Opisano metody tworzenia ludzkich tkanek nowotworowych 3D jako systemów testowych. Technologie te opierają się na bezkomórkowym biologicznym rusztowaniu unaczynionym (BioVaSc), pierwotnych komórkach ludzkich i linii komórek nowotworowych, które mogą być hodowane zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych w bioreaktorze przepływowym.
Artykuł metodologiczny
Inżynieria tkankowa ludzkiego systemu badań 3D nowotworów in vitro
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rak jest jedną z głównych przyczyn zgonów na całym świecie. Obecne strategie terapeutyczne są opracowywane głównie w systemach hodowli 2D, które nieodpowiednio odzwierciedlają warunki fizjologiczne in vivo. Biologiczne matryce 3D zapewniają komórkom środowisko, w którym komórki mogą się samoorganizować, umożliwiając badanie organizacji tkanek i różnicowania komórek. Takie rusztowania mogą być obsadzone mieszaniną różnych typów komórek w celu zbadania bezpośrednich interakcji 3D komórka-komórka. Aby naśladować złożoność 3D guzów nowotworowych, nasza grupa opracowała system testowania guzów 3D in vitro.
Nasz system testowania tkanek 3D modeluje in vivo sytuację złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych (MPNST), które stworzyliśmy za pomocą naszego zdekomórkowego rusztowania biologicznego unaczynionego z segmentu jelita czczego świni (BioVaSc). W naszym modelu ponownie zasialiśmy zmodyfikowaną matrycę BioVaSc z pierwotnymi fibroblastami, komórkami śródbłonka mikronaczyniowego (mvECs) i linią komórek nowotworowych S462. W przypadku hodowli statycznej usuwa się strukturę naczyniową BioVaSc, a pozostałe rusztowanie rozcina się z jednej strony (błona podśluzowa jelita cienkiego SIS-Muc). Powstałą matrycę mocuje się następnie między dwoma metalowymi pierścieniami (koronami komórek).
Inną opcją jest hodowla SIS-Muc w systemie bioreaktora przepływowego, który wystawia komórki na naprężenia ścinające. W tym przypadku bioreaktor jest podłączony do pompy perystaltycznej w samodzielnie zbudowanym inkubatorze. Komputer reguluje dopływ tlenu i składników odżywczych do tętnic za pomocą takich parametrów, jak ciśnienie krwi, temperatura i natężenie przepływu. Taka konfiguracja pozwala na dynamiczną hodowlę z regulowanym ciśnieniem przepływem pulsacyjnym lub stałym.
W tym badaniu udało nam się stworzyć zarówno statyczny, jak i dynamiczny system hodowli 3D dla MPNST. Możliwość modelowania guzów nowotworowych w bardziej naturalnym środowisku 3D umożliwi odkrywanie, testowanie i walidację przyszłych farmaceutyków w modelu podobnym do ludzkiego.
Wprowadzenie
Nowe leki muszą być zatwierdzone pod względem jakości, bezpieczeństwa i skuteczności przed dopuszczeniem do obrotu. Do tej pory eksperymenty na zwierzętach są standardową metodą testowania i walidacji leków. Jednak ze względu na różnice specyficzne dla gatunku, eksperymenty na zwierzętach często nie oceniają kompleksowo wpływu związków na ludzi 1. Z tego powodu ważne jest generowanie modeli tkanek ludzkich, które można wykorzystać do badań in vitro nowych leków i substancji.
Jednym z celów naszej grupy jest tworzenie modeli testowych in vitro z naszym biologicznym rusztowaniem unaczynionym (BioVaSc) 2,3. BioVaSc może być stosowany jako statyczny lub dynamiczny system matrycowy 3D. W przypadku hodowli statycznej pozbawiony komórek segment jelita czczego świni (błona podśluzowa jelita cienkiego SIS-Muc) umieszcza się w metalowej wkładce w celu ponownego wysiewu komórek. Na rusztowaniu można hodować różne komórki, takie jak rak i komórki śródbłonka.
Dla dynamicznej hodowli, BioVaSc jest podłączony do systemu bioreaktora, który stosuje przepływ przez cały układ naczyniowy lub po powierzchni rusztowania. Obecne bioreaktory wykorzystują bodźce biologiczne, mechaniczne lub elektryczne, które wpływają na różnicowanie lub proliferację komórek 4. W przypadku bioreaktorów w dziedzinie inżynierii tkankowej podstawową koncepcją jest symulacja warunków panujących w ludzkim ciele. W którym komórki mają zapewnione naturalne środowisko, w którym mogą wchodzić w interakcje ze sobą i otaczającą je macierzą zewnątrzkomórkową. W przypadku produkcji systemów testowych in vitro lub przeszczepów kluczowa jest zdolność do naśladowania naturalnego środowiska komórek o odpowiedniej strukturze nośnika i systemie bioreaktorów 5. Dlatego aby sprostać tym zadaniom, należy opracować bardziej złożone i wymagające technicznie urządzenia 6.
Ponadto możliwe jest użycie naszego rusztowania do stworzenia modelu unaczynionego dzięki zachowanym strukturom rurkowym, które obejmują tętnicę zasilającą, żyłę i łączące ją łożysko kapilarne. Wszystkie komórki świń muszą zostać usunięte przez chemiczną, mechaniczną i enzymatyczną decelularyzację, a rusztowanie wysterylizowane promieniami gamma. Odbudowane kanalikowe struktury naczyniowe można następnie ponownie zasiać ludzkimi komórkami śródbłonka mikronaczyniowego za pomocą bioreaktora perfuzyjnego 7, który naśladuje parametry biomechaniczne i/lub biochemiczne, takie jak pH, temperatura, ciśnienie, zaopatrzenie w składniki odżywcze i usuwanie odpadów 6. Ponowna endotelializacja struktur rurkowych tworzy odpowiednik ludzkiego naczynia krwionośnego w rusztowaniu kolagenowym 3,7. W następnym kroku powierzchnię dawnego światła (błony śluzowej) można obsiać pierwotnymi komórkami ludzkimi w celu utworzenia kokultur 3,7,8.
W tym badaniu system testowania nowotworów 3D jest tworzony poprzez kokulturację linii komórek nowotworowych z pierwotnymi komórkami zrębu w warunkach statycznych i dynamicznych na SIS-Muc.
Protokół
1. Decelularyzacja BioVaSc
- Przepłukać układ naczyniowy odcinka jelita czczego świni przez kaniulowany dostęp tętniczy i światło jelita za pomocą PBS-. Powtarzaj, aż będzie całkowicie czysty.
- Przygotuj szklany zbiornik o średnicy 200 mm z 4 adapterami i podłącz je za pomocą silikonowych rurek do pompy perystaltycznej (Ismatec). Jednostka kontrolująca ciśnienie może być monitorowana za pomocą czujnika ciśnienia, który jest podłączony do sterylnej jednorazowej kopuły (patrz rysunek 1).
- Napełnij butelki zbiornika roztworem do decelularyzacji (DZ) i sprawdź system przewodów pod kątem ewentualnych pęcherzyków powietrza.
- Połącz światło jelita za pomocą opasek kablowych ze szklanymi złączami, aby uzyskać przepływ światła. Przepompować 500 ml roztworu DZ do czerwonego dostępu tętniczego (ryc. 1B) układu naczyniowego. Przerywaj proces pompowania co 15 minut na krótko, aby ręcznie wypchnąć całe światło jelita.
- Podczas procesu decelularyzacji ciśnienie roztworu buforowego powinno wynosić od 80 do 100 mm Hg, wzorowane na naturalnym ciśnieniu krwi.
- Umyj BioVaSc PBS- aż będzie wolny od resztek komórek ("całkowicie biały").
- Napełnić całkowicie BioVaSc roztworem DZ i inkubować go, zanurzyć w roztworze DZ przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce kołyszącej.
- Powtórz krok 1.6.
- Umieścić BioVaSc w roztworze DNazy i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wstrząsaczu.
- Usunąć roztwór DNazy i spłukać buforem myjącym.
- γ-sterylizacja 25 kGy
2. Różne typy komórek
2.1 Izolacja pierwotnych ludzkich komórek mikronaczyniowych śródbłonka skóry (mvECs) i fibroblastów
- Za pomocą skalpela pociąć biopsję skóry (najlepiej napletek) na paski o szerokości 2 - 3 mm i przepłukać je 3x roztworem PBS.
- Przykryć tkankę roztworem dypazy i inkubować przez 16-18 godzin w temperaturze 4 °C.
- Oddziel naskórek od skóry właściwej za pomocą 2 pęset i przenieś oba osobno na szalki Petriego wypełnione PBS+.
- Spłucz paski skóry właściwej 1x za pomocą Versene.
- Dodać 10 ml roztworu trypsyny/EDTA do pasków skóry właściwej i inkubować w inkubatorze przez 40 minut.
- Natychmiast zatrzymaj reakcję enzymatyczną za pomocą 1% FCS.
- Przenieś paski skóry na szalkę Petriego wypełnioną VascuLife i wydrap każdy pasek skalpelem 8 razy z każdej strony, lekko naciskając.
- Przenieś wyprodukowaną zawiesinę komórkową przez sitko do probówki wirówkowej i przepłucz sitko komórkowe 3x za pomocą VascuLife.
- Odwirować probówkę o stężeniu 1 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą VascuLife.
- Aby wyizolować fibroblasty, posiekaj paski skóry właściwej na małe kawałki za pomocą skalpela.
- Dodaj 10 ml roztworu kolagenazy do kawałków skóry właściwej.
- Inkubować przez 45 minut w inkubatorze, następnie odwirować i ostrożnie usunąć supernatant.
- Przemyć granulat 1x DMEM + 10% FCS + % PenStrep, odwirować i ostrożnie usunąć supernatant.
- Zawiesić osad w pożywce hodowlanej i przenieść go do kolby hodowlanej T75, aby umożliwić komórkom wyrośnięcie z tkanki.
2.2 Linia komórek nowotworowych S462
Linia komórek nowotworowych S462 (dzięki uprzejmości dr Nikoli Holtkampa, Charité University Medicine Berlin) została wygenerowana ze złośliwego guza osłonki nerwu obwodowego u pacjentki z zespołem dziedzicznej predyspozycji do nowotworów typu 1 9. S462 są hodowane w DMEM uzupełnionym 10% FCS. Pożywkę należy wymieniać co 2 - 3 dni. Raz w tygodniu komórki muszą być dzielone.
3. System testowania nowotworów: warunki hodowli statycznej w porównaniu z hodowlą dynamiczną w systemach bioreaktorów
- Rozetnij rurkowy SIS-Muc z jednej strony i zamocuj go między dwoma metalowymi pierścieniami (korony komórkowe o średnicy 10 mm, wykonane samodzielnie). Przykryj SIS-Muc na pożywkę do hodowli komórkowych na noc.
- Wysiewać izolowane komórki w komórkach o określonej liczbie komórek (patrz poniżej) po jednej lub obu stronach SIS (mono- lub kokultura).
- Wysiewać 8 000 komórek/cm2 pierwotnych mvEC w łącznej objętości 100 μl na podstawno-boczną powierzchnię SIS (dawnej surowiczej). 3 godziny później napełnij studzienkę pożywką, aby zapewnić zanurzoną hodowlę.
- Pozwól komórkom śródbłonka przylegać przez 3 dni. Obróć system hodowli statycznej o 180° i przenieś go na płytkę 12-dołkową.
- Wysiewać mieszaninę pierwotnych fibroblastów skóry (8 000 komórek/cm2) i komórek nowotworowych (15 000 komórek/cm2) o łącznej objętości 500 μl na wierzchołkowej powierzchni SIS (strona dawnego światła).
- Pozwól komórkom przylegać przez 3 godziny i napełnij studzienkę pożywką (hodowla zanurzona, pożywka: 50% Vasculife + 50% DMEM uzupełnione 10% FCS).
- System testowy guza jest hodowany w warunkach statycznych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w inkubatorze przez dodatkowe 14 dni. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni.
- W przypadku hodowli dynamicznej należy zamocować SIS-Muc między dwoma metalowymi pierścieniami i podstawowymi mvEC, jak opisano w ppkt 3.2.1. Po 3 dniach wyjmij SIS-Muc z metalowych pierścieni i włóż membranę do reaktora przepływowego (patrz rysunki 2C i 2D). Nałóż pierwotne fibroblasty skóry i komórki nowotworowe za pomocą strzykawki i kaniuli na matrycę w bioreaktorze i pozwól komórkom przylegać przez 3 godziny przed napełnieniem systemu bioreaktora pożywką hodowlaną.
- Następnego dnia można rozpocząć dynamiczne warunki hodowli ze stałym przepływem pożywki (3,8 ml/min, 37 °C i 5% CO2 ). Dynamiczna hodowla jest utrzymywana przez 14 dni, pożywka jest zmieniana po 7 dniach.
- Zestaw do testów dynamicznych jest hodowany w samodzielnie skonstruowanym inkubatorze, który zapewnia przepływ mediów przez pompę oraz niezbędną temperaturę i zawartość CO2 .
4. Metody charakterystyki do analizy
4.1 Utrwalanie i zatapianie parafiny w macierzy kolagenowej z ziarnami
- W celu przeprowadzenia charakterystyki (immunologicznej) histologicznej należy usunąć pożywkę hodowlaną i utrwalić tkankę 4% paraformaldehydem przez 2 godziny.
- Usuń 4% paraformaldehydu i przenieś SIS z metalowej wkładki do kasety z tkankami do zatapiania. Podlej tkankę, aby usunąć pozostały utrwalacz i odwodnić w celu infiltracji parafiny.
- Przed zatopieniem w bloku parafinowym należy pokroić SIS na 2-3 plastry i umieścić je w metalowej formie bazowej wypełnionej parafiną tak, aby cięte powierzchnie były skierowane w dół. Dodaj kasetę z bibułkami na wierzchu formy jako podkład.
- Pokrój plastry o grubości 5 μm i umieść je na łaźni wodnej o temperaturze 40 °C w celu wyprostowania, a następnie zamontuj szkiełka na odpowiednich szkiełkach podstawowych. Szkiełka niepowlekane są używane do barwienia H&E, szkiełka powlekane polilizyną do barwienia immunohistologicznego w celu poprawy przyczepności. Pozostaw plastry do całkowitego wyschnięcia.
- Rozpuść parafinę, usuń ją ksylenem i ponownie uwodnij plastry do następnego barwienia.
4.2 Barwienie
- Uwodnione plastry można barwić hematoksyliną/eozyną jako standardowe barwienie przeglądowe.
- W przypadku barwienia immunologicznego utrwalone i naciekane parafiną wycinki tkanek muszą zostać poddane pobraniu antygenu, aby umożliwić przeciwciałom rozpoznanie i związanie się z ich specyficznymi epitopami. Dlatego odparafinowane i ponownie uwodnione szkiełka umieszcza się w parowarze z podgrzanym buforem cytrynianowym (pH 6,0) na 20 minut.
- Przenieś szkiełka do bufora myjącego (bufor 0,5 M TBS + 0,5% Tween) i zakreśl plasterki za pomocą pisaka PAP, aby zminimalizować wymaganą objętość roztworów barwiących.
- Umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej. Aby zapewnić specyficzną wizualizację wiązania antygenu i przeciwciała za pośrednictwem peroksydazy chrzanowej, endogenna peroksydaza musi być nasycona 3% nadtlenkiem wodoru.
- Rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych nakłada się na plastry, inkubuje przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i ostrożnie zmywa buforem do mycia.
- Do wykrywania specyficznych wiązań antygen-przeciwciało stosuje się system detekcji Ultra Vision Quanto HRP DAB (Thermo Scientific) zgodnie z zalecanym protokołem.
- Jądra są barwione przeciwstawnie hematoksyliną przez 1 min.
- Szkiełka są montowane za pomocą podłoża wodnego, suszone i obrazowane za pomocą mikroskopu odwrotnego.
Wyniki
Jak pokazano na Rysunku 1B, przeprowadzono decelularyzację odcinka jelita cienkiego świń (o długości około 2 m i średnicy 20 mm) z zachowaniem struktur tubularnych sieci kapilarnej. Po chemicznej, enzymatycznej i mechanicznej decelularyzacji otrzymano rusztowanie z kolagenu I/III, które może być wykorzystane do 3D cell culture. W celu wykazania czystości macierzy (brak pozostałości DNA) wykonano test Feulgena (dane nieprzedstawione).
Rysunki 2A i 2B przedstawiają statyczną hodowlę SIS-Muc zabezpieczoną koronkami komórkowymi. Do hodowli dynamicznej przymocowaliśmy SIS-Muc w bioreaktorze zaprojektowanym wewnętrznie (Rysunek 2C). Rysunek 2D ilustruje symulowany przepływ dynamiczny przez komorę bioreaktora. Bioreaktor jest umieszczony w samodzielnie skonstruowanym systemie inkubatora i połączony z pompą perystaltyczną. Taki układ umożliwia hodowlę dynamiczną z przepływem tętniącym regulowanym ciśnieniem lub przepływem stałym.
Rycina 3 przedstawia ogólny przegląd statycznie hodowanej linii komórek nowotworowych S462 w monokulturze 2D (Rycina 3A) oraz w kokulturze 3D (Ryciny 3B-3D). Rycina 3B ukazuje potrójną kulturę komórek nowotworowych S462 i pierwotnych fibroblastów po stronie apikalnej SIS-Muc (dawna strona światła wewnętrznego) oraz mvEC po stronie bazolateralnej (dawna strona surowicza). Identyfikacja poszczególnych typów komórek jest możliwa dzięki barwieniu markerów specyficznych dla danego typu komórek, takich jak czynnik von Willebranda do znakowania mvEC (Rycina 3C). Komórki S462 wykazujące pozytywny wynik dla p53 można odróżnić od p53-ujemnych pierwotnych fibroblastów (Rycina 3D), co pozwala na analizę rozkładu komórek w 3D. Rycina 4 przedstawia barwienia analogiczne do tych z Ryciny 3 dla dynamicznie hodowanej potrójnej kultury.
Rycina 1. Układ do decelularyzacji. (A) Układ bioreaktora i pompy do decelularyzacji BioVaSc, monitorowany przez komputer PC. (B) Decelularyzowany BioVaSc w szklanym zbiorniku. Światło naczynia oraz wlot tętniczy są połączone z adapterami.
Rysunek 2. Przegląd różnych układów hodowlanych. (A) Przekrój CAD statycznego systemu hodowli w płytce mikrotitrowej, (B) wkładki metalowe do hodowli statycznej, (C) symulacja przepływu medium (pole prędkości [m/sec]) dla dynamicznej hodowli górnej pokrywy bioreaktora przepływowego, (D) bioreaktor przepływowy do hodowli dynamicznej podłączony do pompy perystaltycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek
Rycina 3. Przegląd charakterystyki immunohistologicznej statycznego modelu 3D guza. (A) Barwienie hematoksyliną statycznie hodowanej monokultury 2D komórek S462 na szkiełku Permanox, (B) barwienie H&E statycznie hodowanej potrójnej kultury 3D, strzałki wskazują komórki śródbłonka, (C) barwienie immunohistologiczne na czynnik von Willebranda, (D) barwienie immunohistologiczne na p53. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę
Rysunek 4. Przegląd charakterystyki immunohistologicznej dynamicznego 3D modelu guza. (A) Barwienie H&E dynamicznie hodowanej 3D potrójnej hodowli, strzałki wskazują komórki śródbłonka, (B) barwienie immunohistologiczne na czynnik von Willebranda, (C) barwienie immunohistologiczne na p53. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek
Dyskusja
Porównując systemy hodowli 2D i 3D w badaniach nad nowotworami, systemy 3D, mimo że są droższym podejściem, okazały się lepiej naśladować warunki panujące w mikrośrodowiskach biologicznych. Można wykazać, że niektóre komórki nowotworowe rosną znacznie wolniej w hodowli 3D niż w zwykłej hodowli 2D 12, co jest zgodne z sytuacją w prawdziwym guzie. Bissell i współpracownicy wykazali w swojej pracy, że zachowanie rakotwórczych komórek piersi odzwierciedla sytuację in vivo , w tym morfologię komórek i sygnalizację, dokładniej, gdy hodowla 3D w matrycy oferuje interakcje komórka-ECM. Ponadto podkreślili znaczenie środowiska zewnątrzkomórkowego w 3D, wykazując, że zmiany w interakcjach środowiskowych prowadzą do powrotu komórek nowotworowych do normalnego fenotypu. Dodatkowo, co najważniejsze, wyniki te można również potwierdzić w modelach zwierzęcych in vivo 10,11.
Bezpośrednie porównanie doświadczeń na zwierzętach in vivo i modeli tkanek in vitro ujawnia zalety i wady obu systemów. Jedną z zalet modeli in vitro jest możliwość znacznie lepszego obrazowania w czasie rzeczywistym lub utrwalonego za pomocą mikroskopii. Ograniczeniem jest to, że naśladują one warunki statyczne lub krótkotrwałe, podczas gdy systemy in vivo często postępują. Obecny brak unaczynienia i normalnego transportu małych cząsteczek, odpowiedzi immunologiczne gospodarza i inne interakcje komórka-komórka to kolejne wady modeli in vitro 12. Dlatego systemy 3D in vitro , przedstawione w tym badaniu, stanowią obiecujące uzupełnienie eksperymentów na zwierzętach. Zapewniają lepszą porównywalność z organizmem ludzkim, a tym samym minimalizują błędne interpretacje eksperymentalne. Biomimetyczne systemy modelowe in vivo staną się zatem bardziej przydatne do badania, w jaki sposób rak i rozprzestrzenianie się przerzutów są zależne od warunków mikrośrodowiskowych, które regulują nowotworzenie 11.
Nasze badanie pokazuje, że środowisko 3D zapewniane przez SIS-Muc prowadzi do bardziej przypominającego guz tworzenia się tkanek komórek, czego nie obserwuje się w powszechnej hodowli komórkowej 2D (patrz Figura 3A). Co więcej, wykorzystanie komórek pierwotnych pochodzących z biopsji guza jest bardzo ważnym krokiem w kierunku medycyny spersonalizowanej, dyscypliny, która ma na celu określenie najlepszego leczenia w zależności od indywidualnych potrzeb pacjenta. Włączenie pierwotnych komórek nowotworowych specyficznych dla pacjenta wyizolowanych z materiału biopsyjnego pozwoli na testowanie strategii terapeutycznych in vitro . Takie systemy testowe umożliwią badanie różnych leków i ich kombinacji w ramach wysokoprzepustowych badań przesiewowych, które pozwolą zaoszczędzić czas i koszty. Dodatkowo, integracja komórek zrębu związanych z nowotworem, jak pokazano w tym badaniu, jest ważna dla spersonalizowanego podejścia, ponieważ mikrośrodowisko guza wpływa na progresję guza 13 i może okazać się odpowiednim celem terapeutycznym.
Alternatywnie do spersonalizowanego podejścia, nasz model guza może być zmodyfikowany tak, aby służył jako uogólniony system testowania guza poprzez włączenie ustalonych linii komórek rakotwórczych. Jest to obiecująca adaptacja do celów badań podstawowych. W przypadku obu podejść do testowania leków wymagana jest obecność struktury naczyniowej w celu zbadania dystrybucji i wchłaniania substancji terapeutycznych. Macierz SIS-Muc umożliwia wysiew podstawno-boczny z pierwotnym mvEC w celu badań wychwytu bariery, a ponowne wysiewanie zachowanych struktur naczyniowych BioVaSc jeszcze bardziej usprawni badanie dostarczania leków.
W celu stworzenia modeli tkankowych biodegradowalna matryca 3D może być wykorzystana jako ramy dla wspólnej hodowli różnych typów komórek 14. Zastosowanie takich matryc 3D jest często ograniczone przez brak funkcjonalnego unaczynienia. Problem ten można rozwiązać poprzez zastosowanie BioVaSc, który oferuje zachowane struktury naczyń krwionośnych, które można ponownie zasiać komórkami śródbłonka. Ponadto BioVaSc dostarcza składniki zewnątrzkomórkowe, które zapewniają adhezję komórek i ułatwiają różnicowanie tkanek. Umożliwia również długotrwałą specyficzną dla tkanek funkcję biosztucznych tkanek 3D 7,8,15. Warunkiem wstępnym inżynierii funkcjonalnych substytutów naczyniowych jest naśladowanie ludzkich warunków fizjologicznych i biomechanicznych. W związku z tym systemy bioreaktorów, które mogą spełniać te wymagania in vitro, cieszą się ogromnym zainteresowaniem przy tworzeniu biologicznych modeli nowotworów.
Połączenie BioVaSc, technologii bioreaktora i wspólnej hodowli różnych typów komórek jest bardzo obiecującą metodą generowania unaczynionych tkanek nowotworowych, co pozwoli na badanie mechanizmów istotnych dla progresji raka, takich jak angiogeneza i przerzuty. Postrzegamy takie modele nowotworów jako obiecujące podejście do uzupełniania badań na zwierzętach poprzez zapewnienie odpowiednika fizjologii guza ludzkiego.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Janowi Hansmannowi (Fraunhofer IGB, Stuttgart) za jego wsparcie techniczne przy rozwoju bioreaktorów i inkubatora bioreaktorów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Roztwór kolagenazy | SERVA | 17454 | (500 U/ml) |
| Roztwór dypazy | Gibco | 17105-041 | (2,0 U/ml) |
| DMEM, PAA o wysokiej zawartości glukozy | G0001,3010 | ||
| DNaza | ROCHE | 10104159001 | 200 mg rozpuszczona w 500 ml PBS+ + 1% PenStrep |
| DZ roztwór | Roth | 3484.2 | 34 g Sód Desoxychelat w 1 l Ultra-czysta woda |
| FCS | LONZA | DE14-801F | |
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| medyczny przetwornik ciśnienia | MEMSCAP | SP844 | |
| monoklonalny mysz anty-ludzki Czynnik von Willebranda | DAKO Cytomation | M0616 | Klon F8/86 0,12 μ g / ml |
| mysi monoklonalny anty-ludzki p53 | DAKO Cytomation | IS616 | Clone DO-7 gotowa do użycia |
| pompa perystaltyczna | Ismatec | ||
| sterylna jednorazowa kopuła | MEMSCAP | 844-28 | |
| Roztwór trypsyny / EDTA | PAA | L11-003 | 0,05% |
| VascuLife (VEGF-Mv) | Lifeline | LL-0003 | |
| Versene | Gibco | 15040-033 |
Bibliografia
- Schenke-Layland, K., Nerem, R. M. In vitro human tissue models--moving towards personalized regenerative medicine. Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 195-196 (2011).
- Pusch, J., Votteler, M., et al. The physiological performance of a three-dimensional model that mimics the microenvironment of the small intestine. Biomaterials. 32, 7469-7478 (2011).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. J. Biotechnol. 148, 56-63 (2010).
- Lanza, R., Langer, R., Vacanti, J. Principles of tissue engineering. , 3rd, Elsevier Academic Press. Burlington, MA. (2007).
- Barron, V., Lyons, E., Stenson-Cox, C., McHugh, P. E., Pandit, A. Bioreactors for cardiovascular cell and tissue growth: a review. Ann. Biomed. Eng. 31, 1017-1030 (2003).
- Martin, I., Wendt, D., Heberer, M. The role of bioreactors in tissue engineering. Trends Biotechnol. 22, 80-86 (2004).
- Mertsching, H., Walles, T., Hofmann, M., Schanz, J., Knapp, W. H. Engineering of a vascularized scaffold for artificial tissue and organ generation. Biomaterials. 26, 6610-6617 (2005).
- Linke, K., Schanz, J., Hansmann, J., Walles, T., Brunner, H., Mertsching, H. Engineered liver-like tissue on a capillarized matrix for applied research. Tissue Eng. 13, 2699-2707 (2007).
- Holtkamp, N., Atallah, I., et al. MMP-13 and p53 in the progression of malignant peripheral nerve sheath tumors. Neoplasia. 9, 671-677 (2007).
- Weaver, V. M., Petersen, O. W., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Hutmacher, D. W., Horch, R. E., et al. Translating tissue engineering technology platforms into cancer research. J. Cell. Mol. Med. 13, 1417-1427 (2009).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Yang, S. -T., Zhang, X., Wen, Y. Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 11, 111-127 (2008).
- Schultheiss, D., Gabouev, A. I., et al. Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model. J. Urol. 173, 276-280 (2005).
Przedruki i uprawnienia
Tagi
