Artykuł metodologiczny

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

19.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50436

⸱

13 lipca 2013

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano procedury całkowitego odtworzenia prototypu kanału potasowego bramkowanego napięciem do błon lipidowych. Odtworzone kanały nadają się do testów biochemicznych, zapisów elektrycznych, badań przesiewowych ligandów i badań krystalograficznych elektronów. Metody te mogą mieć ogólne zastosowanie w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych innych białek błonowych.

Streszczenie

Aby zbadać interakcję lipid-białko w sposób redukcjonistyczny, konieczne jest włączenie białek błonowych do błon o dobrze zdefiniowanym składzie lipidowym. Badamy zależne od lipidów efekty bramkowania w prototypowym kanale potasowym bramkowanym napięciem (Kv) i opracowaliśmy szczegółowe procedury odtwarzania kanałów w różnych systemach błonowych. Nasze procedury rekonstytucji uwzględniają zarówno indukowaną detergentem fuzję pęcherzyków, jak i fuzję miceli białkowo-detergentowych z micelami mieszanymi lipidami/detergentami, a także znaczenie osiągnięcia równowagi rozkładu lipidów między micelami białkowymi/detergentowo-lipidowymi i mieszanymi detergentami/lipidami. Nasze dane sugerowały, że wprowadzenie kanałów w pęcherzykach lipidowych jest stosunkowo losowe w orientacjach, a skuteczność rekonstytucji jest tak wysoka, że w eksperymentach frakcjonowania nie zaobserwowano wykrywalnych agregatów białkowych. Wykorzystaliśmy zrekonstytuowane kanały do określenia stanów konformacyjnych kanałów w różnych lipidach, zarejestrowania aktywności elektrycznej niewielkiej liczby kanałów włączonych w płaskie dwuwarstwy lipidowe, badania przesiewowego pod kątem ligandów specyficznych dla konformacji z biblioteki peptydów wyświetlanych przez fagi i wspierania wzrostu kryształów 2D kanałów w błonach. Opisane tutaj procedury rekonstytucji mogą być dostosowane do badania innych białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych, zwłaszcza do badania wpływu lipidów na eukariotyczne kanały jonowe bramkowane napięciem.

Wprowadzenie

Komórki wymieniają materiały i informacje ze swoim otoczeniem poprzez funkcje określonych białek błonowych 1. Białka błonowe w błonach komórkowych działają jako pompy, kanały, receptory, enzymy wewnątrzbłonowe, łączniki i wsporniki strukturalne w błonach. Mutacje, które wpływają na białka błonowe, są związane z wieloma chorobami człowieka. W rzeczywistości wiele białek błonowych jest głównymi celami leków, ponieważ są one ważne i łatwo dostępne w błonach komórkowych. Dlatego bardzo ważne jest zrozumienie struktury i funkcji różnych białek błonowych w błonach i umożliwienie opracowania nowych metod łagodzenia szkodliwych skutków zmutowanych białek w chorobach człowieka.

Lipidy otaczają wszystkie białka błonowe zintegrowane w dwuwarstwach 2, 3. W błonach eukariotycznych wiadomo, że różne typy lipidów są zorganizowane w mikrodomeny 4, 5. Wykazano, że wiele białek błonowych jest rozmieszczonych w tych mikrodomenach, a także w masywnej fazie płynnej błon 3, 6. Mechanizm leżący u podstaw organizacji mikrodomen i dostarczania do nich białek błonowych oraz fizjologiczne znaczenie takich dystrybucji są oczywiście ważne, ale pozostają słabo poznane. Jedną z głównych trudności technicznych w badaniu wpływu lipidów na białka błonowe jest niezawodna rekonstytucja biochemicznie oczyszczonych białek błonowych w błonach o dobrze kontrolowanym składzie lipidowym, tak aby prawie wszystkie odtworzone białka były funkcjonalne 7. W ciągu ostatnich kilku lat opracowaliśmy metody rekonstytucji prototypowego kanału potasowego bramkowanego napięciem z A. pernix (KvAP) do różnych systemów membranowych do badań strukturalnych i funkcjonalnych 8-10. Dane od innych i od nas razem wykazały, że lipidy są prawdopodobnie wyznacznikiem zmian konformacyjnych domen wyczuwających napięcie kanału jonowego bramkowanego napięciem i mogą kształtować struktury niektórych z tych kanałów 11. W następnym przedstawimy szczegółowy opis naszych metod i zaoferujemy kluczowe wskazówki techniczne, które prawdopodobnie zapewnią pomyślne odtworzenie naszych wyników, a także rozszerzenie naszych metod na badania innych białek błonowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ekspresja i oczyszczanie kanału KvAP (Rysunek 1)

  1. Prace przygotowawcze - Dzień 0
    1. Przepłukać szklane kolby do hodowli bakterii wodą dejonizowaną (diH2O) i MilliQ H2O (MQH2O) w celu usunięcia śladów detergentu z ogólnego zmywania naczyń.
    2. Autoklaw 1 000 ml pożywki LB w kolbach Erlenmeyera o pojemności 2,8 l (na przykład całkowita kultura o pojemności dwóch litrów). Stwierdzono, że niska twardość wody jest ważna dla udanej hodowli przekształconych bakterii.
    3. Autoklaw 100 ml LB w kolbach 500 ml
    4. Przekształć 60 μl kompetentnych komórek XL1-Blue z 200 ng plazmidu pQE60 zawierającego gen KvAP z miejscem cięcia trombiny i znacznikiem His6 na jego C-końcu, poszczepić bakterie na dwóch płytkach LB-agar zawierających 100 μg/ml ampicyliny i inkubować je przez 14-16 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  2. Ekspresja KvAP - Dzień 1
    1. Sprawdź wygląd kolonii bakteryjnych na płytkach po całonocnej inkubacji. Kolonie miały zwykle tylko około 0,2-0,5 mm średnicy, a było ich bardzo dużo. Nie chcemy, aby płyty, na których znajdują się duże kolonie, były otoczone wieloma koloniami satelitarnymi.
    2. Dodać 5,0 ml pożywki LB do każdej płytki LB-agar inkubowanej przez noc i zeskrobać kolonie. Przenieść zawiesinę bakterii do 100 ml pożywki LB autoklawizowanej w kolbie o pojemności 500 ml. Dodać ampicylinę do końcowego stężenia 100 μg/ml, inkubować małą kulturę przez ~1 godzinę w temperaturze 37 °C lub do momentu, gdy OD600 osiągnie 0,60.
    3. W międzyczasie umieścić dwie kolby z 1,0 l pożywki w inkubatorze wytrząsającym o temperaturze 37 °C w celu ogrzania pożywki i przygotować 20 ml BaCl2 (1,0 M; 10 mM stężenie końcowe w każdej 1,0 l kultury), 2,0 ml 0,4 M IPTG (izopropylo-tio-β-galaktozyd) i 2,0 ml 100 mg/ml ampicyliny w wodzie.
    4. Gdy mała kultura jest gotowa, dodać 10 ml BaCl2, 1,0 ml bulionu ampicyliny i 50 ml małej kultury z etapu 1.2.2 do wstępnie podgrzanej pożywki LB. OD600 powinien wynosić około 0,05. Uważaj na możliwe opady spowodowane wysoką twardością wody i przeciwjonami w mediach LB. Wiadomo, że Ba2+ wiąże się z domeną porów kanału potasowego i blokuje prąd jonowy, a tym samym zmniejsza toksyczność wysokiego poziomu ekspresji kanałów dla bakterii.
    5. Przyjmuj OD600 co godzinę, aż osiągnie 0,70 i co piętnaście minut, aż osiągnie 0,8 do 0,9. W naszej konfiguracji osiągnięcie 0,8 zajmuje zwykle ~5 godzin.
    6. Dodać 0,40 mM IPTG, aby rozpocząć indukowaną ekspresję białka kanałowego i inkubować kulturę przez kolejne 4,0 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 225 obr./min.
    7. Zbierz bakterie w 1,0-litrowych butelkach wirówkowych, wirując w temperaturze 4 000 x g, 4,0 °C przez 15 minut. Zdekantuj supernatant tak bardzo, jak to możliwe, do zlewki na odpady, dodaj 10 ml 1,0 M buforu fosforanu Na, aby wytrącić wszystkie Ba2+, a następnie dodaj niewielką objętość wybielacza, aby zabić bakterie. Zebrane bakterie należy przechowywać przez noc w butelkach wirówkowych zakopanych w lodzie w chłodni o temperaturze 4,0 °C.
  3. Oczyszczanie białka KvAP (dzień 2 i 3; Rysunek 1B)
    1. Zawiesić osad bakteryjny w 15 ml buforu do lizy IMAC na 1,0 l kultury. Dodaj ~1,0 U DNazę I i trzy inhibitory proteazy leupeptyny, aprotyniny i pepstatyny A w stężeniu 1,0 μg/ml. Całkowita objętość na dwulitrową hodowlę wynosiła ~35 ml.
    2. Sonizuj zawieszone bakterie w metalowej zlewce zakopanej w lodzie na łączny czas ON-time przez 10 minut. Sonikator mikrosondy został ustawiony w cyklu 5 sekund ON / 10 s OFF z 40% mocą wyjściową w chłodni 4,0 °C. Ustawienie mocy wyjściowej zostało empirycznie określone tak, że większość bakterii została poddana lizie bez większego ogrzewania w roztworze.
    3. Dodać 0,50 g n-decylo-β-D-maltozydu (DM; Sol-Grade firmy Anatrace) w suchym proszku do sonikowanego lizatu komórkowego i inkubować mieszaninę przez 3,5 godziny w temperaturze pokojowej (RT) ze stałym wytrząsaniem poziomym (~100 obr./min) w celu ekstrakcji jak największej ilości białek kanałowych. Ważne jest, aby upewnić się, że proszek do prania jest całkowicie rozpuszczony w ciągu 30-50 minut.
    4. Po ekstrakcji detergentem usunąć resztki komórek z lizatu przez odwirowanie przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Czekając na zakończenie wirowania, należy przygotować kolumnę LC (niskociśnieniowa chromatografia cieczowa) na bazie His-tag, jak opisano w ramce 1.
    5. Załadować supernatant z kroku 1.3.4 do wstępnie zapakowanej kolumny IMAC (immobilized metal ion affinity chromatography) z natężeniem przepływu 1-2 ml/min, które jest napędzane przez pompę perystaltyczną. Alternatywnie, wyekstrahowane białko znakowane Hisem można inkubować z żywicą IMAC w celu wiązania partiami.
    6. Przemyj żywicę IMAC, uruchamiając 5 objętości złoża buforu do płukania IMAC i 10 objętości złoża buforu płuczącego IMAC plus 20 mM imidazolu. Wbudowany monitor UV służy do upewnienia się, że pranie jest czyste.
    7. Eluować białko KvAP przez zastosowanie buforu elucyjnego IMAC zawierającego 300 mM imidazolu. Większość związanego KvAP jest eluowana w ciągu 6 ml buforu elucyjnego przez kolumnę. Dodaj trombinę (1,0 U na 2-3 mg białka) do połączonych frakcji elucyjnych i inkubuj białko przez noc na ławce, aby rozszczepić znacznik His6.
    8. Następnego dnia stężyć roztwór białka trawiony trombiną w Centricon (MWCO = 30K) do 600 μl w celu wykluczenia wielkości FPLC (szybka chromatografia cieczowa białek). Podczas wirowania należy mieszać próbkę co pięć minut, aby zminimalizować agregację białek. W miarę zagęszczenia białka lokalne stężenie na filtrze membranowym staje się wyższe, a czasami pojawiają się przezroczyste białe osady, które w przeciwnym razie mogłyby zatkać membranę filtra. Również wysokie stężenie białek (~5-10 mg/ml) na dnie koncentratora prowadzi do brązowawego koloru, a mieszanie naprawdę pomaga zminimalizować utratę próbki.
    9. Przepuść skoncentrowany KvAP przez kolumnę Superdex 200, która jest wstępnie zrównoważona z buforem równoważącym FPLC. Zazwyczaj pik tetramerycznego kanału KvAP w DM eluuje się z objętością retencyjną 12,3 ml. Na wysokości około 13,6 ml znajduje się mały ogon wleczony, który zawiera niewielką ilość monomerycznego KvAP. Pustka w kolumnie, której użyliśmy, wynosi 7,0 ml i zwykle próbka powoduje powstanie małego piku w pustce, który zawiera bardzo mało białka KvAP. Imidazol pojawia się pod koniec elucji (~24 ml). Zebrać frakcje zawierające tetramery KvAP i zagęścić roztwór białkowy do 0,5 ml. Oznaczyć stężenie próbki za pomocą szacowanego współczynnika ekstynkcji (~1,2E-5,0 M-1 cm-1, który obliczono na podstawie liczby pozostałości aromatycznych) KvAP przy 280 nm (odnośnik 12; URL: http://web.expasy.org/protparam/).
      W temperaturze pokojowej oczyszczony KvAP w DM jest stabilny przez co najmniej tydzień bez znacznej utraty białka. W temperaturze 4 °C może trwać jeszcze dłużej. Nigdy nie zamrażaj białka w detergentach. Zaleca się przechowywanie białka w suchej masie w temperaturze 4 °C, a białka w β-OG w temperaturze pokojowej. Ale zwykle nie czekamy i przechodzimy do etapu rekonstytucji natychmiast po tym, jak białka są gotowe.
    10. Oznaczenie próbek w żelu SDS-PAGE redukującym 12%.
      Próbki z każdego etapu opisanego powyżej przygotowano przez zmieszanie 20 mikrolitrów próbek z 5-krotnym buforem próbki SDS (tabela 3 dla) uzupełnionym 1,0% β-ME. Próbki nie były gotowane. Po przygotowaniu żeli próbki zwykle znajdowały się w buforze SDS przez ponad 10 minut w temperaturze pokojowej. Po uruchomieniu żelu i zabarwieniu go błękitem Coomassie, KvAP typu dzikiego pojawił się jako pojedyncze pasmo o sile około 26 kDa (ryc. 1B). Oczyszczona próbka była biochemicznie jednorodna i miała czystość co najmniej 95%.

2. Rekonstrukcja kanału jonowego

2.1. Przygotowanie liposomów i fuzja pęcherzyków wywołana detergentem

Przed przygotowaniem lipidów umyj 14 ml jednorazową szklaną probówkę, szklaną probówkę z zakręcaną nakrętką oraz szklaną strzykawkę o pojemności 250 μl chloroformem. Wlej ~10 ml chloroformu do probówki.

  1. Otrzymywanie liposomów palmitoilo-oleoilo-fosfatydyloetanoloaminy (POPE) i palmitoilo-oleoilo-fosfatydyloglicerolu (POPG).
    1. Przenieść 3,75 mg POPE i 1,25 mg POPG (POPE: POPG=3:1 stosunek wagowy) w chloroformie do wstępnie oczyszczonej szklanej rurki z nakrętką i wysuszyć lipidy pod ciągłym strumieniem gazowego argonu. Gdy nie ma widocznego chloroformu, wysuszyć lipid dalej pod próżnią pokojową przez jedną godzinę.
    2. Dodać 440 μl buforu o niskiej zawartości soli (10 mM HEPES, pH 7,4) lub wody do wysuszonego lipidu i przemieszać probówkę, aby uwodnić lipidy. Zawiesina lipidowa jest biaława i mętna.
    3. Sonikować zawiesinę lipidową w lodowatej kąpieli sonikatora, aż roztwór pęcherzyków stanie się przezroczysty (OD410 < 0,2).
      Zazwyczaj dla roztworu 10 mg/ml POPE/POPG w wodzie lub buforze o niskiej zawartości soli, używamy sonikatora z 30 sekundami włączenia i 30 sekund wyłączenia (na lodzie) przez łącznie 15-20 minut. Ze względu na ciepło wytwarzane podczas sonikacji, zaleca się dodanie 1,0 mM DTT do roztworu lipidowego w celu zminimalizowania utleniania lipidów i schłodzenia łaźni wodnej sonikatora do temperatury 10 °C lub niższej. Końcowy OD410 jest zależny od lipidów. W przypadku niektórych lipidów osiągnięcie tak niskiego OD może być bardzo trudne. Jeśli tak się stanie, zwykle używamy detergentów, aby całkowicie rozpuścić lipidy i umożliwić długą inkubację, aby osiągnąć dobre rozprowadzenie lipidów wokół miceli zawierających białka (patrz dalej).
      Sonikator kąpielowy o dużej pojemności jest ważny, aby osiągnąć OD410 < 0,2. Korzystaliśmy z systemu wyprodukowanego przez Laboratory Supplies Co., Inc (Model # G112SPIG, Hicksville, NY). Kluczem do prawidłowej sonikacji pęcherzyków jest upewnienie się, że centrum rezonansowe w środku rurki ma silne wibracje. Wibracje zmieniają się wraz z objętością wody i dlatego można je regulować. Stwierdzono również empirycznie, że zwiększona lepkość wody poprzez dodanie niewielkiej ilości glicerolu może zwiększyć skuteczność sonikacji.
      Alternatywnie, odkryliśmy, że użycie sonografu z mikrosondą w kontakcie z zawiesiną lipidową w plastikowej lub metalowej rurce może dać te same wyniki. Mikrosondę należy wyczyścić, a w roztworze lipidowym zanurzyć tylko końcówkę. Ponieważ cząsteczki lipidów są rozbijane na małe kawałki na powierzchni mikrosondy, bardzo ważne jest, aby utrzymać próbkę w chłodzie i mieć wokół siebie pewne środki redukujące, aby zapobiec utlenianiu nienasyconych lipidów.
      Pod mikroskopią krioelektronową większość sonikowanych pęcherzyków jednowarstwowych ma średnicę 30-50 nm (dane nie pokazane). Krzywizna małych SUV-ów jest tak duża, że wystarczy niewielka perturbacja, aby wywołać żywe połączenie tych pęcherzyków w większe o średnicy 80-200 nm (patrz dalej).
    4. Dodać 50 μl 3,0 M KCl i 10 μl 0,50 M s.m. do mieszaniny, tak aby końcowa zawiesina lipidowa miała 300 mM KCl i 10 mM DM. Inkubować roztwór z rotacją poziomą przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w celu wytworzenia miceli mieszaniny lipidów i detergentów. Po inkubacji zawiesina powinna stać się nieco mętna (ryc. 2A), co jest spowodowane wywołanym detergentem połączeniem małych pęcherzyków jednowarstwowych.
    5. Gdy białko jest skoncentrowane do więcej niż 2,0 mg/ml, dodaj 0,50 mg białka KvAP, 50 μl 3,0 M KCl, 16 μl 0,50 M s.m. w wodzie i 10 mM HEPES, pH 7,4 do mieszaniny lipidów i detergentów, aby uzyskać 1 ml końcowej objętości. Końcowy stosunek lipidów do masy białka wynosi 10:1, a końcowe stężenie s.m. wynosi 18 mM (ryc. 2A). Inkubować mieszaninę białka/lipidów/detergentu w szklanej probówce z rotacją poziomą przez kolejne 2 godziny.
      Przy doborze stężenia detergentu kieruje się indukowaną przez detergent fuzją pęcherzyków i solubilizacją pęcherzyków 13. Gdy pęcherzyki powstają w wyniku silnej sonikacji, ich średnia średnica mieści się w zakresie 30-50 nm pod EM. Pęcherzyki te mają bardzo niskie rozpraszanie przy 410 nm. W niskich stężeniach detergenty są najpierw wprowadzane do pęcherzyków, destabilizują pęcherzyki i indukują fuzję pęcherzyków nasyconych detergentem (OD410 idzie w górę; patrz rysunek 2A). Fuzja pęcherzyków prowadzi do wzrostu OD410 nm. W przypadku pęcherzyków 10 mg/ml POPE/POPG OD410 osiąga szczyt przy około 15 mM s.m. Po wprowadzeniu większej ilości detergentów pęcherzyki zaczynają rozpadać się na kawałki, a lipidy dzielą się na micele zmieszane z detergentami i lipidami. Temu ostatniemu procesowi towarzyszy spadek OD410 do końcowego niskiego poziomu (<0,1).
      Ze względu na aktywne zdarzenia fuzji w fazie wzrostu gęstości optycznej spowodowane wywołanym przez detergent fuzją małych pęcherzyków, jest wysoce prawdopodobne, że micele białka/detergentu będą aktywnie łączone z pęcherzykami lipidowymi nasyconymi detergentem. Z tego powodu w momencie przygotowywania mieszanki białkowo-lipidowo-detergentowej wybrano 18 mM s.m. Jeśli detergent zagęści się więcej niż 4-krotnie, ilość s.m. należy dostosować tak, aby końcowe stężenie nadal wynosiło około 18-20 mM. Gdy wydajność białka jest bardzo niska, trudno jest ocenić, ile skoncentrowanych detergentów znajduje się w próbce, zamiast tego zmieszalibyśmy białko z w pełni rozpuszczonymi lipidami i użyli w pełni zrównoważonej mieszaniny do rekonstytucji. W naszych rękach, jeśli nie pozostawiono wystarczająco dużo czasu, aby osiągnąć dobry rozkład równowagi lipidów między micelami zawierającymi białka i bezbiałkowymi, wydajność rekonstytucji znacznie spadła. Zwykle testujemy skuteczność rekonstytucji za pomocą dwóch eksperymentów: 1) badamy komigrację białka z frakcją pęcherzykową w ultrawirowaniu w gradiencie gęstości sacharozy; 2) wyekstrahować białka z odtworzonych pęcherzyków i frakcjonować je w kolumnie żelowo-filtracyjnej, aby dowiedzieć się, ile białka (w naszym przypadku KvAP) pozostaje tetrameryczne. Minimalny czas inkubacji białka/lipidów/detergentów wynosi kilka godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 stopni.
      W przypadku nowego białka błonowego, które jest stabilne w innym detergencie, pierwszym krokiem jest ustalenie właściwości rozpuszczania lipidów przez taki detergent, podobnie jak pokazano na rysunku 2A. Następnie zaleca się rozpoczęcie od ekstraktów PC, takich jak ekstrakt polarny z E. coli PC, ekstrakt PC z soi itp., Tak aby jeśli określone białko potrzebuje pewnych fosfolipidów do swojego funkcjonowania, mogło być już zawarte w wyekstrahowanej mieszaninie lipidów.
  2. Przygotowanie KvAP w mieszaninie z rozpuszczonym w detergentach 1,2-dioleoilo-3-trimetyloamoniowo-propanem (DOTAP) lub 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-bursztynianem (DOGS) --- przykład całkowitej sorozpuszczenia lipidów w celu rozpuszczenia
    1. Preparat lipidowy jest taki sam jak w przypadku pęcherzyków POPE/POPG. Sonikacja uwodnionych lipidów do małych pęcherzyków jednowarstwowych wymaga dłuższego czasu (zwykle 45-60 minut) niż w przypadku lipidów POPE/POPG (zwykle 5-10 minut). Pęcherzyki DOGS mogą powoli łączyć się ze sobą i tworzyć małe oleiste kropelki.
      Ze względu na trudności w wytwarzaniu wysokiej jakości SUV-ów z DOTAP i DOGS w powtarzalny sposób, zwykle całkowicie rozpuszczamy te dwa lipidy przed zmieszaniem z białkami.
    2. Aby całkowicie rozpuścić DOTAP lub DOGS, sonikowane pęcherzyki miesza się z 10 mM DM i 40 mM n-oktylo-β-D-glukozydu (β-OG). Mieszaninę lipidów i detergentów inkubuje się przez noc (> 15 godzin) w temperaturze pokojowej, a mieszanina nie powinna zawierać żadnych małych cząstek ani kropelek. Ale zamiast tego jest to dość jasne. Nieosiągnięcie pełnej równowagi na tym etapie doprowadzi do powstania znacznej frakcji pęcherzyków wielopłytkowych.
    3. Wymieszaj białko KvAP z rozpuszczonym w detergentach DOTAP lub DOGS w stosunku białko do lipidów mniejszym lub równym 1:10. Mieszaninę białka/detergentu/lipidów pozostawia się do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 2-3 godziny z rotacją od końca do końca.

2.2. Usuwanie detergentów do tworzenia proteoliposomów

  1. Dializa --- powolne usuwanie detergentów, takich jak DM i β-OG, które mają stosunkowo wysokie krytyczne stężenia miceli (CMC ≥ 1,0 mM)
    Przygotować 2-litrowy bufor do dializy (Tabela 3) na każde 1,0 ml mieszaniny.
    Wyciąć odpowiednią długość rurki do dializy (MWCO = 10K; szerokość 0,70 cm) i umyć ją wodą DI. Ważne jest, aby sprawdzić i upewnić się, że nie ma wycieków w wężyku. W przypadku wrażliwych próbek rurkę można najpierw potraktować buforem 10 mM Tris-HCl pH8,0 i 2,0 mM EDTA, a następnie wyczyścić we wrzącej wodzie przez 3-5 minut. Rurka jest następnie zaciskana na jednym końcu i płukana buforem do dializy.
    Załaduj mieszaninę białkowo-lipidowo-detergentową do rurki dializowej. Clamp oba końce rurki z minimalną przestrzenią pozostawioną nad roztworem. Umieścić załadowany przewód w buforze do dializy i użyć płytki mieszającej, aby rurka obracała się powoli w roztworze. Zmieniać bufor dializacyjny raz na 8 godzin. Po pierwszej zmianie buforu roztwór powinien stać się mętny, jeśli mieszanina białkowo-lipidowo-detergentowa była całkowicie klarowna. Jeśli dializa jest zbyt szybka, na dnie rurki do dializy mogą znajdować się stałe białe osady. Zaleca się, aby w momencie wymiany bufora rurkę przetrzeć i kilkakrotnie odwrócić. Po pięciu zmianach buforu dializacyjnego pęcherzyki są zwykle gotowe.
    Sprawdzamy resztkową ilość detergentów, wystrzeliwując pęcherzyki na dwuwarstwę lipidową. Gdy pozostała jeszcze znaczna ilość detergentów, dwuwarstwa pęka niemal natychmiast. Możliwy jest również pomiar pozostałości detergentu za pomocą metody kolorymetrycznej lub pomiar napięcia powierzchniowego zawiesiny pęcherzykowej.
  2. Stosowanie kulek polistyrenowych w celu usunięcia detergentów o niskiej zawartości CMC
    W wielu przypadkach musimy używać detergentów o niskiej zawartości CMC, takich jak DDM (CMC ~0,17 mM w wodzie). Do usuwania tych detergentów używa się kulek z maleńkimi hydrofobowymi porami 14.
    1. Przygotowanie koralików. Odważ 0,5 g suchych kulek i włóż je do 50 ml probówki Corning, dodaj 20 ml metanolu, sonikuj roztwór w sonikatorze kąpielowym przez 5 minut, aby usunąć uwięzione pęcherzyki, odwiruj kulki z prędkością 5,000 obr./min przez 5 minut, a następnie zdekantuj większość metanolu. Powtórz pranie z etanolem i wodą MilliQ. Umyte kulki są przechowywane w 20% etanolu w temperaturze 4 °C i przed użyciem należy je zmienić na bufor bez detergentów.
    2. Oszacuj ilość detergentów w mieszaninie białka/lipidów/detergentu, która ma być poddana obróbce, i oblicz ilość kulek potrzebnych do usunięcia detergentów. Dla DDM i DM zdolność wiązania wynosi około 100 mg kulek na 10 mg detergentów. Mokre kulki bez nadmiaru wody są ważone i dodawane bezpośrednio do mieszanki białkowej. Potrzeba co najmniej 15-20 minut, aby kulki były w pełni skuteczne, a spadek stężenia detergentu osiągnął stały poziom14-16. Aby usunąć 8,7 mg DDM (dodecyl-maltozydu) w 1,0 ml roztworu, co odpowiada ~18 mM, stosuje się łącznie 87 mg kulek polistyrenowych, takich jak Bio-Beads SM2, w pięciu równych frakcjach. Mieszaj mieszaninę białka/lipidów/detergentu z każdą frakcją przez 20-30 minut ze stałą rotacją od końca do końca w temperaturze pokojowej, odwiruj kulki, przenieś supernatant do następnej frakcji kulek i powtarzaj do końca.
      Gdy stężenie detergentu osiągnie CMC, celowo wydłużamy ten czas do jednej godziny, aby niewielka ilość detergentów w roztworze ułatwiła fuzję małych pęcherzyków w duże.
    3. Aby usunąć śladową ilość detergentów po ostatnim kroku, dodaj 35 mg kulek Bio-Rad SM2 i inkubuj z pęcherzykami przez 4 godziny.
      Gdy opisane powyżej procedury usuwania detergentu mają być zastosowane do nowego białka, generalnie zaleca się rozpoczęcie od stosunku białka do lipidów (wt/wt) ~1:10. Mieszaninę lipidów i detergentów należy starannie przygotować, aby dodać wystarczającą ilość detergentów, aby całkowicie rozpuścić lipidy (ryc. 2A). Ważne jest, aby inkubować mieszaninę lipidów i detergentów przez ponad 2 godziny w temperaturze pokojowej (przy naziemnej telewizji cyfrowej 1-2 mM) ze stałym wstrząsaniem (400 obr./min) lub obrotami od końca do końca. Gdy białko miesza się z lipidami, mieszanina białka/lipidów/detergentu powinna być inkubowana wystarczająco długo (przez noc, jeśli białko jest stabilne) w temperaturze pokojowej lub w chłodni, tak aby rozkład detergentów i lipidów między micelami zawierającymi białko a micelami bezbiałkowymi był stosunkowo równomierny. Ponadto, jeśli stosowane jest szybkie usuwanie detergentów za pomocą BioBeads, ważne jest, aby dowiedzieć się, jaka jest zdolność kulek do wiązania detergentów. Powolne usuwanie detergentów prawdopodobnie zapewnia, że białka będą miały wystarczającą ilość lipidów, aby zachować swoją integralność i zostać wstawione do stosunkowo dużych pęcherzyków.

2.3. Przechowywanie proteoliposomu i kontrola jakości

  1. Gdy pęcherzyki będą gotowe, przygotuj je do porcji o objętości 50 μl i błyskawicznie zamroź podwielokrotności, bezpośrednio zanurzając je w ciekłym azocie. Zamrożone pęcherzyki są następnie przechowywane w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Do testów biochemicznych nie używamy zamrożonych pęcherzyków, ponieważ czasami stwierdzono, że cykl zamrażania i rozmrażania wprowadza artefakty do naszej reakcji specyficznej dla cys. Do nagrań elektrycznych używamy wyłącznie pęcherzyków, które są przechowywane w temperaturze -80 °C przez mniej niż 6 miesięcy.
  2. Unoszenie pęcherzyków w gradiencie gęstości (ryc. 2B)
    1. Załadować 50 μl zawiesiny pęcherzyków na warstwy gradientu sacharozy zawierające po 0,3 ml 10, 35 i 55% sacharozy wytworzonej w 10 mM HEPES i wirować z prędkością 200 000 x g przez 4 godziny w temperaturze 4 °C. Przyspieszaj i zwalniaj powoli, aby uniknąć przerwania granicy faz między warstwami.
    2. Zbierz 100 μl frakcji od góry do dołu i uruchom je na nieredukcyjnej SDS-PAGE (Rysunek 2B). KvAP jest dobrze wybarwiony błękitem Coomassie, tak że wyraźnie widoczne jest pasmo białka 0,5-1,0 mikrograma. Białko KvAP powinno znajdować się na granicy faz między 10 a 35% sacharozy. W zakresie dużej gęstości nie obserwuje się ciężkich agregatów białek, co wskazuje, że prawie wszystkie białka znajdują się w błonach.
  3. Sprawdź prawidłową konformację kanału KvAP w pęcherzykach.
    Nasze wcześniejsze dane ustaliły, że pojedynczy mutant cysteiny (L125C/C247S) KvAP, gdy jest prawidłowo zintegrowany w dwuwarstwach, jest całkowicie zakopany w błonach i nie może być dostępny dla odczynników specyficznych dla cysteiny 8. Procedury rekonstytucji zostały przetestowane z tym zmutowanym kanałem i sprawdzone za pomocą odczynnika specyficznego dla Cys, MTS-PEG5000. Modyfikacja w L125C odczynnikiem MTS 1,0 μM w temperaturze pokojowej wprowadza przesunięcie o 5 kDa do pasma KvAP w nieredukującym żelu SDS-PAGE. Pomyślne wdrożenie naszych procedur rekonstytucji powinno doprowadzić do braku wykrywalnej reakcji dla zmutowanych kanałów L125C w błonach fosfolipidowych, co sugeruje prawie całkowitą indukcję wszystkich kanałów w dwuwarstwach. Jako pozytywną kontrolę reakcji wprowadza się 5,0 mM DM, aby umożliwić dostęp odczynnikowi MTS do prawie wszystkich reszt L125C w zmutowanych kanałach.
    Alternatywnie, toksyna wiążąca pory, taka jak chrybdotoksyna, może być użyta do zliczenia kanałów tetramerycznych. Test wiązania oparty na przeciwciałach (zob. ramka 2, gdzie Fv przygotowuje się jako ligand specyficzny dla konformacji dla KvAP) można zastosować w celu ilościowego określenia dostępnych miejsc wiązania w odtworzonych pęcherzykach. Te testy wiązania można następnie porównać z testem ilościowym mierzącym całkowite białko w celu ustalenia, jaka frakcja odtworzonych kanałów to tetramery, a jaka część białka ma prawidłowo złożoną łopatkę czujnika napięcia (S3/S4 czujnika napięcia).
    W przypadku innych białek, które mają zostać odtworzone, wskazane jest wprowadzenie metody ilościowej w celu oceny, jaka frakcja odtworzonych białek jest prawidłowo sfałdowana. Dokładne badanie funkcjonalne jest zatem warunkiem wstępnym do opracowania dobrej kontroli jakości dla udanej rekonstytucji.

3. Zastosowania pęcherzyków zawierających kanał rekonstytuowany

3.1. Funkcjonalne badanie aktywności kanałów jonowych w czarnych błonach lipidowych.

Przygotowanie potrzebnych materiałów.

  1. Preparat lipidowy
    1. Wyczyść szklaną probówkę, bursztynową fiolkę z zakrętką z teflonem i zestaw szklanych strzykawek z chloroformem. Wysuszyć bursztynową fiolkę pod strumieniem argonu.
    2. Przenieść 0,75 mg POPE i 0,25 mg POPG w chloroformie do bursztynowej fiolki i odparować chloroform za pomocą argonu.
    3. Umyj wysuszone lipidy 0,20 ml pentanu i całkowicie wysusz, aby usunąć resztki chloroformu. Na koniec rozpuść lipidy w 50 μl dekanu. Lipidy w dekanie (20 mg / ml) zostaną wykorzystane do malowania dwuwarstwy lipidowej w poprzek otworu o średnicy 150-250 mikronów (ryc. 3B) wywierconego w rozcieńczonej części po jednej stronie eksperymentalnego kubka dwuwarstwowego (ryc. 3A).
  2. Przygotowanie roztworu
    1. Roztwór wewnątrzkomórkowy (trans): 10 mM HEPES/KOH, pH 7,4, 15 mM KCl
    2. Roztwór zewnątrzkomórkowy (cis): 10 mM HEPES/KOH, pH 7,4, 150 mM KCl
    3. Most solny: Zegnij szklane kapilary w mostki w kształcie litery U i wypełnij je 1,0% stopionym agarem rozpuszczonym w roztworze zewnątrzkomórkowym.
      Stwierdzono, że gradient osmotyczny ustalony między roztworami trans i cis jest główną siłą napędową fuzji pęcherzyków na dwuwarstwie lipidowej17. W przypadku ujemnie naładowanych lipidów stwierdzono, że 15 mM CaCl2 lub dodatnio naładowane peptydy poli-argininowe są w stanie indukować zdarzenia fuzji. Fusogeniczne lipidy, takie jak DOTAP i DOGS itp., mogą zostać wprowadzone do pęcherzyków lipidowych, dzięki czemu szansa na fuzję jest większa.

Nagrania elektryczne z kanałów KvAP w dwuwarstwach lipidowych

  1. Wstępnie pomaluj okrągły otwór (średnica ~0,25 mm), który jest wywiercony na cylindrycznej powierzchni dwuwarstwowej miseczki (Rysunek 3B). Lipidy są przenoszone za pomocą tłuczka kapilarnego, który jest wytwarzany w laboratorium. Okrągła główka tłuczka kapilarnego jest wypolerowana i nie rysuje powierzchni kubka. Niewielka ilość lipidów przenoszona przez tłuczek kapilarny jest rozprowadzana wokół otworu w dwuwarstwowym kubku i suszona na powietrzu.
  2. Odczekaj 1-2 minuty, aby dekan całkowicie wyparował. Należy uważać, aby roztwór lipidowy nie dostał się do otworu.
  3. Włóż kubek do komory nagrywania, włóż mostki solne i połącz elektrody z dwiema stronami kubka nagrywającego (Rysunek 4A). Dodaj roztwór cis i trans po obu stronach otworu. Ustala się gradient osmotyczny, aby ułatwić fuzję pęcherzyków z dwuwarstwą lipidową.
  4. Dostosuj przesunięcie potencjału między dwiema stronami kubka do ~0 (zwykle < 2 miliwoltów). Użyj tłuczka kapilarnego, aby przenieść niewielką ilość mieszaniny lipidów do dekanu i pomaluj lipid w poprzek otworu, aż utworzy się dwuwarstwowa membrana. Tworzenie się dwuwarstwy jest wykrywane poprzez rejestrację prądu pojemnościowego podczas dostarczania impulsu rampowego.
  5. Poczekaj, aż membrana rozrzedzi się i stanie się względnie stabilna. Czekamy, aż nie będzie już zmiany pojemności membrany przez 3-5 min.
    Ogólne myślenie o płaskiej dwuwarstwie utworzonej w dużym otworze jest takie, że sama środkowa część membrany ma grubość bliską ~ 4,0 nm jako zwykła dwuwarstwa, a membrana staje się grubsza, gdy zbliża się do krawędzi otworu, gdzie wokół znajduje się pierścień, a większość rozpuszczalnika dekanu ma18, 19. Nieuniknione jest, że w centralnej dwuwarstwowej części membrany pozostały resztki dekanu. Wcześniejsze szacunki stosunku objętości n-dekanu do PC wynosiły 0,35-0,45 po rozrzedzeniu dwuwarstwy 18, 20-22. Badanie EM rozcieńczonej dwuwarstwy wykazało, że pomiędzy dwoma listkami dwuwarstwy22 znajdowały się soczewki dekanu. Dane te sugerowały, że białka błonowe wstawione do dwuwarstwowych błon lipidowych współistnieją z maleńkimi wyspami (o średnicy do 50 nm) dekanu. Szczątkowy dekan w dwuwarstwie zmniejsza również stałą pojemności elektrycznej do 0,4-0,5 μF/cm2, co można wykorzystać do uzyskania przybliżonego oszacowania wielkości rozcieńczonej dwuwarstwy na podstawie zmierzonej pojemności. Dwuwarstwa o pojemności 100 pF pochodzi z okrągłej dwuwarstwowej membrany o średnicy ~180 μm.
    W przypadku KvAP resztkowy dekan nie zakłócił jego zależnego od napięcia bramkowania, mimo że funkcja kanału nie została dokładnie zbadana w dwuwarstwie bezrozpuszczalnikowej. To samo wydaje się być prawdą w przypadku kanałów NaChBac i kanałów Kv1.2 wstawionych do BLM23. Nadal nie jest jasne, czy znaczące przesunięcie w lewo krzywej G-V mierzone od kanałów Kv1.2 w dwuwarstwie dekanowo-lipidowej w stosunku do kanałów w oocytach ma coś wspólnego z resztkowym dekanem23. W zależności od lipidów użytych do tworzenia dwuwarstw, ilość resztkowego dekanu w dwuwarstwie może się różnić. Na przykład doniesiono, że tworzenie płaskich błon lipidowych MGDG (mono-galaktozylo-diacyloglicerolu) wymaga dekanu, prawdopodobnie z powodu szczelin między stożkowym MGDG wypełnionych cząsteczkami dekanu. To, czy resztkowy dekan ma wpływ na białka, które mają być badane, jest czysto empiryczne, a test eksperymentalny jest potrzebny, aby stwierdzić, czy wpływ jest znaczący, czy nie.
  6. Gdy tylko membrana się ustabilizuje, wystrzel 0,5-1,0 μl pęcherzyków zawierających kanał, umieszczając cienki koniec końcówki pipety P2 tuż nad otworem. Pęcherzyki opadają w dół przez otwór na dno kubka.
    Podczas tego procesu wiele pęcherzyków przyczepia się do błony w poprzek otworu. Mając wystarczająco dużo czasu, niektóre z nich są łączone z częścią dwuwarstwową, tak aby niewielka liczba kanałów KvAP była prawidłowo wprowadzana do płaskiej dwuwarstwy w środkowej części membrany. Zarówno gradient osmotyczny, jak i oddziaływanie elektrostatyczne są ważne w fuzji pęcherzyków z dwuwarstwami lipidowymi 17, 24.
  7. W celu przetestowania kanałów KvAP w dwuwarstwie dostarczany jest krótki impuls o napięciu 80 mV z potencjału podtrzymania -80 mV. Ze względu na szybką inaktywację i powolny powrót do zdrowia po inaktywacji, między dwoma impulsami występuje długi odstęp czasu (~120 sekund dla kanałów w membranach PE/PG). Typowy zapis prądu z kanałów w membranie POPE/POPG pokazano na rysunku 3C. Jeśli prąd jest mały, wystrzel więcej pęcherzyków. Gdy prąd wygląda na dobry pod względem wielkości, zrównoważ stężenia jonów w roztworach po obu stronach membrany. Kanały są gotowe do eksperymentów elektrofizjologicznych.

3.2. Badanie przesiewowe pod kątem specyficznych dla konformacji ligandów przeciwko kanałom w pęcherzykach

  1. Wprowadzenie biblioteki wyświetlanej przez fagi.
    Biblioteka 20-merowych peptydów wyświetlana przez fagi jest obecna na N-końcu pięciu kopii białek pIII na jednym końcu nitkowatego bakteriofaga fd-tet 25. Biblioteka prezentuje ok. 1 x 108 różnych typów losowych sekwencji 20-merowych peptydów i została nam udostępniona przez laboratorium dr Kathlynn Brown w UT Southwestern Medical Center 26. Zakażenie fagiem E. coli K91 sprawia, że bakterie stają się odporne na 12 μg/ml tetracykliny.
    Szczegółowa procedura hodowli bakterii, amplifikacji i mianowania fagów oraz sekwencjonowania kolonii fagów została opisana przez McGuire'a i wsp. 26 W następnej sekcji przedstawimy krótki opis podstawowych operacji. Czytelnicy mogą znaleźć więcej szczegółów w artykule McGuire'a. Zamiast tego skupimy się na izolacji określonych klonów, które ściśle wiążą się z kanałami jonowymi odtworzonymi w pęcherzykach (ryc. 4A).
    Podstawową ideą naszego ekranu jest to, że fagi związane z odtworzonymi kanałami mogą być ściągane w dół za pomocą pęcherzyków. Związany może być amplifikowany i testowany w stosunku do kanałów w błonach lipidowych. Nasze badanie zmian konformacyjnych czujników napięcia KvAP w różnych błonach lipidowych8 wykazało, że możliwe jest utrzymanie czujników napięcia w stanie "aktywnym" lub "spoczynkowym" poprzez przełączanie lipidów ze zwykłych fosfolipidów na te, które nie zawierają fosforanów w regionach grupy głównej (DOTAP i DOGS w naszych eksperymentach). Te dwie konformacje determinowane przez lipidy są wykorzystywane w naszych badaniach przesiewowych ligandów specyficznych dla konformacji. Biblioteka fagów zostanie najpierw nasycona kanałami w pęcherzykach fosfolipidowych (selekcja negatywna), zanim zostanie wybrana do ścisłych wiązań z kanałami w błonach DOTAP i DOGS (selekcja pozytywna).
  2. Podstawowe procedury selekcji fagów
    Wzrost bakterii K91 w pożywce LB: Czas podwojenia bakterii wynosi około 20 minut w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu 200 obr./min.
    Wzmocnienie biblioteki: Wymieszać roztwór faga z bakteriami K91 w OD0,4. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze 37 °C mieszaniny rozprowadza się równomiernie na2 płytkach agarowych o wymiarach -9,5 x 9,5 cala zawierających 12 μg / ml tetracykliny, Zastosowanie dużych płytek zapobiega dominacji kultury przez bakterie o wyższym tempie wzrostu. Gdy różnorodność biblioteki jest mniejsza, 10-centymetrowe szalki Petriego są używane do selekcji i amplifikacji na małą skalę.
    Amplifikacja poszczególnych klonów na dużą skalę: Zaszczepić małą porcję fagów (~100 milionów) w 250 ml LB plus 5 mM MgSO4 i 12 μg/ml tetracykliny, Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C. Zbierać komórki przez wirowanie 6,000 obr./min przez 10 min. Zebrać supernatant i dodać do niego 0,2 obj./obj. bufor strącający (2,5 M NaCl, 20% PEG8000). Po inkubacji na lodzie przez 1,0 godziny odwirować roztwór przy 17 000 x g przez 30 minut, aby osadzać wszystkie fagi. Usunąć cały sklarat nad osadem, dodać 1,0 ml PBS, inkubować na lodzie przez 30 minut, delikatnie zawiesić osad (bez wirowania). Przenieść zawiesinę do świeżej probówki i odwirować z prędkością 14 000 obr./min przez 2 minuty. Przenieść supernatant do innej probówki i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 15 minut, aby zabić wszystkie bakterie. Odwirować probówkę przez 2 minuty przy 13 000 obr./min. Odrzucić osad, podwielokrotność i przechowywać roztwór fagowy w temperaturze -80 °C.
  3. Płukanie fagów względem kanałów KvAP w pęcherzykach lipidowych.
    1. Fagi wyświetlające peptydy muszą być amplifikowane i balansowane przed naszymi eksperymentami, aby znana była liczba fagów na jednostkę objętości. KvAP rozpuszczono w pęcherzykach POPE/POPG (3:1) plus 0,50% Biotyna-DOPE jako kontrola negatywna, a następnie w DOGS: biotyna-DOPE (199:1; to samo zrobiono dla pęcherzyków DOTAP) jest używana jako cel selekcji. Końcowe stężenie KvAP w pęcherzykach wynosi 0,50 mg/ml, a lipidów 5,0 mg/ml. Bufor do płukania zawierał 500 mM KCl, 100 mM HEPES/KOH pH 7,4 i 0,10 mg/ml BSA.
      W pierwszej serii ~10 10 fagów (100 kopii dla każdego typu) rozcieńczono do 0,050 ml pożywki LB. Dla kolejnych etapów panoramowania początkowy został dostosowany tak, aby mieścił się w zakresie od 106 do 108.
    2. Selekcja negatywna:
      Inkubować rozcieńczone fagi w 50 μl LB ze 100 μl kulek agarozowych NeutrAwidin (zdolnych do wiązania 1-2 mg biotynylowanego BSA na ml żywicy; Pierce) w 1,0 ml buforze do wytaczania. Po 10 minutach inkubacji oddziel kulki, obracając je w tempie 100 x g przez 1,0 min. Powtórz ten krok dwukrotnie, aby usunąć wszelkie fagi, które wiążą się bezpośrednio z kulkami.
      Wymieszaj pozostałe fagi z poprzedniego etapu z 50 μl pustych pęcherzyków (POPE/POPG plus 0,5% biotyny-DOPE), które nie zawierają białek. Dodać 100 μl kulek NeutrAwidyny, które zostały przemyte buforem do płukania, do mieszaniny fagów i pęcherzyków. Po obracaniu mieszaniny w temperaturze pokojowej przez 5 minut, usuń kulki przez 100 x g wiruj przez 30 sekund. Ten krok powtarza się dla pustych pęcherzyków PSÓW: biotyna-DOPE (199:1), a także dla kanałów KvAP w pęcherzykach POPE/POPG (z 0,5% biotyny-DOPE). Supernatant po tych zabiegach zawiera w pełni oczyszczone fagi. Po pierwszych dwóch cyklach przesiewowych wstępną selekcję można było przeprowadzić tylko w odniesieniu do KvAP w pęcherzykach POPE/POPG.
    3. Selekcja pozytywna
      Inkubować w pełni oczyszczone fagi z kanałami KvAP w pęcherzykach DOGS: biotyna-DOPE (199:1) (to samo dla pęcherzyków DOTAP) w obecności 100 μl kulek NeutrAwidyny w temperaturze pokojowej przez 10 min. Doprowadzić objętość mieszaniny do 15 ml za pomocą buforu do płukania przed odwirowaniem przy 100 x g przez 10 minut. Zbierz kulki i umyj je trzykrotnie za pomocą 45 ml buforu do płukania.
    4. Ponownie zawiesić kulki w pożywce o pojemności 500 μl LB zawierającej 5,0 μg/ml biotyny i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny w celu uwolnienia części związanych fagów z NeutrAvidin, która ma mniejsze powinowactwo niż natywna biotyna. Oddziel koraliki przez wirowanie 100 x g przez jedną minutę. Zebrać supernatant i kulki do dwóch różnych probówek w celu mianowania.
    5. Aby amplifikować wybrane fagi, zmieszaj 200 μl supernatantu lub zawieszonych kulek w ostatnim etapie z 500 μl kultury bakteryjnej K91 (Ø 600 ~ 0,4-0,6, hodowana ~ 4 godziny przed użyciem). Po inkubacji w temperaturze 37 °C przez 15 minut, rozlać po 50 μl każdej z nich na płytki tetracyklinowe do hodowli przez noc.
      Podczas pierwszych dwóch cykli przesiewowych (ryc. 4A) zbierz wszystkie 500 μl supernatantu i kulki z ostatniego etapu, wymieszaj je z 5 ml kultury bakterii i umieść je na 9,5-calowych kwadratowych płytkach w celu odzyskania i amplifikacji wszystkich kolonii fagów. Ten krok jest ważny dla odzyskania tych fagów, które sprawiają, że bakterie rosną wolniej niż inne.
    6. Kolonie z płytek są amplifikowane i mianowane przed następnym cyklem panoramowania i selekcji (patrz McGuire, et al., 26).
    7. Zbadaj aktywność pozytywnie wybranych fagów na kanałach.
      Po 10-12 cyklach selekcji przetestuj całkowite amplifikowane fagi na kanałach KvAP w dwuwarstwach lipidowych wykonanych z POPE / POPG. Jeśli istnieje znaczna frakcja klonów dodatnich, wybrane fagi przy 100-500 nM powinny blokować znaczną część kanałów w dwuwarstwie (Figura 4B), tak jak wybieraliśmy kanały stabilizowane w stanie spoczynku. Pozytywne dane sugerują, że istnieją klony, które będą wykazywać silne wiązanie z kanałami w stanie spoczynku. Po 16 cyklach selekcji wybierz 50 dodatnich kolonii do sekwencjonowania pojedynczej kolonii. Zidentyfikowane dominujące klony fagów są wybierane na podstawie porównania sekwencji, a następnie amplifikowane i testowane na kanałach w dwuwarstwach. Po potwierdzeniu dodatnich klonów zsyntetyzuj peptydy przenoszone przez silnie dodatnie klony i przetestuj je również na kanałach, aby potwierdzić ich aktywność specyficzną dla konformacji.

3.3. Krystalizacja kanałów KvAP w membranach do określania struktury 27-29

  1. Aby ustabilizować konformację kanału, do utworzenia kompleksu KvAP / Fv stosuje się specyficzne dla konformacji spoiwo kanału, białko 33H1 Fv. Sposób przygotowania białka Fv jest szczegółowo opisany w ramce 2. Oczyść kompleks w kolumnie Superdex 200. Kompleks wymywa się w naszym systemie w ilości około 11,4 ml.
  2. Do wstępnego badania przesiewowego wymieszaj białko z DMPC lub POPC, które jest całkowicie rozpuszczone w DM lub β-OG. Mieszaninę białkowo-lipidowo-detergentową miesza się przez ponad 15 godzin w celu osiągnięcia równowagi termodynamicznej w rozkładzie trzech składników wśród zmieszanych miceli. Zwykle najpierw badamy trzy różne proporcje lipidów / białek (LPR = 0,5, 1,5, 2,5) i trzy różne poziomy pH (6,0, 7,0 i 8,0). Bufor dializacyjny zawiera 20 mM buforu K-fosforanu, 100 mM KCl i 3,0 mM NaN3. Bufor dializacyjny jest wymieniany co 2-3 dni. Niewielką porcję kryształów wyjmuje się co 2-3 dni w celu zbadania powstawania pęcherzyków i możliwego pojawienia się sieci krystalicznej.
    Tabloidowa lista LPR w funkcji pH służy do określenia zachowania białka w dwóch różnych typach lipidów. Zależy nam na uzyskaniu stosunkowo dużych (ponad 150 nm) pęcherzyków lub arkuszy membranowych, gdy próbki dializy są badane za pomocą ujemnego barwienia EM. Mały regularny wzór na membranach sugeruje trafienie i zostanie wykorzystany do dalszej optymalizacji.
    Barwienie ujemne EM: Siatki miedziane pokryte foliami węglowymi (o grubości ~3-5 nm) są rozżarzone w powietrzu, dzięki czemu powierzchnia węgla jest hydrofilowa. Niewielką objętość (2-3 mikrolitry) zawiesiny kryształów ładuje się na powierzchnię węgla i inkubuje przez 0,5-1,0 min. Osusz siatki z boku rozdartą krawędzią kawałka bibuły filtracyjnej Whatman #4. Odwróć siatkę i inkubuj ją przez ~ 15 sekund na kropli 150 mikrolitrów roztworu barwiącego (2,0% PTA / KOH, pH 8,0 w wodzie plus 0,5% trehalozy; lub 6,0% molibdenianu amonu / KOH, pH 6,3-6,5, w wodzie plus 0,5-1,0% trehalozy). Osusz roztwór w jak największym stopniu z powierzchni siatki i pozwól siatce wyschnąć przed włożeniem jej do TEM w celu zbadania. Obrazy pęcherzyków są wykonywane w warunkach niskiej dawki, aby uniknąć uszkodzenia przez jakiekolwiek krystaliczne upakowanie przez elektrony.
  3. Ekran jest następnie rozwijany w celu zbadania mniejszych kroków LPR w celu osiągnięcia prawidłowego LPR. Jeśli białka nadają się do krystalizacji, może stać się widoczna niewielka sieć białek w błonach. Wokół tych warunków początkowych należy dodatkowo zoptymalizować krystalizację, zmieniając rodzaje i stężenia soli, temperaturę, szybkość i metody usuwania detergentów, kationy dwuwartościowe, detergenty używane do przygotowania białek, środki strącające, skład lipidów itp.
    Zoptymalizowane kryształy 2D kompleksu KvAP∆36/Fv rosną w duże arkusze o wielkości od kilku mikronów do 20-30 mikronów (rysunek 5A). W warunkach krioEM kryształy wykazują wyraźną kwadratową sieć z oczywistą czterokrotną symetrią, jak oczekiwano po czterokrotnych symetrycznych kanałach (Rysunek 5B i C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny przebieg eksperymentów mających na celu oczyszczenie kanału KvAP do poziomu homogeniczności biochemicznej przedstawiono na Rysunku 1A. Typowe próbki pobrane podczas ekspresji i oczyszczania białka pokazano na żelu SDS-PAGE na Rysunku 1B. Białko po oczyszczaniu metodą IMAC jest stosunkowo czyste. Wydajność uzyskania kanału KvAP wynosi około 1,0 mg/Liter hodowli.

Solubilizację pęcherzyków lipidowych za pomocą detergentów należy opracować dla każdej pary l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Rekonstytucja kanałów KvAP w różnych błonach została wykorzystana w kilku badaniach 8-10. Podążając za ideą zapewnienia dystrybucji lipidów między micelami mieszanymi detergentowo-lipidowymi a micelami mieszanymi białka/detergentu/lipidów, jesteśmy w stanie osiągnąć prawie całkowitą rekonstytucję KvAP w błonach zbudowanych z bardzo różnych lipidów. Każdy tetrameryczny kanał KvAP potrzebuje ~100 cząsteczek lipidów, aby w pełni pokryć swoją domenę transbłonową. Podstawowym wymogiem jest umożliwienie wystarczając...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania nad KvAP w laboratorium Jiang uzyskały znaczącą pomoc od laboratorium dr Rodericka MacKinnona na Uniwersytecie Rockefellera. Specjalne podziękowania kierujemy do dr Kathlynn Brown i Michaela McQuire'a za ich rady i pomoc w naszych eksperymentach z wykorzystaniem fagów. Prace te były wspierane przez granty z NIH (GM088745 i GM093271 do Q-XJ) oraz AHA (12IRG9400019 do Q-XJ).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
TryptonRPI Corp.T60060
Ekstrakt drożdżowyRPI Corp.Y20020
NaClFisherS271-3
Tris BaseRPI Corp.T60040
Chlorek potasuFisherBP366-500
n-Dodecyl-β-D-MaltosideAffymetrixD322SZol-grade
n-oktyl-β-D-glukozyd AffymetrixO311Ana-grade
AprotininRPI Corp.A20550-0.05
LeupeptinRPI Corp.L22035-0.025
Pepstatyna ARPI Corp.P30100-0.025
PMSFSIGMAP7626
Dnase IRoche13407000
Bio-Bead SM-2Bio-Rad152-3920
HEPESRPI Corp.H75030
POPEAvanti Lipidy polarne850757C
POPGLipidy polarne Avanti840457C
PSYLipidy polarne Avanti870314C
DMPC Lipidy polarne Avanti850345C
Biotyna-DOPE Lipidy polarne Avanti870282C
DOTAPLipidypolarne Avanti890890C
NeutrAvidin koraliki agarozowe Piercenet29200
Rurki do dializySpectrum Laboratories, Inc132-570
PentaneFisherR399-1
DecaneTCI AmericaD0011
MTS-PEG5000Toronto Research CemicalsM266501

Bibliografia

  1. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Galand Science. New York. (2007).
  2. Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203(2005).
  3. Lee, A. G. How lipids affect the activities of integral membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62(2004).
  4. Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199(1998).
  5. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269(2004).
  6. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257(2003).
  7. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. J. Vis. Exp. (20), e1033(2008).
  8. Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel. Nat. Commun. 2, 250(2011).
  9. Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444, 775(2006).
  10. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, 180(2003).
  11. Jiang, Q. X., Gonen, T. The influence of lipids on voltage-gated ion channels. Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884(2012).
  12. Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, W597(2012).
  13. Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso. Eur. J. Biochem. 243, 798(1997).
  14. Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal. Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179(1990).
  15. Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase. Biophys. J. 72, 2545(1997).
  16. Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283(1992).
  17. Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane. The Journal of General Physiology. 75, 251(1980).
  18. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, 1404(1994).
  19. Hanke, W., Schlue, W. -R. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. Biological Techniques. Sattelle, D. B. , Academic Press, Inc. San Diego. 133(1993).
  20. Tien, H. T. Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. , Marcel Dekker, Inc. New York. 655-65 (1974).
  21. Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution. The Journal of Membrane Biology. 10, 11(1972).
  22. Henn, F. A., Thompson, T. E. Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies. Journal of Molecular Biology. 31, 227(1968).
  23. Tao, X., MacKinnon, R. Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers. J. Mol. Biol. 382, 24(2008).
  24. Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes. The Journal of Cell Biology. 98, 1054(1984).
  25. Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).
  26. McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands. Methods Mol. Biol. 504, 291(2009).
  27. Rigaud, J. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753(2002).
  28. Chami, M., et al. Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins. J. Struct. Biol. 133, 64(2001).
  29. Kuhlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of membrane proteins. Q. Rev. Biophys. 25, 1(1992).
  30. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65(2003).
  31. Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. J. Struct. Biol. 121 (2), 142(1998).
  32. Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin. J. Struct. Biol. 157, 321(2007).
  33. Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J. Struct. Biol. 160, 295(2007).
  34. Iacovache, I., et al. The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife. J. Struct. Biol. 169, 370(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rekonstytucja kana w Kvwbudowywanie w b ony lipidoweoczyszczanie bia ekrejestracja w p askich dwuwarstwachkrystalografia elektronowausuwanie detergentufuzja p cherzyk woddzia ywanie bia ko lipidanaliza strukturalnabadanie funkcjonalne

Powiązane artykuły