Artykuł metodologiczny

Pomiar podwójnego knockdownu genu i percepcji smakowej za pośrednictwem RNAi u pszczół miodnych (Apis mellifera)

DOI:

10.3791/50446

⸱

25 lipca 2013

 ,  , 
1School of Life Sciences, Arizona State University , 2Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisujemy dwie strategie, które jednocześnie tłumią dwa geny (podwójny knockdown genu) u pszczół miodnych. Następnie przedstawiamy, jak wykorzystać test odpowiedzi na rozszerzenie trąby (PER) do zbadania wpływu knockdownu podwójnego genu na percepcję smakową pszczoły miodnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten film demonstruje nowatorskie techniki interferencji RNA (RNAi), które obniżają poziom dwóch genów jednocześnie u pszczół miodnych za pomocą wstrzyknięć z dwuniciowym RNA (dsRNA). Przedstawiono również protokół testu odpowiedzi na rozszerzenie trąbki (PER) do pomiaru percepcji smakowej.

Knockdown genów za pośrednictwem RNAi jest skuteczną techniką obniżającą ekspresję genów docelowych. Technika ta jest zwykle stosowana do manipulacji pojedynczymi genami, ale ma ograniczenia w wykrywaniu interakcji i wspólnych efektów między genami. W pierwszej części tego filmu przedstawiamy dwie strategie jednoczesnego knockdown dwóch genów (tzw. double gene knockdown). Pokazujemy, że obie strategie są w stanie skutecznie stłumić dwa geny, witellogeninę (vg) i ultraspiracle (usp), które znajdują się w regulacyjnej pętli sprzężenia zwrotnego. To podejście oparte na podwójnym nokaucie genów może być wykorzystane do analizy wzajemnych powiązań między genami i może być łatwo stosowane u różnych gatunków owadów.

Druga część tego filmu to demonstracja testu odpowiedzi na przedłużenie trąbki (PER) u pszczół miodnych po leczeniu knockdownu podwójnego genu. Test PER jest standardowym testem do pomiaru percepcji smakowej u pszczół miodnych, który jest kluczowym predyktorem szybkości dojrzewania behawioralnego pszczoły miodnej. Większa percepcja smakowa pszczół gniazdowych wskazuje na zwiększony rozwój behawioralny, który często wiąże się z wcześniejszym wiekiem na początku żerowania i specjalizacją żerowania w pyłku. Ponadto test PER może być stosowany do identyfikacji metabolicznych stanów sytości lub głodu u pszczół miodnych. Wreszcie, test PER w połączeniu z parowaniem różnych bodźców zapachowych w celu kondycjonowania pszczół jest również szeroko stosowany do badań nad uczeniem się i pamięcią u pszczół miodnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interferencja RNA (RNAi) to posttranskrypcyjne wyciszanie genów oparte na RNA, które występuje w wielu różnych organizmach eukariotycznych. Proces RNAi jest wywoływany przez endogenne lub egzogenne prekursory dwuniciowego RNA (dsRNA). dsRNA aktywuje białko rybonukleazy Dicer, które wiąże i rozszczepia dsRNA na małe fragmenty (20-25 pz). Następnie małe fragmenty dsRNA kierują rozpoznawaniem i szczepieniem komplementarnych mRNA przez białka argonaute, katalityczny składnik kompleksu wyciszającego indukowanego RNA (RISC)1. U ssaków dsRNA dłuższe niż 30 nt aktywują odpowiedź przeciwwirusową (odpowiedź interferonową, IFN), która prowadzi do niespecyficznej degradacji transkryptów RNA 2. Jednak długie dsRNA okazały się skuteczne i specyficzne dla owadów, ponieważ brakuje tego IFN 3.

Długie dsRNA były używane do obniżania docelowych genów u różnych gatunków owadów. Pszczoły miodne są jednymi z pionierskich organizmów owadzich, w których ujawniono funkcje wielu ważnych genów w rozwoju i zachowaniu dzięki zastosowaniu dsRNA 4,5. U pszczół miodnych zastosowano kilka metod dostarczania dsRNA: karmienie dsRNA skutecznie obniża ekspresję genów docelowych u larw pszczół miodnych 6, podczas gdy wstrzykiwanie dsRNA jest skutecznym podejściem do knockdownu genów w zarodkach pszczół miodnych 4 i dorosłych pszczołach 7,8.

Efekty knockdown genu wykazywane przez zastosowanie dsRNA do owadów są przejściowe i zlokalizowane. Badania wykazały, że zarówno zastrzyki dsRNA w jamie brzusznej, jak i wstrzyknięcia dsRNA w klatce piersiowej skutecznie hamują ekspresję genów docelowych w komórkach tłuszczowych jamy brzusznej owadów 9,10. DsRNA jest wstrzykiwane do jamy brzusznej i klatki piersiowej, a komórki tłuszczowe są w stanie pobrać dsRNA z hemolimfy, w której komórki są kąpane 10. Jednak geny w innych narządach, takich jak jajniki i mózg, nie mogą być celem ani zastrzyków w jamę brzuszną, ani w klatkę piersiową. W celu celowania w geny w mózgu pszczoły miodnej przeprowadzono również wstrzyknięcie do mózgu dsRNA, które skutecznie wpływa na ekspresję genów docelowych w lokalnych obszarach mózgu 11. Tutaj dokumentujemy tylko wstrzyknięcie dsRNA do jamy brzusznej, które jest częściej stosowane u dorosłych pszczół miodnych.

RNAi było przede wszystkim używane do celowania w pojedynczy gen i było potężnym narzędziem do ujawnienia funkcji genu. Jednak żaden gen nie jest izolowany od innych; Znajduje się w złożonych sieciach regulacyjnych. Kluczem do zrozumienia procesu biologicznego jest przeanalizowanie, w jaki sposób geny oddziałują ze sobą, co wymaga jednoczesnych manipulacji wieloma genami, a nie wyłączeniem pojedynczego genu. W liniach komórkowych ssaków naukowcom udało się jednocześnie zahamować dwa lub trzy geny za pomocą systemów dostarczania 12 lub spinek do włosów z wieloma mikroRNA (miRNA) 13. Ale u owadów wielokrotne knockdowny genów są nadal nieprzetestowane. W tym miejscu przedstawiamy różne strategie iniekcji, które mogą doprowadzić do podwójnego knockdownu genu. Naszym celem są dwa geny: witellogenina (vg), która koduje prekursor białka żółtka, oraz ultraspiracle (usp), który koduje przypuszczalny receptor dla hormonu juwenilnego (JH) i może służyć jako czynnik transkrypcyjny pośredniczący w odpowiedziach na JH 14 u pszczół miodnych. Vg i JH regulują się nawzajem w pętli sprzężenia zwrotnego 15 i są zaangażowane w regulację zachowania pszczół miodnych 9. Korzystając z podwójnego knockdownu, zaburzamy zarówno szlaki Vg, jak i JH i odkrywamy, w jaki sposób wspólnie wpływają one na zachowanie i fizjologię pszczół miodnych oraz jak vg, usp i JH oddziałują na siebie 9.

Percepcja smakowa jest behawioralnym predyktorem zachowań społecznych pszczół miodnych 16. Jeśli chodzi o rozwój behawioralny, pszczoły gniazdowe o wysokiej percepcji smakowej szybko dojrzewają behawioralnie i zwykle żerują we wczesnym okresie życia i wolą zbierać pyłek 16,17. Chociaż mechanizmy regulacyjne leżące u podstaw percepcji smakowej są nadal niejasne, badania wykazały, że percepcja smakowa jest powiązana z wewnętrznym metabolizmem energetycznym 9, wydzielaniem hormonów 18,19 i biogenetycznymi szlakami aminowymi 20. Zarówno Vg, jak i JH są ważnymi regulatorami hormonalnymi modulującymi percepcję smakową 7,21. W laboratorium zmienność percepcji smakowej u pszczół miodnych można ocenić, testując reakcję na rozszerzenie trąbki (PER) na różne roztwory sacharozy. Każda pszczoła jest testowana poprzez dotknięcie obu czułków kroplą wody, a następnie rosnącą serią stężeń 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% sacharozy. Pozytywną reakcję obserwuje się, jeśli pszczoła całkowicie wysuwa trąbkę, gdy kropla wody lub sacharozy zostanie dotknięta do każdej anteny. Na podstawie liczby pozytywnych reakcji na roztwory można określić poziom percepcji smakowej każdej osoby 16. Zastosowanie PER nie ogranicza się jednak do pomiaru percepcji smakowej. PER jest również skuteczną metodą badania stanu metabolicznego pszczół, takiego jak sytość vs. głód. Pszczoły z większą reakcją na sacharozę są ogólnie bardziej głodne (Wang i Amdam, dane niepublikowane). Co więcej, paradygmat PER może być również stosowany w uczeniu się asocjacyjnym i pamięci u pszczół miodnych. W takim przypadku pszczoły zostaną przeszkolone, aby kojarzyć obecność wody sacharozowej z zapachem. Kiedy pszczoły uczą się skojarzenia, tylko obecność zapachu może wywołać pozytywną reakcję trąbki bez nagradzania ich sacharozą 22,23. W tym filmie pokazujemy, jak wykonać PER, aby ocenić percepcję smakową, która została połączona z podwójnym nokdaunem vg i usp w poprzednim badaniu 9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Część 1: Podwójne nokautowanie genu za pośrednictwem RNAi

1. Synteza dsRNA

  1. Zaprojektuj startery dsRNA ukierunkowane na vg, usp i gen kontrolny kodujący białko zielonej fluorescencji (GFP), którego nie ma w genomie pszczoły miodnej: startery zostały zaprojektowane przy użyciu bezpłatnego oprogramowania online Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/).
  2. Synteza dsRNA dla vg, usp i GFP: do transkrypcji in vitro użyj systemu produkcji RNA RiboMax T7 firmy Promega.
  3. Oczyszczanie dsRNA:
    1. Denaturacja i renaturacja: podgrzewać dsRNA do temperatury 85 °C przez 5 minut i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    2. Leczenie DNazą I: dodaj 1 μl DNazy I do każdej reakcji dsRNA i wymieszaj je, przesuwając probówki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Do każdej reakcji dodać 150 μl wody wolnej od nukleaz i 750 μl TRizol - LS i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę. Inkubować próbki przez 5 minut w temperaturze 30 °C.
    4. Dodać 200 μl chloroformu do każdej próbki. Mieszać energicznie przez 20 sek. Odwirowywać próbki przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
    5. Przenieść fazę sklarowaną nad osadem do każdej nowej probówki i dodać 500 μl alkoholu izopropylowego do każdej probówki. Wymieszaj je, odwracając rurkę. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze -20 °C. Odwirowywać przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
    6. Usunąć supernatant i użyć 1 000 μl 75% etanolu do przepłukania granulatu. Po odwirowaniu probówki przez 5 minut w temperaturze 7 500 x g w temperaturze 4 °C, wysuszyć na powietrzu osad dsRNA i użyć wody wolnej od nukleaz do rozpuszczenia osadu. Aby zapewnić skuteczność regulacji w dół genów, stężenie dsRNA powinno wynosić około 9 -10 μg/μl.

2. Wstrzyknięcie do brzucha dsRNA

Dla knockdownu podwójnego genu istnieją dwie strategie: 1) pojedyncze wstrzyknięcie: wymieszanie dsRNA dwóch genów i wstrzyknięcie mieszaniny; 2) wstrzyknięcie dwudniowe: pierwszego dnia wstrzyknąć pierwsze dsRNA ukierunkowane na jeden gen, a drugiego dsRNA tym samym pszczołom drugiego dnia.

  1. Nowo powstałe pszczoły schłodzić w lodówce o temperaturze 4 °C przez 1-2 minuty. Kiedy pszczoły są unieruchomione, zamontuj 3-4 pszczoły równolegle na szalkach Petriego pełnych stałego wosku z szpilkami owadów skrzyżowanymi między ich odwłokami i klatką piersiową.
  2. Ponownie schłodzić pszczoły w lodówce o temperaturze 4 °C. Upewnij się, że pszczoły są całkowicie nieruchome. Zajmuje to około 1-2 min. Pszczoły powinny wyglądać na luźne. Jeśli pszczoły stają się zwijane lub wykrzywione, oznacza to, że są zbyt długo schładzane, czego należy unikać. Zbyt duże wychłodzenie powoduje wysoką śmiertelność, ale całkowite unieruchomienie jest ważne, ponieważ każdy ruch zwiększa rozmiar rany i śmiertelność.
  3. Umieścić jednorazową igłę 30 G (BD) na mikrostrzykawce Hamiltona. Weź 3 μl dsRNA i upewnij się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza. Igła jest wprowadzana z boku brzucha, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych. Powoli naciskać tłok strzykawki, aby umożliwić wchłonięcie dsRNA. Ponieważ dsRNA jest bardzo lepkie, potrzeba 2-3 sekund, aby całkowicie wydalić go ze strzykawki. Po całkowitym wciśnięciu tłoka, należy pozostawić igłę w ranie na 4-5 sekund. Obserwuj pszczoły przez 3-5 sekund po wstrzyknięciu. Jeśli z rany wycieknie kropla hemolimfy, wyrzuć pszczołę.
  4. Użyj różnych kolorów, aby oznaczyć ich klatkę piersiową odpowiadającą różnym zabiegom. W tym momencie, jeśli zastosowano strategię pojedynczego wstrzyknięcia, pszczoły można umieścić z powrotem w kolonii po 1 godzinie obserwacji. Jeśli jednak zastosowano strategię dwudniowego wstrzykiwania, po wstrzyknięciu pierwszego dsRNA, pszczoły powinny zostać umieszczone w klatce z siatki cylindrycznej z miodem dostarczonym z boku i trzymane w inkubatorze w temperaturze 34 °C i wilgotności 80%.
  5. Drugiego dnia wykonaj kroki 2.2 i 2.3, aby schłodzić pszczoły w klatkach siatkowych i zamontować je na płytkach woskowych. Wykonaj iniekcje z drugim dsRNA, jak opisano w kroku 2.4.
  6. Pozwól pszczołom dojść do siebie w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i wprowadź je do kolonii.

Uwaga: Efekty knockdown można wykryć za pomocą ilościowego RT-PCR (qRT-PCR) i western bloting. Ogólnie rzecz biorąc, skuteczność knockdown jest różna i zależy od wielu czynników. W naszym badaniu knockdown podwójnego genu można wykryć 7 dni po pojedynczych wstrzyknięciach i dwudniowych wstrzyknięciach.

Część 2: Test odpowiedzi na przedłużenie trąby (PER)

1. Zbieranie pszczół z ula

W 6 dniu po wstrzyknięciach, zbierz leczone pszczoły z kolonii bez użycia palacza. Zbieraj pszczoły w klatkach cylindrycznych z metalowej siatki. Trzymaj 3 pszczoły w każdej klatce.

2. Montaż pszczół dla PER

Schłodź pszczoły w temperaturze 4 °C, aż zostaną całkowicie unieruchomione. Zamontuj każdą pszczołę pionowo w plastikowej rurce specjalnie zaprojektowanej dla PER. Trzymaj brzuch wewnątrz rurki za pomocą dwóch małych kawałków taśmy i utrzymuj głowę wystającą z rurki. Umieść probówki na stojaku z dwoma rzędami małych plastikowych kolumn i przypisz każdej tubie (pszczółce) numer identyfikacyjny. Następnie umieść leczone pszczoły na stojakach w inkubatorze (34 °C i 80% wilgotności) i trzymaj je w inkubatorze przez 2 godziny.

3. Przygotowanie serii roztworów wodnych z sacharozy

Przygotuj 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% i 30% roztwory sacharozy i załaduj roztwory do strzykawek z igłami 15-20 G.

4. Test PER

Dotknij anteny pszczoły kroplą 0% roztworu (wody), a następnie 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% i 30% roztworem wody sacharozowej. Najpierw przetestuj wszystkie pszczoły wodą i odczekaj co najmniej dwie minuty, ponieważ używany jest odstęp między każdym roztworem. Dlatego zwykle mamy co najmniej 20 pszczół na każdą próbę. Jeśli pszczoła całkowicie rozciągnie trąbkę, liczona jest pozytywna odpowiedź.

5. Zarządzanie danymi

Zsumuj całkowitą liczbę pozytywnych odpowiedzi dla każdej osoby dla oceny odpowiedzi smakowej (GRS). Przeprowadź odpowiednią analizę statystyczną danych.

Część 3. Walidacja knockdownu genu

Tłuste ciała są wycinane z innego zestawu 7-dniowych pszczół leczonych. Do ekstrakcji RNA stosuje się standardową procedurę TRizol, po której następuje leczenie DNazą I 24. Ekspresję genów Vg i usp analizuje się za pomocą dwuetapowego qRT-PCR. Aktyna jest używana jako gen referencyjny, ponieważ ma stabilną ekspresję w różnych tkankach pszczół miodnych. W tym eksperymencie wykorzystano opublikowane startery PCR w czasie rzeczywistym dla genu vg i usp 24. Dane są analizowane przy użyciu metody CT Delta-Delta 25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarówno strategia pojedynczego wstrzyknięcia, jak i strategia wstrzykiwań dwudniowych znacząco obniżyły poziomy transkrypcji vg (ANOVA jednoczynnikowa, p < 0,001) (Rysunek 2A) oraz usp (ANOVA jednoczynnikowa, p < 0,001) (Rysunek 2B) u pszczół miodnych sześć dni po wstrzyknięciu dsRNA. Supresja transkrypcji usp przy zastosowaniu pojedynczego wstrzyknięcia mieszaniny dsRNA oraz wstrzykiwań dwudniowych z najpierw vg, a następnie usp (vg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasze badanie jest pierwszą próbą jednoczesnego obalenia dwóch genów u dorosłych owadów. Nasze wyniki pokazują, że dwie strategie wstrzykiwań dsRNA (pojedyncze wstrzyknięcie i dwudniowe wstrzyknięcie) są skuteczne w przypadku podwójnej supresji genów, a jednoczesne wyciszanie genów vg i usp można przetestować 6 dni po wstrzyknięciu dsRNA pszczołom 8,9. Jednak skuteczność knockdownu genów różni się u różnych gatunków owadów w zależności od poziomu transkryptu genu docelowego, szybkości obrotu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Erin Fennern za pomoc w eksperymencie. Praca ta została sfinansowana przez Norweską Radę ds. Badań Naukowych (180504, 185306 i 191699), PEW Charitable Trust oraz National Institute on Aging (NIA P01 AG22500).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Koraliki GE Healthcare PCR w 96-dołkowej płytceGE Healthcare27-9557-01
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104
System produkcji RNA RiboMax T7PromegaP1300
Trizol LSInvitrogen10296028
Chloroform: alkohol izoamylowy 24:1Sigma-AldrichC0549
alkohol izopropylowySigma-AldrichI9516
Mikrostrzykawka HamiltonHamilton 80301
Jednorazowe igły 30G BDBD Biosciences305106
SacharozaSigma-Aldrich84097
Strzykawka 1 mlBD Biosciences30960
Stereoskopowy mikroskop preparacyjnyLeica MicrosystemsS6D
Szpilki do owadówFine Science Tools26000-25
Płytka
woskowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).
  2. Shi, Y. Mammalian RNAi for the masses. Trends Genet. 19, 9-12 (2003).
  3. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  4. Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif. Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).
  5. Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC Biotechnol. 3, 1(2003).
  6. Patel, A. The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development. PLoS ONE. 6, e509(2007).
  7. Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera). Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).
  8. Wang, Y., et al. Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein. PLoS Genet. 6, e1000896(2010).
  9. Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees. PLoS Genet. 8, e1002779(2012).
  10. Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos. J. Vis. Exp. (5), e215(2007).
  11. Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
  12. Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs. Electron J. Biotechnol. 19, 13(2006).
  13. Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown. Biotech. 41, 59-63 (2006).
  14. Ament, S. A., et al. The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression. PLoS Genet. 8, e1002596(2012).
  15. Amdam, G. V., Omholt, S. W. The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis. J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).
  16. Pankiw, T., Page, R. E. Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees. Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).
  17. Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality. Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).
  18. Jaycox, E. R. Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae). J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).
  19. Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic. Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).
  20. Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees. Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).
  21. Robinson, G. E. Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production. J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).
  22. Giurfa, M., Malun, D. Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees. Lear Memory. 11, 294-302 (2004).
  23. Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.). Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).
  24. Wang, Y., et al. PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals. PLoS ONE. 4, e4899(2009).
  25. Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries. J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).
  26. Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits. Nature. 439, 76-78 (2006).
  27. Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E. Hormones, Brain and Behavio. Pfaff, D., et al. , Elsevier Academic Press. (2009).
  28. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).
  29. Corona, M. juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).
  30. Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).
  31. Amdam, G. V., et al. Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees. Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).
  32. Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).
  33. Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).
  34. Hunt, G. J. Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense. Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).
  35. Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience. J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).
  36. Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Iniekcja dwuniciowego RNAtest odruchu wyci gania aparat w g bowychwyciszanie genu witellogeninywyciszanie genu ultraspiracleregulacja gen w u pszczo y miodowejanaliza w czasie rzeczywistym metod PCRtesty z u yciem roztworu sacharozyregulacja hormonu m odzie czego

Powiązane artykuły