Artykuł metodologiczny

Przygotowanie białka rekombinacji Mgm101 za pomocą strategii znakowania opartej na MBP

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50448

⸱

25 czerwca 2013

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, State University of New York Upstate Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Białko nukleoidowe mitochondrialne drożdży, Mgm101, jest białkiem rekombinacyjnym typu Rad52, które tworzy duże pierścienie oligomeryczne. Opisano protokół przygotowania rozpuszczalnego rekombinowanego Mgm101 przy użyciu strategii znakowania białka wiążącego maltozę (MBP) w połączeniu z chromatografią wymiany kationów i wykluczania wielkości.

Streszczenie

Gen MGM101 został zidentyfikowany 20 lat temu ze względu na jego rolę w utrzymaniu mitochondrialnego DNA. Badania z kilku grup sugerują, że białko Mgm101 bierze udział w rekombinacyjnej naprawie mitochondrialnego DNA. Ostatnie badania wykazały, że Mgm101 jest spokrewniony z rodziną białek rekombinacyjnych typu Rad52. Białka te tworzą duże pierścienie oligomeryczne i sprzyjają wyżarzaniu homologicznych jednoniciowych cząsteczek DNA. Jednak charakterystyka Mgm101 była utrudniona przez trudności w wytwarzaniu rekombinowanego białka. Tutaj opisano niezawodną procedurę przygotowania rekombinowanego Mgm101. Białko wiążące maltozę (MBP) Mgm101 ulega pierwszej ekspresji w Escherichia coli. Białko fuzyjne jest początkowo oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa amylozy. Po uwolnieniu przez rozszczepienie proteolityczne, Mgm101 jest oddzielany od MBP za pomocą chromatografii kationowej wymiany. Monorozproszony Mgm101 otrzymuje się następnie za pomocą chromatografii wykluczania wielkości. Wydajność ~0,87 mg Mgm101 na litr kultury bakteryjnej można rutynowo uzyskać. Rekombinowany Mgm101 ma minimalne zanieczyszczenie DNA. Przygotowane próbki są z powodzeniem wykorzystywane do analiz biochemicznych, strukturalnych i obrazowych pojedynczych cząstek Mgm101. Protokół ten może być również stosowany do przygotowania innych dużych oligomerycznych białek wiążących DNA, które mogą być nieprawidłowo sfałdowane i toksyczne dla komórek bakteryjnych.

Wprowadzenie

Rekombinacja homologiczna jest ważna dla naprawy pęknięć dwuniciowych (DSB) i międzyniciowych wiązań krzyżowych, a także dla wznowienia replikacji DNA z zapadniętych widełek replikacyjnych 1. W konwencjonalnej rekombinacji homologicznej reakcja centralna jest katalizowana przez rekombinacje zależne od ATP, w tym RecA u prokariontów oraz Rad51 i Dmc1 u eukariontów 1-3. Te rekombinazy tworzą włókna nukleoproteinowe na ssDNA, które są niezbędne do zainicjowania poszukiwania homologii i inwazji nici w dupleksowych matrycach DNA (ryc. 1, lewy panel) 4-7. Oprócz konwencjonalnego schematu, rekombinacja homologiczna może również zachodzić w sposób niezależny od RecA/Rad51 (rysunek 1, prawy panel). Na przykład drożdżowe białka Rad52 i Rad59 mogą bezpośrednio katalizować wyżarzanie komplementarnych nici ssDNA, które są odsłonięte przez resekcję pęknięć dsDNA. Ten proces rekombinacji, znany jako wyżarzanie pojedynczej nici, na ogół nie obejmuje parowania homologicznego z matrycami dsDNA. Po wyżarzaniu ogony heterologiczne są usuwane przez egzonukleazy, a nacięcia są ligowane w celu przywrócenia ciągłości genomu 8-10. Naprawie za pomocą mechanizmu wyżarzania pojedynczej nici często towarzyszą delecje sekwencji genomowych między bezpośrednio powtarzającymi się regionami.

Rad52 należy do zróżnicowanej grupy białek rekombinacyjnych, które są szeroko rozpowszechnione wśród bakteriofagów 11. Białka te są również znane jako białka wyżarzania jednoniciowego (SSAP), w oparciu o ich aktywność w promowaniu wyżarzania homologicznych jednoniciowych cząsteczek DNA. Najlepiej scharakteryzowanymi SSAP bakteriofagów są Redβ i Erf z bakteriofagów λ i P22, RecT z profaga rac i białko Sak z faga laktokokowego ul36. SSAP są strukturalnie charakteryzowane typowym fałdowaniem β-β-β-α, chociaż podobieństwo jest praktycznie niewykrywalne w ich pierwotnych sekwencjach. Wszystkie one tworzą duże pierścienie homooligomeryczne o 10-14-krotnej symetrii in vitro 12-14. Funkcjonalne implikacje tej charakterystycznej organizacji strukturalnej wyższego rzędu nie są dobrze poznane.

Jesteśmy zainteresowani zrozumieniem mechanizmu rekombinacji homologicznej w genomie mitochondrialnym. Wcześniej zidentyfikowaliśmy gen MGM101, który jest niezbędny do utrzymania mtDNA w Saccharomyces cerevisiae 15. Następnie stwierdzono, że MGM101 jest związany z nukleoidami mitochondrialnymi i jest wymagany do tolerancji mtDNA na czynniki uszkadzające DNA 16. Jednak badania nad Mgm101 zostały wstrzymane w ostatniej dekadzie ze względu na trudności w produkcji rekombinowanego Mgm101. Ostatnio udało nam się wyprodukować rozpuszczalny Mgm101 w dużych ilościach z E. coli przy użyciu strategii fuzji MBP. Umożliwiło nam to wykazanie, że Mgm101 ma biochemiczne i strukturalne podobieństwa z rodziną białek Rad52 17,18. W niniejszym raporcie opisano trzyetapową procedurę oczyszczania, w wyniku której powstaje jednorodny Mgm101 do analiz biochemicznych i strukturalnych (rysunek 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poprzednie badania wykazały, że pierwsze aminokońcowe reszty 22 Mgm101 są rozszczepiane po imporcie do mitochondriów 19. W przypadku ekspresji w Escherichia coli, otwarta ramka odczytu MGM101 pozbawiona pierwszych 22 kodonów jest amplifikowana przez PCR i umieszczana za sekwencją malE kodującą białko wiążące maltozę (MBP) w zmodyfikowanej wersji wektora ekspresyjnego pMAL-c2E. W ten sposób powstaje fuzja MBP-Mgm101 z łącznikiem zawierającym miejsce rozszczepienia proteazy PreScission (ryc. 3). Plazmid jest najpierw konstruowany przez selekcję transformantów E. coli bez selekcji IPTG i Xgal niebiesko-białej. Powstały plazmid pMAL-c2E-MGM101 jest następnie wprowadzany do szczepu E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL poprzez wybór kolonii odpornych na ampicylinę i chloramfenikol.

1. Ekspresja, indukcja, liza komórek i leczenie DNazą I

  1. Zaszczepić świeże transformanty w 10 ml pożywki LB (1% tryptonu bakto, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 1% NaCl) uzupełnionego glukozą (0,2%), ampicyliną (100 μg/ml) i chloramfenikolem (50 μg/ml). Inkubować w temperaturze 37 °C O/N z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
  2. Zaszczepić 10 ml kultury wstępnej w 2 litrach uzupełnionej pożywki LB, jak powyżej. Hodować komórki w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, aż OD600 osiągnie 0,5.
  3. Indukować ekspresję białka fuzyjnego MBP-Mgm101 przez dodanie izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) w końcowym stężeniu 0,3 mM. Hodować komórki, wytrząsając w temperaturze 30 °C przez 5 godzin.
  4. Zebrać komórki przez odwirowanie za pomocą rotora Beckman JA-10 (5 500 x g, 4 °C, 10 min). Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 30 ml buforu do lizy (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 i 1 mM EDTA, pH 7,4) zawierającego inhibitory proteazy (25 μM leupeptyny, 1 μM pepstatyny A i 1 mM PMSF).
  5. Sonikować zawiesinę komórek na lodzie przez 20 sekund za pomocą procesora ultradźwiękowego (Heat Systems; Model W-385) w 50% cyklu pracy, pozostaw do ostygnięcia na lodzie przez 30 sekund i powtórz 2x.
  6. Dodać 1 ml DNAzy 1 bulionu o stężeniu 2 mg/ml. Lizat komórkowy rozdrabniać w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
  7. Dostosuj NaCl do końcowego stężenia 500 mM.
  8. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.

2. Oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa amylozowego

  1. Zrównoważyć 1,5 ml żywicy amylozy (50% zawiesiny) w buforze do lizy. Dodaj zrównoważoną żywicę amylozy do lizatu komórkowego. Kołysz delikatnie w temperaturze 4 °C O/N.
  2. Załaduj mieszaninę lizatu i żywicy na kolumnę chromatografii ekonomiczno-kolumnowej zainstalowaną w chłodni. Pozwól, aby niezwiązane białka przeszły przez kolumnę grawitacyjnie.
  3. Przemyć żywicę amylozy 300 ml buforu do przemywania I (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 400 mM NaCl; 1 mM EDTA, pH 7,4; i 0,2 mM PMSF).
  4. Powtórzyć płukanie ze 150 ml buforu do przemywania II (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4; i 0,2 mM PMSF).
  5. Dodać 5 ml buforu elucyjnego (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 200 mM NaCl; 1 mM EDTA, pH 7,4; i 0,2 mM PMSF, 10 mM maltozy) do kolumny, inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut, zebrać eluat i powtórzyć jeszcze jeden raz.
  6. Połączyć eluaty, określić wydajność i czystość MBP-Mgm101, ładując podwielokrotność eluatu na żel SDS-PAGE, a następnie wybarwiając coomassie (ryc. 4).

3. Chromatografia proteazy proteazy przed rozcięciem i chromatografia kationowymienna

  1. Dodać 50 jednostek proteazy PreScission do eluatu MBP-Mgm101. Przeprowadzić rozszczepienie w temperaturze 4 °C O/N i pozostawić do kontynuowania podczas dializy w stosunku do buforu dializacyjnego (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 100 mM NaCl; 2 mM DTT; 1 mM EDTA, pH 7,4; i 0,2 mM PMSF)
  2. Sprawdź skuteczność dekoltu na żelu SDS-PAGE (Rysunek 5A).
  3. Załaduj rozszczepiony MBP-Mgm101 przez wielokrotne wstrzyknięcia do wkładu Bio-Scale Mini Macro-Prep High S podłączonego do systemu Bio-Rad Biologic DuoFlow FPLC.
  4. Rozpocznij chromatografię kationitową, stosując krokowy gradient soli o stężeniu 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM i 1000 mM NaCl, który powstaje przez zmieszanie buforu A (5 mM NaCl; 10 mM Na-fosforanu, pH 7,2; 1 mM PMSF) i buforu B (1 M NaCl; 10 mM Na-fosforan, pH 7,2; 1 mM PMSF). Ustawić natężenie przepływu na 0,5 ml/min. Zbierz frakcję Mgm101 i sprawdź czystość białka na żelu SDS-PAGE (rysunek 5B).

4. Chromatografia wykluczająca rozmiar

  1. Połączyć frakcje białkowe z chromatografii kationowymiennej. Dializować białko w buforze równowagi GF (20 mM MOPS, pH 7,0; 150 mM NaCl; 1mM EDTA, pH 7,4; 5 mM 2-merkaptoetanol; 0,2 mM PMSF).
  2. Zagęścić białko za pomocą ultrafiltracyjnej kolumny wirowej VIVASPIN 15R, aby zmniejszyć objętość do ~1 ml poprzez wirowanie w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C.
  3. Załadować Mgm101 na skalibrowaną kolumnę klasy przygotowawczej Superose 6 zrównoważoną buforem chromatograficznym (20 mM MOPS, pH 7,0; 150 mM NaCl; 5 mM β-merkaptoetanolu; 1 mM EDTA, pH 7,4; 0,2 mM PMSF).
  4. Wykluczenie wielkości należy rozpocząć od buforu chromatograficznego przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min.
  5. Zbierz frakcje oczyszczonych pików Mgm101. Załaduj porcje frakcji na 12% SDS-PAGE w celu sprawdzenia końcowej jakości białka.
  6. Zagęścić białko za pomocą VIVASPIN 6, a następnie szybko zamrozić próbki w cieczy N2 i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  7. Użyj próbek Mgm101 w ciągu 6-12 miesięcy do testu wiązania ssDNA (ryc. 8) oraz do wizualizacji strukturalnej za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (ryc. 9).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mgm101 jest mitochondrialnym białkiem rekombinacyjnym spokrewnionym z Rad52. Rola Rad52 w rekombinacji mitochondrialnego DNA została szczegółowo opisana (Rysunek 1). Rekombinowane białko Mgm101 można przygotować za pomocą trzystopniowej procedury (Rysunek 2). Proces ten jest ułatwiony dzięki zastosowaniu strategii znakowania MBP, która pozwala na ekspresję Mgm101 w formie rozpuszczalnej, a następnie na oddzielenie białka od znacznika poprzez cięcie proteolityczne (Rysunek 3

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wyzwaniem było wyprodukowanie stabilnego, natywnego rekombinowanego białka Mgm101 z E. coli, prawdopodobnie ze względu na jego nierozpuszczalność w komórkach bakteryjnych. W tym raporcie pokazujemy, że strategia fuzji MBP pozwala na ekspresję białka na dość wysokim poziomie. Stosując mikroskopię elektronową transmisyjną barwienia ujemnego i chromatografię wykluczania wielkości, wykazaliśmy wcześniej, że białko fuzyjne MBP tworzy jednolite oligomery in vitro 18. Możliwe jest, że fałdowanie i o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Stephanowi Wilkensowi za pomoc w transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health Grant R01AG023731.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wektor ekspresji pMAL-c2ENew England Biolabs#N8066S
PreScission ProteaseGE Healthcare Life Sciences#27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cellsStrategen#230245
LeupeptinRoche Applied Science#11034626001
PepstatinRoche Applied Science#11359053001
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Roche Applied Science#10837091001
DNAzySigma#DN25-1G
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Roche Applied Science#11411446001
Żywica amylozowaNew England Biolabs#E8021L
Kolumnachromatografii ekonomiczno-kolumnowejBIO-RAD#7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S kartridże (1 ml)BIO-RAD#732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltracyjna kolumna wirowa (10 000 MWCO)Sartorius Stedium#VS15RH02
Kolumna przygotowawcza Superose 6Amersham Bioscirnces#17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltracyjna kolumna wirowa (5,000 MWCO)Sartorius Stedium
#VS0611

Bibliografia

  1. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
  2. Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
  3. Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
  4. Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
  5. Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
  6. Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
  7. Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
  8. Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetics. 153, 1117-1130 (1999).
  9. Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
  10. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
  11. Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
  12. Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
  13. Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
  14. Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
  15. Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
  16. Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
  17. Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
  18. Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
  19. Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
  20. Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
  21. Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bia ko Mgm101znakowanie MBPchromatografia powinowactwa do amylozykationowa chromatografia wymiany jonowejchromatografia elowaoczyszczanie bia ek rekombinowanychnaprawa mitochondrialnego DNAwi zanie oligomerycznego DNAwi zanie jednoniciowego DNAtransmisyjna mikroskopia elektronowa

Powiązane artykuły