Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS

Podsumowanie

Prezentujemy prosty protokół do uzyskiwania filmów z mikroskopii fluorescencyjnej rosnących komórek drożdży, oraz pakiet oprogramowania oparty na graficznym interfejsie użytkownika do ekstrakcji danych szeregów czasowych pojedynczych komórek. Analiza obejmuje automatyczne przypisywanie czasu pochodzenia i podziału zintegrowane z inspekcją wizualną i ręczną selekcją śledzonych danych.

Streszczenie

Fluorescencyjna mikroskopia poklatkowa stała się potężnym narzędziem w badaniu wielu procesów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki. W szczególności filmy przedstawiające czasową zależność ekspresji genów dostarczają wglądu w dynamikę jej regulacji; Istnieje jednak wiele wyzwań technicznych związanych z uzyskiwaniem i analizą filmów fluorescencyjnych pojedynczych komórek. Opisujemy tutaj prosty protokół wykorzystujący dostępne na rynku urządzenie do hodowli mikroprzepływowej do generowania takich danych oraz oparty na MATLAB, graficzny interfejs użytkownika (GUI) pakiet oprogramowania do ilościowego określania obrazów fluorescencyjnych. Oprogramowanie segmentuje i śledzi komórki, umożliwia użytkownikowi wizualne selekcjonowanie błędów w danych oraz automatycznie przypisuje pochodzenie i czasy podziału. Graficzny interfejs użytkownika dalej analizuje szeregi czasowe w celu wytworzenia całych śladów komórek, a także ich pochodnych za pierwszym i drugim razem. Chociaż oprogramowanie zostało zaprojektowane dla S. cerevisiae, jego modułowość i wszechstronność powinny pozwolić mu służyć jako platforma do badania innych typów komórek z niewielkimi modyfikacjami.

Wprowadzenie

Analiza ekspresji genów w pojedynczych komórkach pogłębiła nasze zrozumienie wielu aspektów regulacji genów. Statyczne migawki fluorescencyjnej ekspresji reporterowej przy użyciu cytometrii przepływowej lub mikroskopii dostarczają użytecznych informacji na temat rozkładu ekspresji pojedynczej komórki, ale brakuje historii i ewolucji danych szeregów czasowych wymaganych do bezpośredniego informowania o dynamice ekspresji genów. Fluorescencyjna mikroskopia poklatkowa stanowi sposób na uzyskanie zarówno pomiarów pojedynczych komórek, jak i ich historii. Opracowano różne techniki eksperymentalne i analityczne w celu uzyskania i ilościowego określenia filmów ekspresji fluorescencyjnego reportera, dostarczając w ten sposób wglądu w cechy regulacji genów (patrz ¹ w celu przeglądu), takie jak zmienność między komórkami ^2,3, tworzenie się bakteryjnych trwałych ⁴, inicjacja i wydłużenie transkrypcji ⁵, pękanie transkrypcji ^6,7, zależność od cyklu komórkowego ^8,9 i odziedziczalność ¹⁰. Jednak uzyskanie wysokiej jakości szeregów czasowych fluorescencji pojedynczej komórki wiąże się z poważnymi wyzwaniami technicznymi związanymi z hodowlą monowarstwy komórek w kontrolowanym środowisku oraz z wysokoprzepustową kwantyfikacją nabytych filmów fluorescencyjnych. W tym miejscu opisujemy procedurę uzyskiwania i analizowania filmów fluorescencyjnych S. cerevisiae bez wymaganego doświadczenia w produkcji urządzeń do hodowli komórkowych lub w tworzeniu oprogramowania (ryc. 1).

Po pierwsze, szczegółowo opisujemy przykładowy protokół generowania filmów z serii fluorescencyjnych dla pączkujących drożdży wyrażających jeden lub więcej fluorescencyjnych reporterów. Chociaż niestandardowe komory do hodowli mikroprzepływowych zostały zbudowane i z powodzeniem stosowane wcześniej ^11-13, używamy dostępnego na rynku urządzenia mikroprzepływowego firmy CellAsic (Hayward, Kalifornia). System ogranicza komórki do wzrostu jednowarstwowego i umożliwia ciągłą kontrolę środowiska perfuzji. Przedstawiony przez nas protokół mikroskopowy jest prostym sposobem na uzyskanie filmów fluorescencyjnych pączkujących drożdży, ale każdy zmodyfikowany protokół eksperymentalny (niestandardowe urządzenie do hodowli, alternatywne warunki pożywki itp.) dający podobne dane filmu fluorescencyjnego pojedynczych komórek drożdży może zostać zastąpiony.

Następnie przedstawiamy analizę filmów za pomocą pakietu oprogramowania opartego na graficznym interfejsie użytkownika (GUI) w MATLAB (Mathworks, Natick, MA), nazwanego GUI for Rapid Analysis of Fluorescence Time Series (GRAFTS), aby wyodrębnić dane szeregów czasowych dla pojedynczych komórek. GRAFTS ma podobne funkcje do wszechstronnego pakietu oprogramowania typu open source Cell-ID ¹⁴ w zakresie segmentacji i śledzenia komórek oraz ekstrakcji intensywności fluorescencji i informacji geometrycznych. Jednak GRAFTS zapewnia ważne dodatkowe funkcje. Po pierwsze, oferuje łatwą interaktywną edycję wyników segmentacji i śledzenia w celu weryfikacji dokładności danych, a nie tylko statystycznego bramkowania śladów regionów odstających po analizie. Co więcej, rozszerza analizę, aby automatycznie wyznaczać linię i punkty zainteresowania cyklu komórkowego pączkujących drożdży. Określenie, kiedy matka i córka dzielą się, tworząc dwa niezależne regiony komórki, ma kluczowe znaczenie dla określenia pomiarów całej komórki (matki, w tym dowolnego połączonego pąka) w całym cyklu komórkowym ⁸. Pakiet składa się z trzech modułów do realizacji tych zadań. Pierwsza z nich segmentuje obszary komórek na podstawie kontrastu między skupionymi i nieostrymi obrazami w jasnym polu i umożliwia użytkownikowi definiowanie i wizualne testowanie parametrów segmentacji. Druga ścieżka (wykorzystująca implementację MATLAB Blaira i Dufresne'a Crockera i wsp. Procedura IDL, dostępna pod adresem: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/) i mierzy regiony komórek w czasie; automatycznie przypisuje pochodzenie; i umożliwia kontrolę wzrokową i korekcję błędów. Dołączony jest prosty graficzny interfejs użytkownika do kreślenia, aby wykonywać zapytania o właściwości pojedynczej komórki. Trzeci moduł przypisuje czasy pojawiania się i podziału pąków oraz wyprowadza dane szeregów czasowych całej komórki, a także ich pochodne za pierwszym i drugim razem (jak omówiono w ⁹). Moduł analityczny generuje dane w postaci pliku tekstowego rozdzielanego spacjami do późniejszego badania w wybranym oprogramowaniu statystycznym. W ten sposób pakiet umożliwia użytkownikowi wyodrębnienie wysokiej jakości danych szeregów czasowych za pomocą interfejsu graficznego. Użyliśmy tej metody do oszacowania szybkości transkrypcji w czasie rzeczywistym w pojedynczych pączkujących komórkach drożdży w funkcji cyklu komórkowego ⁹. Chociaż moduły zostały zoptymalizowane pod kątem pączkujących drożdży, parametry lub, w razie potrzeby, swobodnie dostępny kod mogą być dostosowane do innych organizmów i typów obrazów. Algorytmy segmentacji, śledzenia i przypisywania linii mogą być specyficzne dla przypisanych typów obrazowania i danego organizmu. Istniejące algorytmy mogą zostać zastąpione, ale nadal zachowują interfejs GUI, który umożliwia przyjazną dla użytkownika kontrolę wizualną i korektę błędów segmentacji i śledzenia, które niezmiennie występują w przypadku każdego algorytmu.

Protokół

1. Uzyskanie filmów z mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek drożdży rosnących w komorze mikroprzepływowej

1. Zaszczepić 1 ml pożywki SC (syntetyczne zdefiniowane pożywki z 2% glukozą i pełnym dopełnieniem aminokwasów) komórkami ze świeżo rosnącej płytki i inkubować kulturę przez noc ~16 godzin na bębnie rolkowym w temperaturze 30 °C. Przygotować kulturę tak, aby końcowa pożywka o długości_{600 nm} wynosiła ~0,1 dla wczesnego wzrostu w fazie logarytmicznej.
2. Rozcieńczyć kulturę starterową w razie potrzeby i odrosnąć 1 ml w świeżej probówce przez dodatkowe 6-8 godzin do OD_600nm = 0,1. Dzięki temu komórki rosną w stanie ustalonym bogatym w składniki odżywcze o gęstości odpowiedniej do załadowania do urządzenia mikroprzepływowego. (Alternatywnie, zastąp kroki 1.1-1.2 procedurą niezbędną do przygotowania komórek zgodnie z wymaganiami eksperymentu).
3. Przygotuj płytkę do hodowli mikroprzepływowej Y04C z CellAsic: usuń roztwór transportowy; przepłucz studzienki sterylną wodą; i za pomocą systemu perfuzyjnego ONIX przepuść wodę przez studzienki 1-6 przy 6 psi przez 5 minut, aby przepłukać kanały. Następnie należy wypływać ze studzienki załadowczej 8 pod ciśnieniem 6 psi przez 10 sekund (kanał załadowczy ma znacznie wyższe natężenia przepływu i należy go przepłukiwać osobno).
4. Usunąć wodę ze wszystkich studzienek i zastąpić 250 μl SC w studzienkach wlotowych 1-6 i 50 μl kultury z kroku 1.2 w studzience ładowania komórek 8. (Alternatywnie, umieść żądane media w studzienkach wlotowych 1-6 do eksperymentów wymagających przełączania między różnymi warunkami.)
5. Uszczelnij kolektor ONIX do płytki i rozpocznij zalewanie kanałów i komory hodowlanej, przepływając ze studzienek wlotowych 1-6 przy 6 psi przez 2 minuty, a następnie co najmniej 5 minut przy 6 psi tylko z dołka wlotowego, w którym znajduje się pożywka wyjściowa do eksperymentu. Powtarzaj to w sposób ciągły aż do kroku 1.7.
6. Przygotuj mikroskop do eksperymentu. Używamy mikroskopu szerokokątnego Zeiss Axio Observer.Z1 z kamerą EMCCD w technologii reflektorów Cascade II (Photometrics, Tuscon, AZ) i lampą łukową metalohalogenkową Lumen 200 (PRIOR Scientific, Rockland, MA) do wzbudzenia fluorescencji osłabionej do 10%, aby zapobiec fotowybielaniu. Aby zminimalizować czas przełączania wymagany do akwizycji w wielu kanałach fluorescencyjnych, łączymy pojedynczą, trójpasmową kostkę filtra dichroicznego z odpowiednimi filtrami wzbudzenia/emisji dla CFP, YFP i RFP (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT; zestaw 89006) ustawionymi w zewnętrznych, szybko przełączanych kołach filtrowych (Ludl Electronic Products, Novato, CA).
7. Umieść kilka kropel płynu immersyjnego na obiektywie (w razie potrzeby używamy Zeiss Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC) i bezpiecznie zamontuj urządzenie mikroprzepływowe w stoliku mikroskopu odwróconego. Upewnienie się, że płytka w ogóle się nie przesuwa na etapie całego eksperymentu, poprawia śledzenie komórek podczas analizy danych. Po prostu przyklejamy płytkę do uchwytu scenicznego, aby zapobiec jej przesuwaniu się.
8. Skoncentruj się na skrajnej lewej jednej trzeciej pierwszej komory hodowlanej (gdzie wysokość komory jest najmniejsza) za pomocą jednego z osadzonych znaczników pozycji. Wyłącz przepływ z dołka wlotu mediów i przepływ z dołka ładowania ogniw 8 przy 6 psi w 5-sekundowych seriach. Przesuń scenę, aby rozejrzeć się po komorze hodowlanej w poszukiwaniu komórek. Zwiększ czas przepływu i ciśnienie ładowania, aż do osiągnięcia pożądanej gęstości komórek, ale unikaj przeciążania i zatykania skrajnej lewej bariery, w której świeże media dostają się do komory.
9. Rozpocząć wypływ ze studzienki wlotowej pożywki zawierającej pożywkę początkową przy ciśnieniu 6 psi.
10. W MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) lub innym oprogramowaniu do automatyzacji i kontroli mikroskopii skonfiguruj wielowymiarową akwizycję, aby wykonać wiele obrazów w wielu pozycjach etapu w czasie. Ustaw liczbę punktów czasu i odstęp między nimi. Wybierz kilka pozycji etapu z ~10 komórkami każda (więcej szybko się przepełni). Zazwyczaj używamy 5-minutowych interwałów i obrazu do 16 pozycji, z których każda wymaga ~11 sekund na akwizycję w każdym punkcie czasowym.
11. Ustaw akwizycję tak, aby na każdym etapie, w każdym punkcie czasowym, program: ustawił ostrość na obrazie w jasnym polu światła przechodzącego (BF) za pomocą wbudowanej metody autofokusa MetaMorph (implementacja autofokusa jako niestandardowo napisanego dziennika na początku każdej pozycji stage zapewnia większą kontrolę nad dokładnością ostrości); uzyskał obraz BF przy +1 μm do płaszczyzny ogniskowej (f.p.); uzyskaj obraz BF nieostry (BFOOF) przy -4 μm do f.p. (użyj niestandardowych dzienników, aby zmienić ostrość zgodnie z wymaganiami między obrazami); i uzyskaj jeden obraz w skali szarości dla każdego reportera fluorescencyjnego przy f.p., korzystając z ustawień zoptymalizowanych pod kątem szybkiej akwizycji przy minimalnym fotowybielaniu.
12. W razie potrzeby należy uzyskać obrazy korekcji tła i cieniowania dla każdego reportera fluorescencyjnego w obszarze komory hodowlanej, w którym nie ma komórek.
13. Przygotuj program przepływu do eksperymentu w oprogramowaniu sterującym ONIX. Jednocześnie uruchom program akwizycji w MetaMorph i program przepływu w oprogramowaniu sterującym ONIX.
14. Na koniec eksperymentu skoryguj nierówne tło i cienie na obrazach fluorescencyjnych (jeśli to konieczne) i opcjonalnie połącz pliki .tif dla każdego kanału obrazu na każdej pozycji etapu w plik filmowy .stk (np. utwórz filmy BF, BFOOF, CFP, YFP i RFP dla pozycji 1).

2. Formatowanie i segmentowanie danych do śledzenia za pomocą graficznego interfejsu użytkownika FormatData w MATLAB (Rysunek 2)

1. Uruchom plik FormatData.m w programie MATLAB, aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika wprowadzania danych. U góry określ lub przejdź do folderu zawierającego pliki obrazów, aby ustawić katalog danych, a następnie użyj graficznego interfejsu użytkownika, aby określić typy danych i pliki obrazów zarejestrowane w eksperymencie.
2. Po prawej stronie wybierz przycisk radiowy obok opcji "Poklatkowy", aby wskazać typ analizy, który chcesz przeprowadzić. "Time-lapse" potraktuje serię obrazów jako szereg czasowy (np. film przedstawiający komórki rosnące w komorze mikroprzepływowej). "Statyczny" będzie traktował każdą serię obrazów jako zestaw migawek wykonanych z populacji (np. wiele obrazów wykonanych w różnych miejscach na jednej próbce slajdu). W tej wersji GRAFTS dane poklatkowe dla wielu pozycji mogą być przetwarzane, ale jako osobny plik dla każdej pozycji (patrz krok 2.14).
3. Zaznacz pole rejestracji obrazu, aby skorygować nieprecyzyjne ruchy stołu montażowego, przesuwając każdy obraz w filmach, aby zminimalizować pozorny ruch komórek w klatce. Zdecydowanie zalecamy to, ponieważ znacznie poprawia to śledzenie (redukując późniejsze ręczne selekcjonowanie ścieżek), ale doda losowe, "białe szumy" wartości pikseli, aby wypełnić miejsca, w których obrazy zostały przesunięte na granicy. Można go również wybrać po wyświetleniu podzielonych na segmenty obrazów BF w kroku 2.7 lub w dowolnym momencie do kroku 2.13.
4. Zaznacz pole "Jasne pole" w panelu "Kanały danych". Kliknij "Wybierz" po prawej stronie, aby załadować obrazy BF. Dla*. TIF, zaznacz wszystkie obrazy BF odpowiadające pojedynczemu filmowi, przytrzymując Shift podczas wybierania, a następnie kliknij "Otwórz". Dla*. STK, po prostu wybierz interesujący Cię stos BF. Jeśli obrazy zostaną pomyślnie rozpoznane, nazwy plików zostaną wyświetlone w menu podręcznym po prawej stronie w panelu "Rozpoznane dane". Dla*. TIF, upewnij się, że nazwy plików są wyświetlane we właściwej kolejności (zapisz pliki z sekwencyjnymi nazwami podczas akwizycji - BF_t001 itp.).
5. Zaznacz pole "Jasne pole (nieostre)" i użyj przycisku "Wybierz", jak w kroku 2.4, aby załadować pliki BFOOF, które zostaną wyświetlone w wyskakującym okienku po prawej stronie. (BFOOF uzyskany jako BF -4 μm w stosunku do f.p. przy 63X segmentach dobrze.)
6. Zaznacz pole "Maska komórki". W panelu "Źródło maski" wybierz przycisk radiowy obok "Segment BF". Naciśnij przycisk "Parametry", aby otworzyć GUI segmentacji. (Alternatywnie, wybierz wstępnie podzielony film maski, wybierając przycisk radiowy obok przycisku "Wybierz plik maski", naciskając ten ostatni i wybierając film jak w kroku 2.4. W takim przypadku film BFOOF nie jest potrzebny i można przejść do kroku 2.8.)
7. Ustaw różne parametry segmentacji (opisy każdego z nich można wyświetlić, naciskając "Opisy parametrów") i przetestuj jakość segmentacji, klikając "Testuj" (Rysunek 3). Pomyślnie podzielone regiony będą oznaczone kolorem zielonym z karmazynowymi obwódkami. Pamiętaj, aby użyć suwaka, aby sprawdzić wiele punktów czasowych w filmie. Gdy segmentacja jest zadowalająca, wybierz "Gotowe", aby zwrócić parametry segmentacji do graficznego interfejsu użytkownika FormatData.
8. Zaznacz pole "Kolorowe obrazy". Wprowadź nazwę koloru dla pierwszego kanału obrazu fluorescencyjnego w polu edycji tekstu, a następnie naciśnij "Dodaj i wybierz", aby załadować pliki kolorów, jak w kroku 2.4. Nazwa koloru zostanie dodana do pola listy po lewej stronie, a nazwy plików zostaną dodane do tabeli po prawej stronie. Jeśli zostanie popełniony błąd podczas ładowania plików kolorów, wybierz nazwę koloru z listy po lewej stronie i kliknij "Usuń kolor", aby usunąć pliki. Powtórz te czynności dla każdego kanału koloru.
9. Jeśli pożądane są dodatkowe maski podregionów oparte na jednym z kolorów fluorescencyjnych (np. znakowane fluorescencyjnie jądro → maska obszaru jądrowego), zaznacz pole "Maska kolorów". Jeśli nie, przejdź do kroku 2.12. W panelu "Źródło maski kolorów" wprowadź nazwę maski podregionu w polu edycji tekstu. Wybierz kolor z menu kontekstowego w panelu "Źródło maski kolorów" (wymaga dodania koloru w kroku 6) i naciśnij "Parametry", aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika testujący próg.
10. Naciśnij przycisk "Automatyczny próg", aby automatycznie określić próg za pomocą metody ¹⁵ Otsu, a obraz podświetli obszary zachowane powyżej progu (Rysunek 4). Próg można dostosować ręcznie za pomocą pola edycji. Użyj paska przewijania, aby potwierdzić, że próg jest odpowiedni dla wszystkich punktów czasu. Po spełnieniu wymagań naciśnij przycisk "Gotowe", aby zwrócić próg do graficznego interfejsu użytkownika FormatData.
11. Naciśnij "Dodaj i segmentuj", aby wygenerować maskę podregionu za pomocą modułu progowego zastosowanego do wybranych kolorowych obrazów. Nazwa maski kolorów i źródło zostaną wyświetlone w tabeli po lewej stronie, a odpowiednie rozpoznane nazwy plików pojawią się w tabeli po prawej stronie. (Alternatywnie, naciśnij "Dodaj i wybierz", aby załadować gotowe pliki masek podregionów).
12. U dołu określ lub przejdź do żądanego folderu, który ma być używany jako katalog zapisu.
13. Naciśnij "Formatuj dane", aby odczytać pliki obrazów (za pomocą kodu tiffread2.m opracowanego przez Francois Nedelec, dostępnego pod adresem: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298), przetworzyć dane i utworzyć plik *.mat w określonym folderze. Ten plik będzie służył jako dane wejściowe do graficznego interfejsu użytkownika ProcessTimeSeries.
14. Powtórz kroki 2.4-2.13 dla zestawu filmów dla każdej pozycji stage.

3. Śledzenie komórek i pochodzenia w czasie za pomocą graficznego interfejsu użytkownika ProcessTimeSeries oraz przypisywanie identyfikatorów i pochodzenia (Rysunek 5)

1. Uruchom plik ProcessTimeSeries.m w programie MATLAB, aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika śledzenia. Ustaw następujące parametry po otwarciu GUI:
   • "Wysokość komory" (panel "File I/O", lewy górny róg) - wskazuje wysokość komory, w której uwięzione są komórki. Jest używany jako ograniczenie w aproksymacji objętości komórki jako elipsoidy 3D na podstawie głównej i pomocniczej osi obszaru komórki, jak w ⁸.
   • "μm/piksel" (panel "File I/O") - współczynnik konwersji służący do kalibracji odległości pikseli do μm na obrazach, dzięki czemu pole przekroju poprzecznego i objętość można obliczyć odpowiednio w μm² i μm³.
   • "Panel filtrów" (poniżej panelu "File I/O") - ustaw minimalne i maksymalne parametry, aby odfiltrować niepotrzebne regiony w masce: "Obszar" - obszar regionu w pikselach; "Ecc" - współczynnik mimośrodu, bardziej kołowy jak → 0; "SF" - współczynnik kształtu, bardziej okrągły jak → 1.
2. Kliknij "Załaduj obrazy" w panelu "Plik I/O" i wybierz plik danych *.mat, który Cię interesuje, w graficznym interfejsie użytkownika FormatData. Maska regionu (i wszystkie maski podregionów) jest stosowana do każdego kanału koloru i wykonywanych jest szereg różnych pomiarów (Tabela 1). Plik danych jest następnie zapisywany. (W przypadku ładowania pliku do ProcessTimeSeries z poprzedniej sesji zostanie wyświetlone pytanie, czy analiza powinna zostać wznowiona od początku. UWAGA: Spowoduje to usunięcie wszystkich już zakończonych ścieżek i traktowanie danych tak, jakby były świeżo po pobraniu z graficznego interfejsu użytkownika FormatData. W przypadku przypadkowego ponownego uruchomienia szybko naciśnij Ctrl+C w oknie poleceń MATLAB, aby zapobiec nadpisaniu wcześniej wyselekcjonowanego pliku *.mat).
3. Następnie śledź komórki. W panelu "Śledź komórki" (obok panelu "Filtry") ustaw następujące parametry:
   • "Maksymalne przemieszczenie" - maksymalna odległość w pikselach, jaką komórka może przebyć między sąsiednimi obrazami, zanim zostanie oznaczona jako inna komórka. Większe przemieszczenie oznacza, że algorytm może uwzględnić większy ruch komórek, ale zwiększa również złożoność dopasowywania regionów komórek w tłumie. Zaczynamy od 12 i zmniejszamy, jeśli wystąpi błąd w śledzeniu (patrz krok 3.4).
   • "Minimalna długość" - minimalna liczba wystąpień, aby ślad komórki mógł zostać uznany za prawidłową serię danych. Używamy 1, aby zapobiec usunięciu jakichkolwiek rzeczywistych śladów, ale można to zwiększyć, jeśli segmentacja skutkuje krótkotrwałymi, fałszywymi śladami regionów.
   • "Frame Memory" - maksymalna liczba kolejnych klatek, przez które region komórki może zniknąć i otrzymać ten sam identyfikator po powrocie. Jeśli zniknie na dłużej niż "Pamięć ramki", po powrocie otrzyma nowy identyfikator. Używamy liczby 2, aby umożliwić pominięcie regionów przez segmentację przez 2 klatki przed powrotem.
4. Kliknij "Śledź komórki", aby śledzić regiony od jednej klatki do drugiej za pomocą centroidów regionów (implementacja Blaira i Dufresne'a MATLAB procedury IDL Crocker, Grier i Weeks, dostępna pod adresem: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/), aby przypisać linie dla nowo pojawiających się pąków i zapisać dane. Linie rodowe są przypisywane automatycznie poprzez minimalizację odległości między domniemanymi pąkami a potencjalnymi matkami w każdej klatce. (Jeśli w oknie poleceń MATLAB pojawi się błąd z powodu "trudnej kombinatoryki", zmniejsz "Maksymalne przemieszczenie" i powtórz śledzenie). Zmień parametry w wyskakujących okienkach zgodnie z potrzebami dla swoich danych.
5. Selekcjonuj słabo posegmentowane regiony i błędy w przypisaniu identyfikatorów lub pochodzenia za pomocą różnych narzędzi GUI lub skrótów (wyświetlanych w wyskakującym okienku po naciśnięciu przycisku nad panelem "Informacje o wybranej komórce").
   • Suwak, "Poprzedni obraz", "Następny obraz" (Ctrl+lewo/prawo) - służy do wyświetlania i poruszania się między klatkami w serii obrazów.
   • "Obraz #" - wyświetla numer klatki bieżącego obrazu w lewej i prawej osi. Przejdź do określonej ramki, wpisując jej numer w prawym polu edycji "Obraz #".
   • "Ramka delta" - pokazuje różnicę w numerze klatki między osią prawą i lewą (Δ = prawo - lewo).
   • "Ukryj tekst" (Ctrl+T) - przełącza między wyświetlaniem identyfikatorów komórek w prawej osi lub nie.
   • "Ukryj etykiety" (Ctrl+L) - przełącza między wyświetlaniem identyfikatorów komórek w lewej osi lub nie.
   • Menu kontekstowe "Maska" - wybierz pomiędzy wyświetlaniem bez maski, maski komórkowej lub dowolnych zdefiniowanych przez użytkownika podmasek do wyświetlenia w lewym panelu.
   • Menu kontekstowe "Nakładka" (Ctrl+1-9) - wybierz wyświetlanie warstw BF i kolorów w lewej ramce. Pokaż BF jest jedynym, który włącza lub wyłącza warstwę BF w obu osiach. Przełączaj się między wyświetlaniem a nie, ponownie wybierając nazwę nakładki w menu ("*" oznacza, że nakładka jest wyświetlana). Ctrl+1 przełącza nakładkę BF, a 2-9 przełącza kolorowe nakładki w kolejności.
   • "Set Colors" (Ustaw kolory) - służy do określania koloru do wyświetlania nakładki. Pojawi się wyskakujące okienko z zapytaniem, który kanał fluorescencji należy ustawić, a następnie pojawi się paleta kolorów do definicji użytkownika.
   • Panel "Modyfikuj regiony i ścieżki" — te elementy sterujące wpływają na zmiany w masce obszaru komórki i informacjach o śledzeniu:
     • "Aktualizuj ścieżki" (Ctrl+U) - służy do ponownego przypisywania identyfikatorów komórek. Jeśli w prawej osi nie zostaną zaznaczone żadne komórki, graficzny interfejs użytkownika poprosi o zmianę identyfikatora komórki. Gdy identyfikator X zostanie zmieniony na Y, wszystkie przyszłe wystąpienia X zostaną zmienione na Y, a wszystkie przyszłe wystąpienia bieżącego Y zostaną przełączone na X. (Czasami jedna komórka będzie przełączać się tam i z powrotem między 2 identyfikatorami, wielokrotnie. Jest to spowodowane próbą uwzględnienia wielu identyfikatorów w regionie podzielonym na segmenty, a nie błędem w funkcji aktualizacji identyfikatora). Można zaznaczyć wiele komórek i jednocześnie zmienić ich identyfikatory, ale pamiętaj, aby nadać każdej z nich unikalny identyfikator. Aby przypisać region do identyfikatora, który nie istnieje w bieżącym pliku, wprowadź "0", a zostanie wygenerowany jeden. Użyj Ctrl+W, aby zamienić identyfikatory dwóch podświetlonych komórek.
     • "Usuń wybrane ścieżki" (Ctrl+D) - służy do usuwania zaznaczonej komórki lub wielu obszarów komórek w bieżącej ramce prawej osi. (Jeśli nie są zaznaczone żadne komórki, poprosi o podanie identyfikatora). Aby trwale usunąć wszystkie wystąpienia śladu ID, zaznacz pole obok przycisku Usuń wybrane ścieżki (tekst zmieni się na "Usuń WSZYSTKO"). Jest to przydatne do pozbywania się uporczywych niepotrzebnych regionów, ale najpierw sprawdź przyszłe ramki, aby upewnić się, że identyfikator nie przełącza się na prawidłowy region komórki lub pąka.
     • "Scal regiony" (Ctrl+A lub M) - wygładza i łączy regiony komórek. Kliknij komórkę lub komórki w prawej osi, aby je zaznaczyć (region zmieni kolor na czerwony, jeśli zostanie wybrany). Scalanie w jednym regionie spowoduje morfologiczne zbliżenie w celu wypełnienia pęknięć lub małych brakujących fragmentów za pomocą elementu w kształcie dysku. Scalenie dwóch lub więcej pobliskich regionów spowoduje połączenie ich w jeden region i nadanie najniższego identyfikatora nowemu regionowi. Jest to przydatne w przypadku nadmiernie segmentowanych regionów (często, gdy komórki mają duże wakuole).
     • "Rysuj region" - użyj myszki, aby narysować region w prawej osi w żądanym miejscu i kliknij dwukrotnie, aby zakończyć. Podaj unikatowy identyfikator, którego nie ma w zestawie danych (z zakresu od 1 do 65535). Anuluj przez naciśnięcie Delete na klawiaturze.
   • Panel "Śledzenie pochodzenia" - po śledzeniu automatycznie generowane są przypisania pochodzenia. Gdy pojawią się nowe regiony identyfikatora, nowy identyfikator komórki jest wyświetlany na różowo, a do regionu macierzystego rysowana jest czerwona linia. Nowe regiony zbyt duże, aby mogły być pąkami lub zbyt oddalone od potencjalnych matek, są oznaczone kolorem zielonym i mają przypisany identyfikator matki "NaN" ("nie jest to liczba", patrz Tabela 2). Regiony istniejące w pierwszym punkcie czasu mają identyfikator nadrzędny "0". Aby naprawić poszczególne przypisania, wprowadź identyfikatory matki i pąka w tekstowych polach edycji i kliknij "Napraw". Aby usunąć matkę komórki, wprowadź "0" jako jej matkę. Szybszą metodą jest wybranie dwóch regionów na prawym obrazie i naciśnięcie Ctrl+F. Spowoduje to automatyczne przypisanie starszego regionu jako macierzystego, a nowszego regionu jako potomnego, jednocześnie usuwając wszystkie wcześniej istniejące przypisania macierzyste dla komórki potomnej. UWAGA: Kliknięcie przycisku "Oblicz pochodzenie" w dowolnym momencie spowoduje ponowne obliczenie wszystkich przypisań pochodzenia, w tym tych, które użytkownik wcześniej wybrał.
   • Panel "Informacje o wybranej komórce" - "Pobierz informacje" wyświetli niektóre pomiary obszarów zaznaczonych w prawej osi. "Pomiary..." pozwala użytkownikowi określić, które pomiary są wyświetlane (a także zdefiniować domyślną listę dla innych operacji, takich jak "Eksport danych"). Może być używany do określania prawidłowych identyfikatorów i linii rodowych (np. jeśli komórka X ma pączek w czasie t, najprawdopodobniej nie ma innego pąka w czasie t + 5 min).
   • "Save Changes" (Ctrl+S) - aktualizuje plik *.mat w celu odzwierciedlenia zmian użytkownika. UŻYWAJ CZĘSTO (nie ma funkcji cofania)!
   • "Generate Plots" - otwiera graficzny interfejs użytkownika GeneratePlots. Służy do szybkiego wykreślania informacji o wybranych zmiennych i prostych obliczeń dla regionów jednokomórkowych wyróżnionych na prawych osiach graficznego interfejsu użytkownika ProcessTimeSeries, ich średniej lub średniej wszystkich regionów w każdej klatce. Ten graficzny interfejs użytkownika może obliczać przybliżone pierwsze pochodne, ale pamiętaj, aby określić prawidłowy przedział czasu w lewym górnym rogu. Wykresy można wyprowadzić na rysunek w celu zapisania, naciskając "Generuj rysunek".
6. Aby prawidłowo zarządzać danymi: scal wszystkie nadmiernie segmentowane regiony; usuń wszystkie regiony, które nie przechwytują całej komórki; upewnij się, że relacje matka-pączek są prawidłowo przypisane (czerwona linia pojawia się między nimi w momencie pojawienia się pąka, gdy identyfikator pąka jest różowy, patrz Tabela 2); i wyeliminuj wszelkie zielone identyfikatory, ustalając identyfikator, przypisując regionowi matkę, Nie przypisując żadnej matki ("0") lub usuwając region. Dane dotyczące pąków zostaną dodane do danych matki podczas końcowej analizy, więc nie łącz regionu pąka z jego matką (doprowadzi to do niedokładnego oszacowania objętości).
7. Wizualnie sprawdź dane dla każdej ramki aż do ostatniego interesującego czasu, ale nie jest to wymagane dla całego szeregu czasowego, jeśli nie używasz późniejszych ramek.
8. Pamiętaj, aby zapisać zmiany.
9. Powtórz kroki 3.1-3.7 dla pliku *.mat dla każdej pozycji stage.

4. Eksport danych do analizy

1. Aby po prostu wyeksportować surowe pomiary regionów dla każdej komórki w czasie, naciśnij "Eksportuj dane". Interesujące pomiary można wybrać w otwartym graficznym interfejsie użytkownika i zostaną one wyświetlone w rozdzielanym spacjami pliku *.txt z nazwami zmiennych jako nagłówkami kolumn.
2. Aby przeanalizować szeregi czasowe dla całych komórek w czasie, obliczyć informacje o cyklu komórkowym i pobrać pochodne, naciśnij "Analizę szeregów czasowych". Otworzy się okno umożliwiające wybór interesujących nas pomiarów i wprowadzenie parametrów analizy (Rysunek 6).
3. Wprowadź ostatni punkt czasowy wyselekcjonowany w graficznym interfejsie użytkownika (wszystkie kolejne klatki zostaną zignorowane). Domyślne parametry wygładzania i przypisywania cyklu komórkowego działają dobrze dla naszych szczepów haploidalnych i diploidalnych obrazowanych w odstępach 5-minutowych, ale mogą one wymagać zmiany w celu uzyskania najlepszych wyników. (Sprawdź, czy wartości parametrów są odpowiednie, ręcznie określając czas pączkowania i dzielenia dla zestawu danych testowych i porównując je z wydajnością algorytmu automatycznego).
4. Po ustawieniu wszystkich parametrów naciśnij przycisk "Analizuj", aby:
   1. Skonstruuj tablice dla każdego surowego pomiaru i odejmij tło (mierzone jako średnia intensywność obszaru niekomórkowego pierwszej klatki w każdym filmie fluorescencyjnym lub może być określona w celu uwzględnienia średniej autofluorescencji na piksel komórki).
   2. Dopasuj splajn wygładzający do wybranych pomiarów, aby wyeliminować szum pomiaru o wysokiej częstotliwości (jak omówiono w ⁹).
   3. Automatycznie określaj czas pojawiania się pąków i podziału komórek dla każdej komórki na podstawie zmian nachylenia szeregów czasowych objętości, jak omówiono w ⁹. Pomiary pąków zostaną następnie dodane do pomiarów matki między pojawieniem się a podziałem w każdym cyklu dla ciągłego szeregu czasowego całej komórki. Obliczona zostanie również znormalizowana progresja cyklu komórkowego w zakresie od 0 do 2 od podziału do podziału.
   4. Dopasuj splajn wygładzający, aby uzyskać stabilne pochodne 1ⁱ 2 wybranych pomiarów. (Dla celów dobrze zdefiniowanych pochodnych, szeregi czasowe są ustawiane w sposób ciągły w poprzek podziału poprzez przesunięcie danych dla następnego cyklu komórkowego, aby osiągnąć punkt końcowy dla poprzedniego cyklu).
   5. Wyprowadzaj nieprzetworzone i wygładzone szeregi czasowe dla wszystkich regionów oraz wygładzone, ciągłe i zróżnicowane szeregi czasowe całej komórki jako tablicę dla każdego pomiaru. Pierwszy element jest indeksem koloru do odejmowania tła, reszta pierwszego wiersza zawiera identyfikatory komórek, reszta pierwszej kolumny to numer ramki, a pozostałe elementy zawierają szeregi czasowe dla każdej pojedynczej komórki w kolumnie, przy czym każdy wiersz odpowiada ramce w pierwszej kolumnie. Podobny zestaw informacji o postępach w cyklu komórkowym, szeregach czasowych i pochodzeniu zostanie również wygenerowany. Tablica "LineageArray" zawiera tabelę, w której każdy wiersz reprezentuje relację matka-pączek, a kolumny od pierwszej do piątej to identyfikator matki, identyfikator pąka, ramka pierwszego regionu pąka, szacowana ramka pączkowania i szacowana ramka podziału. Dane są eksportowane do pliku *.mat (plik danych MATLAB).

Wyniki

Prawidłowo przeprowadzony i przeanalizowany eksperyment pozwoli na uzyskanie głównie ciągłych szeregów czasowych dla pojedynczych, całych komórek z realistycznie przypisanymi czasami pojawienia się pączka oraz podziału. Przykładowo, wykonaliśmy powyższy protokół z użyciem haploidalnego szczepu drożdży wykazującego ekspresję zintegrowanej kopii białka fluorescencyjnego Cerulean (CFP) pod kontrolą konstytutywnego promotora ADH1, aby zaobserwować, jak wzrost i globalna ekspresja mogą zmieniać się w czasie ...

Dyskusja

Powyższy protokół opisuje prostą metodę uzyskiwania i analizowania danych szeregów czasowych fluorescencji z ograniczonym doświadczeniem w mikrofluidyce lub w tworzeniu oprogramowania. Pozwala na uzyskanie poklatkowych filmów fluorescencyjnych pojedynczych komórek drożdży; wyodrębnić odpowiednie pomiary wielkości i ekspresji komórek; nadzorowanie śledzenia i przypisywania pochodzenia; i analizuj zachowanie całych komórek w czasie za pomocą dostępnego na rynku urządzenia do hodowli mikroprzepływowej i wszechstronnego graf...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Y04C Płytka perfuzyjna drożdży	CellAsic	Y04C-02
ONIX Platforma perfuzji mikroprzepływowej	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1	Mikroskop Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Olej DIC	Obiektyw Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD	Kamera Fotometria
Metalohalogenkowa lampa łukowa Lumen 200	PRIOR Scientific
Kostka filtra dichroicznego z potrójnym pasmem przepustowym oraz zestaw filtrów wzbudzenia i emisji	Zestaw Chroma Technology Corp	#89006	Używany do kontrolera YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 i kół filtrowych	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		Wersja 64-bitowa radzi sobie z dużymi plikami danych lepiej niż wersja 32-bitowa