z niewłaściwych warunków utrwalania. Optymalna jest paraformaldehyd (4%) przez 1 dzień, ale silniejsze utrwalacze, takie jak aldehyd glutarowy, tetratlenek osmu lub alkohol, mogą niszczyć fluorescencję EGFP. Po utrwaleniu zarodki powinny być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C i zawsze chronione przed bezpośrednim działaniem promieni słonecznych.

2. Ograniczenia tej techniki

Jakość i rozdzielczość renderingów 3D wykonanych za pomocą tego protokołu zależy od jakości generowanych obrazów. Przenikanie światła przez te zarodki jest ograniczone do płaszczyzny środkowej strzałkowej przy użyciu standardowego mikroskopu konfokalnego. Ten aspekt obrazowania ogranicza głębokość obrazowania u starszych zarodków i dorosłych, ale bardziej zaawansowane systemy mikroskopii wielofotonowej pozwalają na obrazowanie na większych głębokościach.

3. Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod

Protokół ten zapewnia podejście do analizy sieci naczyń krwionośnych na poziomie systemów, które mogą obejmować całe zwierzę. Wcześniejsze reprezentacje takich danych często opierały się na seriach obrazów ułożonych razem, ale renderowanie 3D zapewnia lepszą rozdzielczość zaangażowanych relacji przestrzennych.

4. Przyszłe zastosowania

Nowe osiągnięcia w obrazowaniu i przetwarzaniu tkanek zapewnią wiele nowych zastosowań dla tych metod, które mogą obejmować uczynienie starszych zarodków lub dorosłych przezroczystymi^11-14. Zwiększona przezroczystość znacznie zwiększy penetrację tkanek przez lasery konfokalne i wielofotonowe. Co więcej, wraz ze wzrostem prędkości kamer i fotopowielaczy, wkrótce może być możliwe tworzenie renderingów 3D ryb w czasie rzeczywistym, zapewniając^4-ty wymiar analizy.

5. Kroki krytyczne

Krytycznym krokiem w tym protokole jest przygotowanie do obrazowania, które obejmuje prawidłowe utrwalenie. Obrazowanie powinno być wykonane tak szybko, jak to możliwe po utrwaleniu, za pomocą wysokiej jakości obiektywów, które mają najlepsze dostępne otwory numeryczne. Rozdzielczość zależy od zastosowanego systemu obrazowania, więc systemy wysokiej jakości są na ogół lepsze. Generowanie renderingów 3D wymaga dużej ilości pamięci w przypadku nowszych, wysokiej klasy komputerów z dużą ilością pamięci i dobrymi procesorami graficznymi.

Opisany tutaj system biologii wizualnej został zoptymalizowany dla transgenicznych danio pręgowanego, które wyrażają EGFP w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych, chociaż metody te można dostosować do transgenicznych zarodków, które wyrażają GFP lub inne białka fluorescencyjne w populacjach neuronów, mięśni, gruczołów lub dowolnej liczby innych komórek. Główną zaletą pracy z tym systemem jest możliwość badania, co dzieje się w całym zarodku w dowolnym momencie tego okresu rozwojowego, u zwierząt stałych i/lub żywych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
N – Fenylotiomocznik	Alfa Aesar, katalog #41972		0.2 M w buforze E3, przechowywany na 4 ° Bufor C
E3	Sigma		5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4
Mikroskop konfokalny	Nikon		D-EclipseC1 na Nikon TE-2000U
Naczynia ze szklanym dnem	Mat-Tek
GSI IX/DAPT			N-[N-(3,5-Difluorofenacetyl-L-alanyl)]-S-fenyloglicyno-butylowy ester EMD Biosciences
24-dołkowe	Becton-Dickinson, kat# 351147		Pipety transferowe BD Falcon
	VWR, kat. #414004-001		Jednorazowe pipety transferowe VWR
Metyloceluloza	Alfa Aesar, kat#43146		3% w buforze E3
NRD 4/6 Pokarm dla ryb	Krewetki solankowe Krewetki solankowe suszone
	Krewetki solankowe Bezpośrednie		żywe
druty wolframowe	Małe części # TW-016-60		0,016" OD
Tricaine	VWR # 101107-950		Metanosulfonian trikainy 250 mg/L w buforze E3