Artykuł metodologiczny

Multimodalne obrazowanie 4D zakażeń Citrobacter rodentium u myszy

13.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50450

⸱

13 sierpnia 2013

 ,  ,  ,  , 
1MRC Centre for Molecular Bacteriology and Infection, Division of Cell & Molecular Biology, Imperial College London, 2Preclinical Imaging, Caliper- A PerkinElmer Company

W tym artykule

Podsumowanie

Obrazowanie multimodalne jest cennym podejściem do badania kolonizacji bakteryjnej w małych modelach zwierzęcych. Protokół ten przedstawia zakażenie myszy bioluminescencyjnym Citrobacter rodentium i podłużne monitorowanie kolonizacji bakteryjnej za pomocą kompozytowej tomografii obrazowania 3D w świetle rozproszonym z obrazowaniem μCT w celu stworzenia filmu 4D infekcji C. rodentium.

Streszczenie

Ten protokół przedstawia kroki wymagane do długotrwałego monitorowania bioluminescencyjnej infekcji bakteryjnej za pomocą kompozytowej tomografii 3D w świetle rozproszonym ze zintegrowanym μCT (DLIT-μCT) i późniejszego wykorzystania tych danych do wygenerowania czterowymiarowego (4D) filmu cyklu infekcji. Aby opracować filmy o infekcjach 4D i zwalidować obrazowanie DLIT-μCT do badań nad infekcjami bakteryjnymi za pomocą tomografii komputerowej IVIS Spectrum, zastosowaliśmy zakażenie bioluminescencyjnym C. rodentium, które powoduje samoograniczające się zapalenie jelita grubego u myszy. W tym protokole przedstawiamy zakażenie myszy bioluminescencyjnym C. rodentium i nieinwazyjne monitorowanie kolonizacji za pomocą codziennego obrazowania DLIT-μCT i liczenia bakterii z kału przez 8 dni.

Użycie IVIS Spectrum CT ułatwia bezproblemową korejestrację skanów optycznych i μCT przy użyciu jednej platformy obrazowania. Metoda μCT o niskiej dawce umożliwia obrazowanie myszy w wielu punktach czasowych podczas infekcji, zapewniając szczegółową anatomiczną lokalizację bioluminescencyjnych ognisk bakteryjnych w 3D bez powodowania artefaktów z powodu skumulowanego promieniowania. Co ważne, filmy 4D z zakażonymi myszami stanowią potężne narzędzie analityczne do monitorowania dynamiki kolonizacji bakteryjnej in vivo.

Wprowadzenie

Małe modele zwierzęce, w szczególności te wykorzystujące myszy, są rutynowo używane do badania patogenezy bakteryjnej lub testowania strategii interwencji w przypadku infekcji, takich jak antybiotyki, probiotyki, prebiotyki i szczepionki1-7. Głównymi odczytami doświadczalnymi z zakażeń małych zwierząt są obciążenie patogenem, przestrzenna i czasowa lokalizacja infekcji oraz zmiany w odpowiedzi immunologicznej zakażonego organizmu. Obrazowanie optyczne in vivo jest cennym narzędziem do badań nad chorobami zakaźnymi i może być wykorzystywane do monitorowania wielu odczytów eksperymentalnych poprzez wykorzystanie genów reporterowych (lucyferazy, białek fluorescencyjnych, beta-laktamazy itp.), barwników fluorescencyjnych, nanocząstek lub sond chemiluminescencyjnych ukierunkowanych na białko, proces biologiczny lub mikroorganizm6.

Obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) to metoda obrazowania optycznego używana do monitorowania kolonizacji małych zwierząt, takich jak myszy i szczury, przez bakterie chorobotwórcze3,6,8,9. Myszy są zakażone rekombinowanymi bakteriami wyrażającymi lucyferazy, takimi jak operon luxCDABE z Photorhabdus luminescens. Bakterie te można następnie wykryć poprzez wytwarzanie światła za pomocą systemu obrazowania in vivo opartego na CCD3,6,9. Co ważne, tylko metabolicznie aktywne mikroorganizmy są bioluminescencyjne (BL), co oznacza, że za pomocą tej metodologii wykrywane są tylko żywotne komórki bakteryjne 10,11. Korzystając z 2D BLI, lokalizacja źródła BL jest wnioskowana na podstawie powierzchni zwierzęcia, w którym emitowany jest sygnał8. Dokładna lokalizacja anatomiczna ognisk BL in vivo musi zostać określona poprzez analizę ex vivo narządów3,6,9 W przeciwieństwie do tego, kompozytowa tomografia obrazowania 3D w świetle rozproszonym (DLIT) może być wykorzystana do skompilowania ilościowej rekonstrukcji 3D źródła BL12. DLIT jest wykonywany poprzez zbieranie obrazów BL wykonanych przy użyciu zdefiniowanych wąskopasmowych filtrów optycznych, a następnie wprowadzanie ich do algorytmu rekonstrukcji 3D rozproszonej tomografii optycznej1,7,12,13.

Obecnie, obrazowanie multimodalne jest jedyną dostępną metodologią, która pozwala uzyskać prawdziwą nieinwazyjną anatomiczną lokalizację ognisk bioluminescencyjnych in vivo bez potrzeby analizy ex vivo. Ostatnio zastosowaliśmy kombinację DLIT zarejestrowanego jednocześnie z obrazowaniem μCT w celu oceny dynamiki kolonizacji Citrobacter rodentium (C. rodentium) po profilaktycznym leczeniu bakterią probiotyczną7. C. rodentium jest mysim patogenem jelitowym stosowanym do modelowania zakażenia człowieka enteropatogennym i enterkrwotocznym Escherichia coli14. Zakażenie C. rodentium powoduje zapalenie jelita grubego, zwykle związane z łagodną utratą masy ciała, biegunką, spolaryzowaną odpowiedzią immunologiczną Th1 i wyraźnymi zmianami patologicznymi, w tym przerostem krypty okrężnicy oraz przyczepianiem i zacieraniem zmian14. Ponadto patogeneza C. rodentium została dokładnie przebadana przy użyciu BLI, a jej dynamika kolonizacji u myszy C57BL/6J jest dobrze udokumentowana, co czyni tę bakterię idealnym mikroorganizmem modelowym do stosowania w obrazowaniu multimodalnym3,4,7.

Ten protokół jest pierwszym, który przedstawia metodologię zintegrowanego obrazowania DLIT-μCT infekcji bakteryjnej przy użyciu pojedynczej platformy obrazowania multimodalności, IVIS Spectrum CT, oraz generowania filmu 4D pokazującego prawdziwą dynamikę tej infekcji w sposób nieinwazyjny.

Protokół

1. Przygotowanie myszy

  1. Kup lub wyhoduj wystarczającą ilość 18-20 g myszy C57BL/6J wymaganych do badania.
  2. Jeśli myszy są kupowane od zewnętrznego dostawcy, po przetransportowaniu do placówki należy je przyzwyczaić do stosowania przez 1 tydzień na autoklawowanej żywności i wodzie, aby ustabilizować mikrobiotę jelitową.
  3. Zważ, naciąć uszy i oddzielić wymaganą liczbę myszy w klatce.
  4. Dzień przed zakażeniem, przed wykonaniem znieczulenia, należy sprawdzić, czy jest wystarczająca ilość tlenu i izofluranu na czas trwania zabiegu. W razie potrzeby dodaj więcej izofluoranu lub wymień butlę z tlenem. Następnie sprawdź wagę zmiataczy znieczulających, jeśli przybrały na wadze więcej niż 50 g od pierwszego użycia, wyrzuć je i zastąp świeżymi zmiataczami.
  5. Znieczulenie myszy za pomocą 3% izofluoranu w systemie anestezjologicznym XGI-8 i depilacja za pomocą VEET przez 7 minut.
  6. Notatki:
    • Dokładna depilacja jest niezbędna, szczególnie u czarnych myszy, ponieważ melanina w sierści znacznie osłabia sygnał bioluminescencyjny3,15.
    • Depilacja myszy trwa zwykle 8-10 dni, zanim futro zacznie odrastać. Aby wykonać obrazowanie multimodalne 4D przez dłuższy czas, w razie potrzeby należy depilować myszy, tak aby obszar zainteresowania był nagi podczas sesji obrazowania.
    • Myszy są trzymane w obiekcie zabezpieczającym poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).

2. Przygotowanie komórek bakteryjnych

  1. Przygotować wystarczającą ilość bulionu Luria Burtani i płytek agarowych uzupełnionych Kanamycyną [50 μg ml-1] wymaganych do badania i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie to wymagane.
  2. Dzień przed zakażeniem rozmrozić kriowial szczepu C. rodentium ICC180 i natychmiast dodać jeden kriobead do 15 ml bulionu LB uzupełnionego kanamycyną [50 μg ml-1] i hodować przez noc w temperaturze 220 obr./min, 37 °C. Jako kontrolę zanieczyszczenia pożywki należy przygotować dodatkowe niezaszczepione 15 ml bulionu LB uzupełnionego Kanamycyną [50 μg ml-1] i kulturę w temperaturze 220 obr./min, 37 °C.
  3. Następnego ranka (~16 godzin) sprawdź pożywkę kontrolną pod kątem zmętnienia jako oznaki rozwoju bakterii. Jeśli kontrola jest czysta, przenieś kulturę ICC180 do probówki Falcon i odwiruj z prędkością 4,000 obr./min. Następnie umyj osad bakteryjny w PBS. Następnie ponownie zamieszać w 1,5 ml PBS (1/10 pierwotnej objętości LB uzupełnionej Kanamycyną) i dokładnie wymieszać, aby utworzyć inokulum bakteryjne.
  4. Aby sprawdzić, czy ICC180 został prawidłowo wyhodowany i jest bioluminescencyjny przed zakażeniem myszy, zobrazuj inokulum w IVIS Spectrum CT za pomocą BLI i ustawienia automatycznego w kreatorze Living Image 4.3.1, jak opisano wcześniej1.
    nuta:
    • Szczep ICC180 jest bioluminescencyjną pochodną dzikiego typu C. rodentium ICC1692. Ten szczep bakteryjny ma operon luxCDABE, w tym gen oporności na kanamycynę wstawiony do pseudogenu ksylE w chromosomie2.
    • Wszystkie hodowle bakterii należy przeprowadzić przy użyciu standardowych technik aseptycznych i, jeśli to konieczne, przed użyciem zakupić sterylne materiały eksploatacyjne/odczynniki lub autoklaw.
    • W kroku 2.4 odczyt bioluminescencji (p/s/cm2/sr) można wykorzystać do oszacowania liczby bakterii przed zakażeniem myszy.

3. Zakażenie myszy bioluminescencyjnym C. rodentium i ocena kolonizacji bakteryjnej

  1. Przed zakażeniem należy sprawdzić, czy jest wystarczająca ilość tlenu i izofluranu na czas trwania zabiegu. W razie potrzeby dodaj więcej izofluoranu lub wymień butlę z tlenem. Następnie sprawdź wagę zmiataczy znieczulających, jeśli przybrały na wadze więcej niż 50 g od pierwszego użycia, wyrzuć je i zastąp świeżymi zmiataczami.
  2. Znieczulenie myszy 3% izofluoranem za pomocą systemu anestezjologicznego XGI-8 w celu zapewnienia humanitarnego ograniczenia.
  3. Dokładnie wymieszać inokulum bakteryjne i pobrać 0,2 ml (około 5 x 109 jtk ICC180) do strzykawki.
  4. Usuwaj myszy z systemu anestezjologicznego pojedynczo i szoruj je, mocno chwytając skórę za szyją kciukiem i palcem wskazującym.
  5. Wepchnij igłębkę w kierunku podniebienia, przez język i w dół przełyku i wstrzyknij inokulum bakteryjne do żołądka.
    6. Po doustnym
  6. głębniku myszy monitoruj ich chód i oddech pod kątem oznak niepokoju, które mogą być oznaką, że inokulum bakteryjne zostało dostarczone do płuc. Poddaj eutanazji wszystkie myszy, które zostały zaszczepione w płucach.
  7. Zgłębnik niezakażonych myszy z 200 μl PBS jako kontrolą nośnika, jak opisano w krokach 3.1-3.6.
  8. Aby potwierdzić, że zgłębnik jamy ustnej został wykonany prawidłowo, należy zobrazować zakażone i pozorowane zakażone myszy w IVIS Spectrum CT za pomocą BLI i ustawienia automatycznego w kreatorze Living Image 4.3.1, jak opisano wcześniej1.
  9. Określić liczbę żywotnych bakterii w inokulum przez seryjne rozcieńczenie w PBS i plamienie w trzech egzemplarzach na agarze LB uzupełnionym kanamycyną [50 μg ml-1].
  10. Obliczyć liczbę ICC180 jtk/ml, znajdując rozcieńczenie, w którym znajduje się około 5-50 kolonii, i policz liczbę kolonii z każdego miejsca w tym rozcieńczeniu i zapisz rozcieńczenie, na którym policzono kolonie. Następnie należy obliczyć średnią liczbę jtk (z trzech plamek) i pomnożyć tę wartość przez współczynnik rozcieńczenia 50 (każda plamka to 20 μl pierwotnej próbki o objętości 1 ml) i rozcieńczenie, na którym policzono kolonie, dając jtk/ml.
  11. Codziennie monitoruj kolonizację myszy, zbierając kał od każdej myszy do wstępnie zważonej probówki Eppendorfa (zważonej na drobnej wadze) i rozcieńcz 1/10 w PBS w zależności od masy próbki (0,1 g ml-1).
  12. Określić liczbę żywotnych bakterii w kale przez seryjne rozcieńczenie w PBS i plamienie w trzech egzemplarzach na agarze LB uzupełnionym kanamycyną [50 μg ml-1].
  13. Obliczyć liczbę żywotnych bakterii na gram kału, postępując zgodnie z krokiem 3.9, a następnie pomnożyć liczbę jtk/ml przez współczynnik rozcieńczenia kału w PBS (krok 3.10) wynoszący 0,1 g ml-1, aby uzyskać jtk/g.
  14. Ustalenie, że myszy zostały zaszczepione czystą kulturą ICC180 i że wszystkie kolonie są bioluminescencyjne. Weź płytki agarowe z kroku 3.8, oceń morfologię kolonii bakteryjnej na oko lub wybierz reprezentatywną kolonię z płytki i przeanalizuj za pomocą mikroskopii świetlnej. W razie potrzeby identyfikację bakterii można przeprowadzić za pomocą PCR kolonii specyficznej dla szczepu w celu oceny czystości hodowli. Następnie zobrazuj płytki w IVIS Spectrum CT za pomocą BLI zgodnie z opisem w kroku 3.7 i sprawdź, czy 100% kolonii na płytce jest bioluminescencyjnych.
    Notatki:
    • W kroku 3.4, podczas wprowadzania igły do zgłębnika, jeśli odczuwasz opór, nie wciskaj igły do zgłębnika na siłę, ponieważ powoduje to, że inokulum dostaje się do płuc. Zamiast tego ponownie włóż igłę i delikatnie spróbuj ponownie.
    • Krok 3.1 jest opcjonalny, a myszy mogą być poddawane doustnemu podawaniu bez znieczulenia, w zależności od polityki instytutu w zakresie dobrostanu zwierząt.
    • Stolce muszą być wysiane w dniu ich pobrania. C. rodentium będzie rosło nawet po pozostawieniu w temperaturze 4 °C przez noc w PBS i spowoduje nieprawidłowe oznaczanie ilościowe stolca jtk/g.

4. Codzienna tomografia obrazowania 3D w świetle rozproszonym z obrazowaniem μCT (DLIT- μCT) zakażonych myszy

Względy dotyczące dobrostanu zwierząt: DLIT-μCT obejmuje obrazowanie optyczne DLIT zintegrowane z szybkim skanem μCT o niskiej dawce promieniowania (~23 mGY dla skanu dwóch myszy, ~53 mGY dla pojedynczego skanu myszy) unieruchomionego zwierzęcia. Dawka ta kumuluje się z każdą sesją obrazowania, więc celem jest utrzymanie dawki na jak najniższym poziomie (i zawsze znacznie poniżej LD50/30) przy jednoczesnym zakończeniu badania. W niektórych przypadkach, jeśli nie ma oznak infekcji w konwencjonalnym badaniu BLI myszy, można uniknąć skanowania μCT, aby jeszcze bardziej zminimalizować dawkę. Mimo że dawka jest utrzymywana na jak najniższym poziomie, w długotrwałych badaniach, jeśli istnieje jakakolwiek obawa dotycząca narażenia na promieniowanie, myszy zostaną wyeliminowane przy pierwszych oznakach szkodliwych objawów lub pod koniec okresu obrazowania μCT.

  1. Przed przystąpieniem do obrazowania należy zainicjować IVIS Spectrum CT i sprawdzić, czy blokady bezpieczeństwa rentgenowskiego działają i czy podgrzewany stage ma odpowiednią temperaturę (37 °C) do obrazowania. Następnie sprawdź poziom izoflouranu w układzie anestezjologicznym i wagę zmiataczy anestezjologicznych. W razie potrzeby dodaj więcej izofluoranu, a jeśli padlinożercy przybrali więcej niż 50 g od pierwszego użycia, wyrzuć je i zastąp świeżymi padlinożercami.
  2. Skonfiguruj tomografię komputerową widma w taki sposób, aby parametry obrazowania, które uruchamiają funkcję automatycznej ekspozycji w programie Living Image 4.3.1, były zoptymalizowane pod kątem obrazowania lucyferazy bakteryjnej. Wybierz opcję Edytuj > preferencje > oknie Rejestracja i automatyczna ekspozycja. Następnie wybierz > Wartości zakresu > Czas wygaśnięcia (sekundy) i ustaw > Max. na 300s. Na koniec wybierz > Target Count (minimum) > Luminescent i ustaw na 10 000 zliczeń.
  3. Włóż jedną platformę obrazowania myszy do tomografii komputerowej Spectrum i podłącz ją do znieczulenia.
  4. Włączyć rentgenowską blokadę bezpieczeństwa i zainicjować IVIS.
  5. Po zainicjowaniu IVIS Spectrum CT należy znieczulić myszy 3% izofluoranem za pomocą systemu anestezjologicznego XGI-8, aby zapewnić humanitarne ograniczenie.
  6. Aby ustalić, czy konieczne jest wykonanie skanu DLIT-μCT, należy wstępnie zobrazować myszy za pomocą BLI, jak opisano wcześniej1, na jednej platformie obrazowania myszy. Jeśli uzyskany zostanie solidny sygnał, mysz nadaje się do obrazowania DLIT. Znieczuloną mysz należy pozostawić w jednej platformie obrazowania myszy po skanowaniu BLI w stanie gotowym do DLIT-μCT.
  7. Użyj Kreatora obrazowania w oprogramowaniu Living Image 4.3.1, aby skonfigurować skanowanie DLIT-μCT. Kreator obrazowania automatycznie określa pole widzenia, czas ekspozycji, przysłonę i grupowanie dla DLIT i pola widzenia, czas ekspozycji, zestawy filtrów i kategoryzację dla obrazowania μCT, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu. Po wyświetleniu monitu przez Kreatora obrazowania uwzględnij tylko filtry emisji 560, 580, 600 i 620 nm i wybierz skan μCT dla jednej myszy. Następnie kliknij przycisk > Pobierz, aby rozpocząć obrazowanie.
  8. Po obrazowaniu należy umieścić znieczuloną mysz z powrotem w klatce, usunąć jedną platformę do obrazowania myszy z tomografii komputerowej Spectrum i zdezynfekować za pomocą 1% Tri-genu. W razie potrzeby wymień piankową podkładkę, na której umieszczona jest mysz, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego między myszami.
  9. Obrazowanie myszy codziennie do 8 dnia po infekcji (PI) za pomocą DLIT-μCT, zgodnie z opisem w krokach 4.1-4.8, w celu wygenerowania danych obrazowania podłużnego wymaganych do stworzenia filmu 4D infekcji.
    nuta:
    • W kroku 4.7 zalecamy użycie filtrów emisyjnych 560-620 nm do obrazowania bioluminescencji bakterii. Chociaż szczyt bioluminescencji bakteryjnej wynosi około 485 nm, ze względu na optykę tkankową (znaczne tłumienie niebieskich/zielonych fotonów przez tkankę mysią), ważne jest, aby używać pomarańczowych/czerwonych fotonów do rekonstrukcji 3D, ponieważ ułatwiają one obliczanie głębokości sygnału.
    • Ustawienia "automatycznej" ekspozycji w Living Image 4.3.1 dla DLIT muszą zostać dostosowane, aby zoptymalizować ilość przechwytywanych fotonów i maksymalny czas obrazowania używany dla każdego zestawu filtrów.
    • Wykonanie wstępnego obrazowania BLI opisanego w kroku 4.6 jest konieczne tylko wtedy, gdy badacz nie jest pewien, czy istnieje wykrywalny sygnał bioluminescencyjny, na przykład podczas korzystania z nowego modelu infekcji.

5. 3D Rekonstrukcja danych obrazowania DLIT- μCT

  1. Otwórz oprogramowanie Living Image 4.3.1 i wybierz opcję > Browse (Przeglądaj), a następnie otwórz folder zawierający pliki DLIT-μCT.
  2. Otwórz plik DLIT-μCT w przeglądarce Living Image Browser, na przykład C. rodentium Day 1 P.I., klikając przycisk Load (Załaduj).
  3. Na palecie narzędzi wybierz > Topografia powierzchni > myszy Nago, dostosuj próg, a następnie kliknij przycisk > Generuj powierzchnię. Jeśli rekonstrukcja powierzchni zakończy się pomyślnie, w oknie widoku 3D zostanie wyświetlony obrys powierzchni.
  4. Aby wyświetlić renderowany skan μCT w oknie Widok 3D, ukryj kontur powierzchni (kliknij >> narzędzia optyczne 3D i usuń zaznaczenie opcji Wyświetl obiekt powierzchni) lub zmniejsz krycie powierzchni (kliknij > Narzędzia optyczne 3D i dostosuj suwak > krycia).
  5. Aby zapewnić szczegółową lokalizację anatomiczną rekonstrukcji 3D DLIT, konieczna jest zmiana danych wolumetrycznych 3D (skan μCT) tak, aby widoczny był tylko szkielet myszy i aby miał optymalny kontrast. Kliknij > Narzędzia multimodalności 3D i wybierz > Histogram logarytmiczny, Oświetlenie gradientowe, Jakość i Odszumianie. Na koniec przesuń suwak Histogram w prawo i obserwuj, jak dane wolumetryczne 3D zmieniają kontrast. Kontynuuj dostosowywanie danych, aż tylko kości będą wyraźnie widoczne. W razie potrzeby zmień kolor punktów funkcji przenoszenia na histogramie.
  6. Następnie wybierz > DLIT 3D Reconstruction w palecie narzędzi i upewnij się, że wybrano tylko zestawy filtrów 560, 580, 600 i 620 nm, które są wymagane do obrazowania lucyferazy bakteryjnej in vivo. Kliknij przycisk > Start. Pojawi się teraz menu podglądu danych pokazujące spektralnie filtrowane sygnały BL z myszy, która została zobrazowana w 2D. Sygnały te są automatycznie progowane przez oprogramowanie, ale w razie potrzeby można je dostosować ręcznie za pomocą zakładek na dole menu. Próg określa minimalne natężenie danych (reprezentowane jako procent maksymalnego sygnału na obrazie), które zostaną uwzględnione jako dane w rekonstrukcji.
  7. Następnie wybierz > DLIT 3D Reconstruction w Tool Palette (Paleta narzędzi) i sprawdź, czy właściwości optyczne użyte do rekonstrukcji DLIT są poprawne. Wybierz kartę Właściwości > i upewnij się, że ustawienia Właściwości tkanki są ustawione na Tkanka myszy, a Widmo źródłowe jest ustawione na Bakterie.
  8. Kliknij > Reconstruct (Rekonstrukcja), aby przeprowadzić rekonstrukcję DLIT.
  9. Aby wygenerować film 3D DLIT-μCT, kliknij > Narzędzia > animacji 3D i wybierz > Preset Animations > CCW Y-axis i > Całkowity czas trwania > 10 s (25 klatek na sekundę). Po prawidłowym ustawieniu animacji 3D naciśnij przycisk Nagraj i zapisz > rekonstrukcje 3D DLIT-μCT jako pliki .avi oznaczone jako eksperyment, grupa i punkt czasowy w osobnym folderze.
    >nuta:
    • Podczas wykonywania rekonstrukcji 3D danych DLIT-μCT ważne jest, aby korzystać z komputera z zainstalowanym programem Living Image 4.3.1 i pakietem serwisowym 1 oraz aby komputer był wyposażony w kartę graficzną odpowiednią do uruchomienia oprogramowania do obrazowania multimodalnego. To oprogramowanie można pobrać, a specyfikacje GPU są zawarte w informacjach o wydaniu (http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm ).
    • Jeśli rekonstrukcje DLIT-μCT 3D pojawiają się wstecz po zapisaniu komputera, na komputerze działa stara wersja sterownika karty graficznej i można to naprawić, pobierając aktualizację ze strony internetowej producenta.
    • W kroku 5 przedstawiamy preferowane przez nas ustawienia generowania rekonstrukcji 3D DLIT-ΜCT. Istnieje jednak wiele punktów podczas rekonstrukcji 3D, w których parametry, które nie są omówione w tym protokole, mogą być modyfikowane. Kompleksowy przewodnik po rekonstrukcjach 3D przy użyciu Living Image 4.3.1 można znaleźć w instrukcji obsługi producenta.
    • Ważne jest, aby tworzyć rekonstrukcje 3D przy użyciu identycznych ustawień w narzędziu do obrazowania multimodalnego, aby można je było porównać. Oprócz tego, podczas tworzenia rekonstrukcji 3D DLIT-μCT, ważne jest, aby tworzyć filmy przy użyciu tej samej liczby klatek na sekundę i całkowitego czasu trwania (długości), w przeciwnym razie czas wideo 4D nie jest jednorodny.

6. Generowanie filmu 4D o zakażeniu C. rodentium

  1. Wyraźnie oznacz wszystkie rekonstrukcje 3D DLIT-μCT odpowiednim eksperymentem, punktem czasowym i grupą w łatwo dostępnym folderze.
  2. Utwórz nowy plik w programie Windows Live Movie Maker i wstaw rekonstrukcje DLIT-μCT w porządku chronologicznym od dnia 1 P.I., korzystając z zakładki narzędzia z folderu przygotowanego w kroku 6.1.
  3. Dodaj napisy na początku każdego filmu opisującego punkt czasowy, na przykład Dzień 1 P.I., wybierając odpowiedni film DLIT-μCT, a następnie wybierając pozycję Główna > Dodaj podpis. Na ekranie pojawi się pole tekstowe, w którym dodawana jest odpowiednia legenda. Dostosuj rozmiar, styl, kolor i wyrównanie czcionki zgodnie z potrzebami, używając identycznych kart jak w programie Microsoft Word na pasku narzędzi oprogramowania. Na koniec przenieś podpis do lewego górnego rogu filmu.
  4. Powtórz krok 7.3 dla wszystkich filmów DLIT-μCT.
  5. Dodaj stronę tytułową, na przykład Dni infekcji C. rodentium 1-8, klikając Strona główna > Tytuł. Na ekranie pojawi się pole tekstowe, w którym odpowiedni tytuł zostanie dodany do pustego slajdu. Dostosuj rozmiar, styl, kolor i wyrównanie czcionki zgodnie z potrzebami, używając identycznych kart jak w programie Microsoft Word na pasku narzędzi oprogramowania.
  6. Zapisz projekt jako projekt programu Movie Maker *mmp w odpowiednim folderze z tytułem filmu. Ten krok jest niezbędny, jeśli chcesz zmienić film.
  7. Zapisz film jako plik .wmv. Kliknij menu Movie maker (Kreator filmu> Zapisz > filmu na komputerze.
  8. Konwertuj plik programu Movie Maker za pomocą konwertera plików na .avi lub inny odpowiedni typ pliku zgodny z Twoim komputerem.
    Notatki:

Wyniki

Zakażenie myszy C57BL/6J dawką 5 x 109 cfu C. rodentium jest dobrze opisanym modelem infekcji bakteryjnej, która prowadzi do samoograniczającego się zakażenia przewodu pokarmowego, osiągającego szczyt między 6. a 8. dniem po zakażeniu i trwającego od 3 do 4 tygodni2,14. Zakażenie jest ograniczone do światła jelita przez mysi układ odpornościowy, w konsekwencji czego bakterie są stale wydalane z kałem. Kolonizację myszy przez C. rodentium można monitorować nieinwazyjnie poprzez bezpośrednie zliczanie bakterii z kału lub za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego 2,3.

Niniejszy manuskrypt opisuje zoptymalizowany protokół obrazowania multimodalnego 3D i 4D C. rodentium u myszy w celu monitorowania ładunku bakteryjnego i lokalizacji podczas infekcji. Wyniki przedstawione na Ryc. 1 demonstrują kontrole niezbędne do prawidłowego obrazowania 4D. Przed zainfekowaniem myszy konieczne jest upewnienie się, że zastosowany inokulum bakteryjny jest bioluminescencyjny (Ryc. 1A) oraz że po podaniu bioluminescencyjnego C. rodentium przez zgłębnik dożołądkowy sygnał jest obserwowalny w żołądku zwierzęcia, a nie w płucach (Ryc. 1B)16.

Oprócz monitorowania kolonizacji bakteryjnej za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, dobrą praktyką jest ilościowe oznaczenie liczby bakterii w kałach, co służy jako pośredni pomiar kolonizacji błony śluzowej przewodu pokarmowego przez bakterie. Rycina 2 przedstawia typowe obciążenie bakteryjne w kałach pobranych od 8 myszy C57BL6/J, które zostały zainfekowane dawką ~5 x 109 cfu ICC180 i monitorowane przez 8 dni P.I. Kolonizacja wzrasta od 2. dnia P.I. aż do 6-7. dnia, kiedy infekcja osiąga szczyt na poziomie ~5 x 1010 cfu/g, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami2,3,17.

Aby podkreślić znaczenie oceny rozprzestrzeniania się infekcji u pojedynczej myszy, Rysunki 1b i 3 oraz Wideo 1 zostały przygotowane na podstawie tej samej myszy po zakażeniu C. rodentium, zgodnie z powyższym opisem. Codziennie przeprowadzano DLIT-μCT w celu oceny przestrzennego rozkładu bakterii bioluminescencyjnych u tej myszy, wykorzystując szkielet jako punkt odniesienia anatomicznego. Rysunek 3 przedstawia rekonstrukcję DLIT-μCT myszy C57BL/6J zakażonej szczepem ICC180 w trzech kluczowych punktach czasowych po zakażeniu (P.I.). W 3. dniu P.I. w okrężnicy można zaobserwować niewielkie ogniska bioluminescencyjne, które do 5. dnia P.I. wykazują umiarkowany wzrost intensywności bioluminescencji przy niewielkich zmianach w rozkładzie przestrzennym. W 7. dniu P.I. zaobserwowano znaczny wzrost bioluminescencji, a ogniska bioluminescencyjne rozprzestrzeniły się na całą okrężnicę.

Wideo 1 stanowi kompilację rekonstrukcji 3D DLIT- μCT z dni 1–8 p.i. z użyciem ICC180 i ilustruje obecność C. rodentium w bliższym odcinku przewodu pokarmowego między 1. a 2. dniem p.i., a następnie rozprzestrzenianie się bakterii do okrężnicy w 3. dniu p.i. Od 4. do 6. dnia p.i. liczba bakterii w okrężnicy wzrasta, osiągając szczyt w 7. dniu p.i., kiedy ogniska bakteryjne obejmują całą okrężnicę. W 8. dniu p.i. w bliższym i dalszym odcinku okrężnicy obecne są tylko dwa wyraźne ogniska bakteryjne. Możliwość przeglądania pełnej rekonstrukcji 3D dla każdego punktu czasowego w kolejności chronologicznej stanowi potężne narzędzie do analizy interakcji między gospodarzem a patogenem i jest łatwiejsza w interpretacji niż statyczny obraz 3D z tego samego zestawu danych.

Obrazowanie bioluminescencyjne; A: Probówka; B: Mysz; Skala kolorów wskazująca poziomy promieniowania; Wyniki eksperymentu.
Rycina 1. Dwuwymiarowe obrazowanie bioluminescencyjne A) inokulum bioluminescencyjnego C. rodentium ICC180 oraz B) myszy po podaniu doustnym 200 μl inokulum. Grot strzałki (>) wskazuje bioluminescencyjne C. rodentium w żołądku.

Wykres wzrostu kolonizacji bakteryjnej, skala logarytmiczna CFU, analiza danych w dniach po infekcji.

Rysunek 2. Dynamika kolonizacji przez C. rodentium. Ilościowe oznaczenie jednostek tworzących kolonie C. rodentium w kale przez 8 dni po zakażeniu.

Obrazowanie spektroskopowe gryzonia pokazujące śledzenie iniekcji hydrożelu w czasie, wykres analizy.
Rycina 3. Tomografia obrazowania światła rozproszonego-skan μCT zakażenia bioluminescencyjnym C. rodentium u jednej myszy monitorowanej w 3., 5. i 7. dniu po zakażeniu (P.I.). Grot strzałki (>) ilustruje kolonizację okrężnicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycina.

Wideo 1. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo. Film 4D z infekcji C. rodentium u jednej myszy monitorowanej od dnia 1. do 8. p.i.

Dyskusja

Film 4D przedstawiający infekcję bakteryjną stanowi przydatne narzędzie do szybkiej i łatwej wizualizacji i interpretacji dużych ilości danych obrazowania multimodalnego. Technika ta ułatwia szczegółową analizę tego, w jaki sposób infekcja rozprzestrzenia się przez pojedynczą mysz i może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób delecja genów gospodarza lub bakterii lub określone strategie interwencyjne wpływają na obciążenie, dystrybucję i lokalizację bakterii podczas badania podłużnego7. Filmy te stanowią również użyteczne pomoce dydaktyczne i środki do rozpowszechniania informacji wśród społeczeństwa.

W tym protokole istnieje kilka krytycznych etapów, które mogą wpłynąć na jakość danych uzyskanych z obrazowania DLIT-μCT i możliwość skompilowania filmu 4D infekcji. Najważniejszą częścią tego protokołu jest udane i jednorodne zakażenie myszy C. rodentium. Istotne jest, aby myszy użyte do badania miały masę 18-20 g, a inokulum bakteryjne było świeżo przygotowane i zawierało około 5 x 109 jtk, jak opisano wcześniej2,3. Przed zakażeniem myszy ważne jest, aby sprawdzić, czy inokulum jest bioluminescencyjne za pomocą Spectrum CT, a po przygotowaniu inokulum musi być stale homogenizowane przed pobraniem każdej myszy, aby zapewnić, że myszy otrzymają podobne dawki zakaźne. Obrazowanie myszy za pomocą DLIT-μCT zostało zoptymalizowane w taki sposób, że funkcja automatycznej ekspozycji w oprogramowaniu Living Image 4.3.1 automatycznie określa zoptymalizowane parametry obrazowania, aby sygnał był znacznie powyżej szumu. Jednak funkcja automatycznej ekspozycji opiera się na ustawieniach i parametrach zdefiniowanych przez użytkownika, które należy zmodyfikować zgodnie z opisem w procedurze. Niezastosowanie się do tego spowoduje słabe obrazy z małą liczbą zebranych fotonów, które nie powodują oczywistego postępu infekcji, ponieważ fabryczne ustawienia Spectrum CT dla automatycznej ekspozycji są zaprogramowane do obrazowania guzów wykazujących ekspresję lucyferazy świetlika. Rekonstrukcje wykonane przy użyciu 560-620 nm dają najlepszą zgodność między danymi symulowanymi a zmierzonymi, a zatem są bardziej wiarygodnymi danymi, które można uwzględnić w rekonstrukcji.

Ograniczeniem stosowania DLIT-μCT jest to, że promieniowanie jonizujące ze skanu μCT powoduje subletalne uszkodzenia radiacyjne, które kumulują się w badaniu podłużnym18. Subletalna ekspozycja na promieniowanie może osłabić odpowiedź immunologiczną, spowodować uszkodzenie DNA i apoptozę w narządach wewnętrznych19. Ostatecznie, skumulowane subletalne uszkodzenia promieniowania mogą spowodować śmierć, jeśli LD50/30 dla promieniowania jonizującego zostanie przekroczone, które wynosi od 5 do 7 Gy w zależności od szczepu myszy i wieku użytych myszy18,20,21. Chociaż niektóre uszkodzenia molekularne spowodowane promieniowaniem jonizującym mogą się goić, ponieważ nadrzędną zasadą jest konserwatywne oszacowanie dawki, zwykle nie jest to uwzględniane w planowaniu badań. Zamiast tego celem jest pozostanie jak najdalej poniżej tych limitów, przy jednoczesnym osiągnięciu celów badania. Jest to szczególnie ważne w tym badaniu ze względu na normalną odpowiedź immunologiczną na infekcję, częstotliwość obrazowania oraz fakt, że zwierzęta transgeniczne, z układem odpornościowym lub silnie zakażone mogą być bardziej podatne na promieniowanie jonizujące.

Planując eksperyment w celu wygenerowania filmu 4D infekcji, ważne jest, aby wziąć pod uwagę długość eksperymentu, liczbę skanów μCT wymaganych w tym okresie oraz LD50/30 dla promieniowania jonizującego dla używanego szczepu myszy. Innym potencjalnym ograniczeniem DLIT-μCT jest siła ekspresji reporterowej w stosowanym szczepie bakteryjnym, ponieważ wpłynie to na limity wykrywalności bakterii i czas obrazowania. Zdecydowanie zaleca się, aby badacze używali zwalidowanych szczepów bakteryjnych, które są w pełni zjadliwe, ale zoptymalizowane pod kątem maksymalnej ekspresji operonu luksa , jak wykazano wcześniej dla BLI2,3.

Jednym z zastrzeżeń do obecnego projektu obrazowania 4D jest to, że każdy film składa się z indywidualnych skanów DLIT-μCT, które mają różne skalowanie fotonów. Może to sprawić, że obrazy będą trudne do interpretacji, jeśli zmiany w lokalizacji ognisk BL lub ich intensywności są subtelne lub jeśli występuje jedno intensywne ognisko BL otoczone wieloma słabymi ogniskami. Dlatego w przypadku wizualizacji podłużnych ważne jest, aby paski kolorów były spójne we wszystkich punktach czasu.

Koncepcja filmu 4D infekcji może być zastosowana do każdego odpowiednio oznakowanego patogenu bakteryjnego. Przyszły rozwój tej techniki będzie miał na celu wykorzystanie tomografii obrazowania fluorescencyjnego (FLIT) oraz DLIT w celu ułatwienia badania reakcji gospodarza na infekcję przy użyciu kombinacji bioluminescencyjnych patogenów bakteryjnych i wstrzykiwanych fluorescencyjnych sond bliskiej podczerwieni w celu zbadania odpowiedzi gospodarza na infekcję. Oprócz tego w tym protokole opisujemy tylko wykorzystanie bakterii bioluminescencyjnych do tworzenia filmów 4D infekcji. Jednak w niektórych przypadkach może być konieczne użycie bakterii znakowanych fluorescencyjnie, na przykład oznaczonych iRFP, aby reporter bioluminescencji mógł być wykorzystany do badania genetyki gospodarza podczas infekcji. Co ważne, zastosowanie obrazowania multimodalnego łączącego DLIT/FLIT-μCT pozwoli nam na nieinwazyjne badanie wielu parametrów podczas infekcji bakteryjnej, co znacząco przyczyni się do ograniczenia, udoskonalenia i zastąpienia wykorzystywania zwierząt w badaniach naukowych, zgodnie z założeniami inicjatywy NC3R (http://www.nc3rs.org.uk/).

Oświadczenia

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu jest sponsorowany przez PerkinElmer.

Autorzy Kevin P, Francis, Jeff Meganck i Chaincy Kuo są pracownikami firmy Caliper- A PerkinElmer.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Procedurach Naukowych dla Zwierząt z 1986 r. i zostały zatwierdzone przez lokalną Komisję ds. Oceny Etyki.

Podziękowania

Ośrodek obrazowania in vivo w Imperial College został sfinansowany przez MRC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bioluminescencyjny C. rodentiumFrankel labICC180Wiles et al., 2004
Veet BootsOptymalny czas depilacji to 7 min. Depilacja działa lepiej, jeśli krem jest dobrze wcierany.
Izofluoran (100% v/v)AbbottB506 
Tlen medycznyBOC Medycznabutla rozmiaru F. Uwaga: wymagany jest odpowiedni regulator.
Bulion Luria BertaniMerck1.10285.050025 g w 1L Woda demineralizowana.
Luria Bertani agarMerck1.10283.050037 g w 1L Woda demineralizowana.
Siarczan kanamycynySigma (Fluka)60615 
50 ml Polipropylenowe stożkowe probówki FalconBD (Falcon)352070 
UniversalsCorning (Gosselin)E5633-063 
Strzykawka 1 mlBD (Plastipak)300013 
Doustna igła dozująca (16G x 75 mm) zakrzywionaVet TechDE005 
Mikrobanki (kriowalne)Pro-Lab DiagnosticsPL.170/Y 
Suwmiarka CT IVIS Spectrum- firma PerkinElmer133577 Rev A/ Spectrum CT 
Suwmiarka UPS 6kVA- firma 
System anestezjologiczny XGI-8Caliper- firma PerkinElmer118918 
XAF-8 Suwmiarka z filtrem anestezjologicznymfirma PerkinElmer118999/00 
Żywy obraz v4.3.1 SP1Caliper- a PerkinElmer Company 
Inkubator laboratoryjnyNew Brunswick ScientificInnova 44 

PerkinElmer -

Bibliografia

  1. Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice. J. Vis. Exp. (48), e2547(2011).
  2. Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).
  3. Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).
  4. Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract. Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).
  5. Fanning, S., et al. Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).
  6. Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).
  7. Collins, J. W., et al. Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection. Microbiology. , 10-1099 (2012).
  8. Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).
  9. Hardy, J., et al. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303, 851-853 (2004).
  10. Szittner, R., Meighen, E. Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium. J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).
  11. Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).
  12. Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J. Biomed. Opt. 12, 024007(2007).
  13. Cronin, M., et al. High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting. PLoS One. 7, e30940(2012).
  14. Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).
  15. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).
  16. Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents. Lab Anim. 41, 321-328 (2007).
  17. Crepin, V. F., et al. Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo. Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).
  18. Willekens, I., et al. Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol. ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).
  19. Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. Small-animal X-ray dose from micro-CT. Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).
  20. Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening. Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).
  21. Kohn, H. I., Kallman, R. F. The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies. Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Infekcja bioluminescencyjnymi bakteriamiobrazowanie DLIT-μCTIVIS Spectrum CTinfekcja poprzez zgłębnik żołądkowycodzienny nienachalny monitoringenumeracja bakterii w kaletrójwymiarowa tomografia rozproszonego światłarekonstrukcja mikro-CT
Multimodalne obrazowanie 4D zakażeń Citrobacter rodentium u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.