Analiza funkcji przedsionkowych komórek rzęsatych jest skomplikowana przez ich lokalizację głęboko w najtwardszej części czaszki, kości skroniowej skalistej. W większości badań nad funkcjonalnymi komórkami rzęsatymi wykorzystano dokładnie izolowane komórki rzęsate. W tym artykule opisano częściowo nienaruszony preparat nabłonka przedsionkowego myszy do badań elektrofizjologicznych i mikroskopii dwufotonowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolowany, częściowo nienaruszony preparat nabłonka czuciowego przedsionkowego myszy do elektrofizjologii i mikroskopii dwufotonowej o wysokiej rozdzielczości
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zrozumienie funkcji komórek rzęsatych przedsionkowych w normalnych warunkach, czyli jak trauma, choroba i starzenie się zakłócają tę funkcję, jest kluczowym krokiem w rozwoju metod prewencyjnych i/lub nowych strategii terapeutycznych. Jednak większość badań dotyczących nieprawidłowej funkcji przedsionka nie dotyczyła poziomu komórkowego, ale koncentrowała się przede wszystkim na behawioralnych testach dysfunkcji przedsionkowych, takich jak analiza chodu i odruchów przedsionkowo-ocznych. Chociaż praca ta dostarczyła cennych danych na temat tego, co się dzieje, gdy coś idzie nie tak, niewiele informacji jest zbieranych na temat podstawowych przyczyn dysfunkcji. Spośród badań, które koncentrują się na procesach komórkowych i subkomórkowych, które leżą u podstaw funkcji przedsionkowej, większość opierała się na ostro izolowanych komórkach rzęsatych, pozbawionych połączeń synaptycznych i wspierających środowisko komórkowe. Dlatego głównym wyzwaniem technicznym był dostęp do niezwykle wrażliwych komórek rzęsatych przedsionkowych w preparacie, który jest najmniej zakłócony fizjologicznie. Tutaj pokazujemy częściowo nienaruszony preparat nabłonka czuciowego przedsionkowego myszy, który zachowuje lokalne mikrośrodowisko, w tym kompleksy komórek rzęsatych / pierwotnych aferentów.
Wprowadzenie
Pomimo znaczącego wkładu układu przedsionkowego w nasze codzienne życie, jasne zrozumienie procesów odpowiedzialnych za obserwowany spadek funkcji przedsionkowej wraz z wiekiem pozostaje nieuchwytne. Jednym z powodów tego braku wiedzy jest to, że spadek funkcji przedsionkowej był prawie wyłącznie badany za pomocą testów behawioralnych, w tym odruchu przedsionkowo-ocznego (VOR), precyzyjnego wskaźnika zewnętrznej funkcji przedsionkowej, ale zapewnia ograniczony wgląd w zmiany składników wewnętrznych. Jest to główna przeszkoda w naszym zrozumieniu funkcji przedsionkowych komórek rzęsatych w zdrowiu, chorobie lub starzeniu się.
Chociaż przeprowadzono wiele badań nad pojedynczymi komórkami rzęsatymi przedsionkowymi, głównym mankamentem było poleganie na preparatach z ostrymi komórkami rzęsatymi, gdzie komórki rzęsate, a nawet zakończenia aferentne kielicha są usuwane z ich normalnego środowiska poprzez obróbkę mechaniczną i/lub enzymatyczną. Takie podejścia nieuchronnie zaburzają delikatną mikroarchitekturę między komórką rzęsatą a kielichem oraz komórką rzęsatą a komórką podporową. Wraz z opracowaniem częściowo nienaruszonych preparatów 1-5 i izolowanego preparatu błędnika myszy 6, istnieje teraz możliwość zbadania różnych form komunikacji synaptycznej w warunkach, które bardziej przypominają te in vivo. Rzeczywiście, Lim i in. (2011) wykazali wyraźne różnice w prądach całych komórek zarejestrowanych z ostro izolowanych komórek rzęsatych przedsionkowych typu I w porównaniu z tymi, które pozostały osadzone w nabłonku nerwowym. W szczególności uważa się, że potas gromadzi się w przestrzeni międzykomórkowej, między komórką rzęsatą a kielichem aferentnym, i znacząco zmienia odpowiedź komórek rzęsatych7. Tego typu informacje nie byłyby możliwe do uzyskania bez opisanego tu częściowo nienaruszonego nabłonka czuciowego przedsionkowego. Pokazujemy półnienaruszony preparat myszy crista 3 i pokazujemy reprezentatywne wyniki uzyskane z elektrofizjologii łatek całokomórkowych i dwufotonowego obrazowania wapnia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Zwierzęta
- Myszy pozyskano z Australian Rodent Centre (ARC; Perth, Australia) i utrzymywano w Bosch Animal Facility Uniwersytetu w Sydney w standardowym 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z wzbogaceniem środowiskowym. Wszystkie opisane eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Uniwersytetu w Sydney.
- Do wszystkich doświadczeń wykorzystano myszy samce i samice (C57/Bl6), ponieważ szczep ten jest powszechnie stosowany jako tło do manipulacji genetycznych i może być uznany za równoważny typowi dzikiemu (wildtype) 8-9.
2. Przygotowanie tkanki
- Przygotować 300 ml glicerolowego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) składającego się z (w mM): 26 NaHCO3, 11 glukozy, 250 glicerolu, 2,5 KCl, 1,2 NaH2PO4, 1,2 MgCl2 oraz 2,5 CaCl2. Przed dodaniem CaCl2 nasycić roztwór karbogenem (95% O2 i 5% CO2), aby ustalić pH na poziomie 7,4 i zapobiec wytrącaniu się wapnia (zmętnieniu). Zamrozić roztwór w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez 45 min, aż powstanie zawiesina lodowa.
- Głęboko zanieczulić myszy ketaminą (100 mg/kg) (Parnell, Alexandria, Australia) poprzez wstrzyknięcie doszpikowe.
- Po ustąpieniu odruchówy pinch kończyn tylnych zdekapitować myszy za pomocą ostrych nożyczek ze stali nierdzewnej i wykonać cięcie skórne w płaszczyźnie strzałkowej za pomocą żyletki (zaokrąglona #22), aby odsłonić czaszkę. Na tym etapie oraz w krokach 2.3–2.8 sklepienie czaszki, mózg i znajdujący się pod nimi aparat przedsionkowy należy utrzymywać w jak najniższej temperaturze poprzez regularne aplikowanie lodowatego ACSF na tkankę.
- Używając szpiczastego ramienia standardowych nożyczek (FST, North Vancouver, Canada), wykonać niewielkie nacięcie w czaszce w okolicy lambda i przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego. Należy upewnić się, że mózg nie jest „przeciągany” przez ostrze nożyczek podczas tego kroku.
- Ostrożnie odsunąć kości ciemieniowe bocznie, a kość potyliczną tylnie, używając kleszczyków kostnych Pearsona z płytkim zagięciem (FST).
- Następnie za pomocą małej szpatułki ze stali nierdzewnej delikatnie unieść mózg z powierzchni środkowej i tylnej jamy czaszki, a odsłonięty nerw przedsionkowo-ślimakowy (CNVIII) przeciąć w połowie drogi między uchem wewnętrznym a pniem mózgu za pomocą cienkich nożyczek irydowych. Przecięcie tego nerwu minimalizuje nadmierne napięcie aksonów pierwotnych aferentów i ich połączeń z komórkami rzęskowymi.
- Po przecięciu CN VIII usunąć mózg in toto.
- Labirynt przedsionkowy jest teraz wyraźnie widoczny w środkowej jamie czaszki, przy czym ślimak jest skierowany przednio-przyśrodkowo. Użyć kleszczyków kostnych po obu stronach labiryntu przedsionkowego, a następnie delikatnie go wyciąć, chwytając przedni kanał półkolisty i pociągając bocznie.
- Zanurzyć wycięte labirynty (Rysunek 1) w naczyniu sekcyjnym zawierającym lodowaty, stale nasycony gazem ACSF opisany w sekcji 2.1. Pod stereomikroskopem przytrzymać labirynt do dna naczynia, chwytając ślimaka. Używając precyzyjnej pęsety, zdrapać kość pokrywającą bańkę przedniego kanału półkolistego. Po uzyskaniu niewielkiego otworu w kości zacząć odrzucać fragmenty kości z bańki. Należy zachować ostrożność, aby nie przepchnąć pęsety przez kość, ponieważ może to spowodować uszkodzenie leżącego pod nią labiryntu błoniastego i nabłonka sensorycznego. Kontynuować tę procedurę do momentu odsłonięcia błoniastych przewodów i baniek przedniego oraz przyległego poziomego kanału półkolistego (Rysunek 2).
Rycina 1. Wyizolowany labirynt błędnika myszy. A. Panel lewy) Schematyczne przedstawienie wyizolowanego labiryntu błędnika myszy. Oznaczono kluczowe punkty orientacyjne umożliwiające dostęp do nabłonka sensorycznego błędnika, ślimaka oraz przedniego i poziomego kanału półkolistego. Gwiazdki wskazują ampułkę kanału półkolistego zawierającą nabłonek sensoryczny błędnika. B. Panel prawy) Fotomikrografia wyizolowanego labiryntu błędnika od miesięcznej myszy.
Rysunek 2. Obnażenie błonnego labiryntu przedsionkowego. Kość pokrywająca ampule przedniego i poziomego kanału półkolistego została zdrapana, aby odsłonić czarno-brązowe, nakrapiane ampule błonaste oraz powiązane z nimi nerwy ampularne (CNVIII). Schemat w dolnym panelu przedstawia struktury w zaznaczonym obszarze mikrofotografii i pokazuje relację między przewodami kanałów półkolistych a ampulami i CNVIII.
- Za pomocą precyzyjnej pęsety delikatnie unieś ampulle i powiązany z nimi utriculus od błędnika kostnego, dbając o to, aby nie uszkodzić centralnego obszaru ampull (zawierającego nabłonek sensoryczny). W niektórych przypadkach może być konieczne przecięcie proksymalnej części błoniastego przewodu półkolistego nożyczkami irydologicznymi, aby odseparować ampulle od kości.
- Przenieś triadę zawierającą obie ampulle i utriculus do szalki Petriego wypełnionej pożywką kulturacyjną Leibovitz's L-15 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Wykorzystaj światłowód do podświetlenia tkanki od tyłu. Pozwala to na wyraźną wizualizację grzebienia (crista) zawierającego nabłonek sensoryczny wewnątrz ampull.
- Używając precyzyjnych nożyczek irydologicznych, ostrożnie wykonaj nacięcie w nakrapianym „daszku” utriculus. Kontynuuj nacięcie przez daszek ampulli przedniej, a następnie poziomej. Wykonaj nacięcie jak najbliżej krawędzi nabłonka sensorycznego, unikając kontaktu z nim (Rysunek 3A). Upewnij się, że nad nabłonkiem sensorycznym nie pozostały fragmenty błony (Rysunek 3B).
- Przenieś wyizolowany, częściowo nienaruszony preparat do małej komory rejestracyjnej z szklanym dnem wypełnionej pożywką L-15. Przymocuj preparat za pomocą siatki z cienkich nylonowych włókien zamocowanych do spłaszczonego, U-kształtnego drutu platynowego (Rysunek 3B). W idealnym przypadku włókna siatki nie powinny zakrywać nabłonka sensorycznego, jednak w sytuacjach wymagających większej stabilności można zastosować pojedyncze włókno przecinające nabłonek sensoryczny.
Rysunek 3. Izolowany preparat półzachowany nabłonka sensorycznego błędnika. A. Schematyczne przedstawienie preparatu półzachowanego i konfiguracji elektrod. Ampula pokrywająca grzebień została „odsłonięta”, aby wyeksponować powierzchnię nabłonka sensorycznego (kolor zielony). B. Fotomikrografia półzachowanego preparatu typu „triada”, pokazująca grzebień przedni (ac) i poziomy (hc) (utriculus przesłonięty za ac). Zwróć uwagę na nylonowe włókno użyte do przymocowania preparatu do podstawy komory rejestracyjnej. Pasek skali: 100 μm. C. Elektroda rejestrująca umieszczona na pojedynczej komórce rzęsnej błędnika. Pasek skali: 15 μm.
3. Elektrofizjologia
- Przepłukaj półzachowany preparat stale natlenionym medium L-15. Medium zawiera wskaźnik pH (czerwień fenolową) i kolor medium powinien być monitorowany podczas wszystkich pomiarów. pH w obecności tlenu powinno wynosić 7,3-7,4 i odpowiadać kolorowi czerwonemu.
- Przygotuj pipety rejestrujące ze szkła borokrzemianowego o średnicy 1,5 mm (średnica wewnętrzna 1,19 mm), stosując dwuetapowy protokół (stopień grzania 1: 72; stopień grzania 2: 50) w wyciągaczu mikropipet (Narishige, Japonia, model PP-830), aby uzyskać końcową impedancję 3-4 MΩ.
- Wypełnij trzon pipety 3-4 mm wewnętrznym roztworem na bazie fluorku potasu zawierającym (w mM) 110 KF, 12 KCl, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1,8 MgCl2, 3 D-glukozy oraz 2 Na-ATP; pH 7,4 skorygowane KOH.
- Owiń trzon pipety 2-3 razy, jak najbliżej końcówki, cienkim paskiem parafilmu, aby odizolować elektrodę i zmniejszyć pojemność pipety.
- Ustaw pipetę nad nabłonkiem sensorycznym przy niskim powiększeniu (5X) w mikroskopie odwróconym (Olympus BX51). Przełącz na wysokie powiększenie (40X) i zlokalizuj pojedyncze komórki rzęsate błędnika za pomocą podłączonej kamery CCD.
- Umieść pipetę na błonie zlokalizowanej komórki rzęsatej (Rysunek 3C) za pomocą mikromanipulatora (Sutter Instruments, Kalifornia, USA). Po uzyskaniu uszczelnienia gigaohmowego przerwij błonę komórkową, przykładając niewielką wartość podciśnienia przez port ssący w uchwycie pipety.
- Wykonaj rejestrację metodą voltage clamp w konfiguracji whole-cell, stosując standardowe techniki 8-9.
4. Mikroskopia dwufotonowa
- Przygotować 0,9% roztwór soli fizjologicznej zawierający 5 mM Oregon Green 488 BAPTA-1 (OGB-1; sól heksapotasowa; Invitrogen, Niemcy).
- ideaćca zanurzona, umieścić „odkrytą” (de-roofed) preparację półzachowaną triady na małym kawałku papieru filtracyjnego (4x4 mm, grubość 0,8 μm; Millipore, Niemcy), upewniając się, że nabłonek sensoryczny nie jest zasłonięty od góry.
- Przenieść papier filtracyjny wraz z preparatem na pokrytą roztworem soli fizjologicznej platynową elektrodę bazową (7 μl) elektroporatora, składającego się z generatora impulsów i wzmacniacza szerokopasmowego, a następnie pokryć dodatkowymi 5 μl 5 mM roztworu syntetycznego barwnika wskaźnikowego wapnia Oregon Green 488 BAPTA-1 (Rycina 4).
Rycina 4. Elektroporacja objętościowa. A. schemat przedstawiający przekrój poprzeczny konfiguracji elektroporacji. Preparat częściowo nienaruszony (*) umieszczono na kawałku papieru filtracyjnego zanurzonym w barwniku wapniowym (Oregon Green 488 BAPTA-1), a prąd przyłożono pomiędzy 2 elektrody platynowe. Adaptacja z Briggman i Euler, 2011 10.
- Ustaw górną elektrodę platynową równolegle do elektrody podstawy w odległości około 2 mm, uważając, aby nie zaburzyć orientacji preparatu podczas kontaktu z roztworem Oregon Green 488 BAPTA-1.
- Przepuść krótki impuls prądu przez preparat (Parametry prądu: +13 V, szerokość impulsu 10 msec, częstotliwość 1 Hz, 10 impulsów prostokątnych) 10-11.
- Na dnie szklanej komory rejestracyjnej wypełnionej pożywką L-15 umieść niewielką ilość oleju silikonowego i ułożyć na nim półintegrałny preparat, ponownie upewniając się, że nabłonek sensoryczny nie jest zasłonięty od góry. Aby zapewnić stabilność podczas obrazowania, zamocuj nad preparatem siatkę nylonową zgodnie z powyższym opisem (patrz punkt 2.13).
- Za pomocą mikroskopu dwufotonowego wykonaj rejestracje optyczne spontanicznej aktywności wapniowej w nabłonku sensorycznym (Rysunek 7), stosując standardowe protokoły obrazowania 10-11.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Właściwości elektrofizjologiczne komórek rzęskowych błędnika zależą od złożonej mikroarchitektury, w której są one osadzone 7. Rysunek 5 pokazuje, że preparat półzachowany nabłonka błędnika może być wykorzystany do rozróżnienia między komórkami rzęskowymi typu I (Rysunek 5A), komórkami rzęskowymi typu II (Rysunek 5B) a pierwotnym neuronom aferentnym typu calyx (Rysunek 5C) na podstawie charakterystycznych przewodzeń całokomórkowych. Charaktery...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mechanizmom leżącym u podstaw naszego zmysłu równowagi poświęcono niewiele uwagi w porównaniu z innymi układami sensorycznymi, np. wzrokowym i słuchowym. Spośród badań, w których badano zmiany w funkcji przedsionkowej lub równowagi, większość koncentrowała się na pomiarach behawioralnych, w tym odruchu przedsionkowo-ocznym, z niepełną wiedzą na temat podstawowych elementów budulcowych równowagi - samych przedsionkowych komórek rzęsatych. Badania, które koncentrowały się na komórkach rzęsatych, prawie zawsze rob...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez grant Garnett Passe and Rodney Williams Memorial Foundation Project dla R. i A.J. Campa.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODCZYNNIKI | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Mikroskop stereoskopowy | Leica Microsystems | A60S | |
| Mikroskop pionowy | Olympus | BX51WI | |
| Mikroskop dwufotonowy | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Kleszcze | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Nożyczki standardowe | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH Konwerter A-D | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Mikromanipulator | Sutter | MP-225/M wzmacniacz | |
| wielozaciskowy | Axon Instruments | 700B | |
| Oprogramowanie do akwizycji danych (elektrofizjologia) | Axograph | N/A | |
| Imspector Oprogramowanie do akwizycji danych (dwufotonowe) | Innowacja Maxa Plancka | N/A |
Bibliografia
- Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
- Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).
- Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).
- Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).
- Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).
- Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
- Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
- Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
- Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
- Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
- Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
