Protein WISDOM: Stół warsztatowy do projektowania in silico de novo biomolekuł

Podsumowanie

Opracowaliśmy obliczeniowe metody projektowania białek de novo, które są w stanie zająć się kilkoma ważnymi obszarami projektowania białek. Aby rozpowszechnić te metody, prezentujemy Protein WISDOM, internetowe narzędzie do projektowania białek (http://www.proteinwisdom.org). Zaczynając od szablonu strukturalnego, można zaprojektować białka monomeryczne w celu zwiększenia stabilności i kompleksów w celu zwiększenia powinowactwa wiązania.

Streszczenie

Celem projektowania białek de novo jest znalezienie sekwencji aminokwasów, które złożą się w pożądaną trójwymiarową strukturę z poprawą specyficznych właściwości, takich jak powinowactwo wiązania, zachowanie agonisty lub antagonisty lub stabilność, w stosunku do natywnej sekwencji. Projektowanie białek leży w centrum obecnych postępów w projektowaniu i odkrywaniu leków. Projektowanie białek nie tylko dostarcza prognoz dla potencjalnie użytecznych celów leków, ale także poszerza naszą wiedzę na temat procesu fałdowania białek i interakcji białko-białko. Metody eksperymentalne, takie jak ewolucja ukierunkowana, okazały się skuteczne w projektowaniu białek. Jednak takie metody są ograniczone przez ograniczoną przestrzeń sekwencji, którą można przeszukiwać w sposób wykonalny. W przeciwieństwie do tego, strategie projektowania obliczeniowego pozwalają na przesiewanie znacznie większego zestawu sekwencji obejmujących szeroki zakres właściwości i funkcjonalności. Opracowaliśmy szereg obliczeniowych metod projektowania białek de novo, które są w stanie zająć się kilkoma ważnymi obszarami projektowania białek. Obejmują one projektowanie białek monomerycznych w celu zwiększenia stabilności i kompleksów w celu zwiększenia powinowactwa do wiązania.

Aby rozpowszechnić te metody do szerszego zastosowania, prezentujemy Protein WISDOM (http://www.proteinwisdom.org), narzędzie, które dostarcza zautomatyzowanych metod dla różnych problemów związanych z projektowaniem białek. Szablony konstrukcyjne są przesyłane w celu zainicjowania procesu projektowania. Pierwszym etapem projektowania jest etap wyboru sekwencji optymalizacyjnej, który ma na celu poprawę stabilności poprzez minimalizację energii potencjalnej w przestrzeni sekwencji. Wybrane sekwencje są następnie przeprowadzane przez etap specyficzności krotności i etap powinowactwa wiązania. Uporządkowana lista sekwencji dla każdego etapu procesu, wraz z odpowiednimi zaprojektowanymi strukturami, zapewnia użytkownikowi kompleksową ocenę ilościową projektu. W tym miejscu podajemy szczegóły każdej metody projektowania, a także kilka godnych uwagi sukcesów eksperymentalnych osiągniętych dzięki zastosowaniu tych metod.

Wprowadzenie

Projektowanie białek de novo to identyfikacja sekwencji białek, które dadzą pożądaną strukturę trzeciorzędową o ulepszonych właściwościach lub funkcji. Ponieważ natywnym fałdem białka jest konformacja, która leży na minimum energii swobodnej, projektowanie białek de novo poszukuje sekwencji, które będą miały minimum energii swobodnej w fałdzie docelowym. Problem ten został po raz pierwszy opisany przez Drexler¹ i Pabo² i był określany jako "problem odwrotnego składania". Jednak w przeciwieństwie do problemu fałdowania białek, w którym sekwencja może dać tylko jeden roztwór struktury pofałdowanej, problem projektowania białek de novo wykazuje degenerację. Wiele różnych sekwencji aminokwasów może dawać tę samą trzeciorzędową strukturę i funkcję.

Podczas gdy projektowanie białek tradycyjnie odbywało się eksperymentalnie poprzez racjonalne projektowanie i ukierunkowaną ewolucję, ostatnio zastosowano metody obliczeniowe, aby przezwyciężyć ograniczoną przestrzeń wyszukiwania właściwą metodom eksperymentalnym. Zastosowano różne metody obliczeniowe, w tym metody deterministyczne, metody stochastyczne i metody probabilistyczne. ^3,4 Wczesne metody obliczeniowe wykorzystywały szablony o stałej sieci szkieletowej, aby ułatwić rozwiązanie problemu. ^5-7 Wraz z pojawieniem się szybszych procesorów, wysokowydajnych systemów obliczeniowych i bardziej wydajnych algorytmów, elastyczność sieci szkieletowej została uwzględniona poprzez użycie zestawu szablonów stałej sieci szkieletowej^8-14 lub poprzez włączenie prawdziwej elastyczności szkieletu poprzez wyrażenie szablonu w postaci zakresów odległości między atomami i kątów dwuściennych. ^15,16

Ten artykuł szczegółowo opisuje Protein WISDOM, narzędzie online, które zostało udostępnione społeczności akademickiej w celu wykorzystania naszego obliczeniowego systemu projektowania białek de novo. Ramy te zostały zastosowane do projektowania wielu białek do zastosowań terapeutycznych ukierunkowanych na choroby takie jak HIV, rak, choroby dopełniacza i inne zaburzenia autoimmunologiczne. Wiele z przewidywanych peptydów zostało zweryfikowanych eksperymentalnie, co wykazało moc tej metody. Tabela 1 zawiera podsumowanie różnych białek, które zostały zaprojektowane, w tym wielkość białka lub peptydu, liczbę przewidywań i walidację eksperymentalną.

Projektowanie białek Długość białka # prognoz obliczeniowych # walidacji eksperymentalnych odniesienie Pełny projekt sekwencji ludzkiej beta-defensyny-2 Rozdział 41 340 szt.   (17) Inhibitory komstatyny ludzkiego C3 13 28 3/3 (18, 19) Analogi kompstatyny, które wiążą się z C3c szczura 13 5   (20) Analogi kompstatyny z rozszerzeniem di-seryny 15 8     Struktura stabilizująca analogu compstatyny W4A9 13 Rozdział 18     Agoniści i antagoniści receptora C3a 77 20 4/7 (21) Agoniści i antagoniści receptora C5a 74 Rozdział 74 61 szt. 2/61   Inhibitory HIV-1 gp14 12 6 4/5 (22) Inhibitory HIV-1 gp120 9 14     Inhibitory Bak Bcl-x L i Bcl-2 16-18 10 5/5 (23) Inhibitory ERK2 11 25     Inhibitory EZH2 21 17 10/10 (24) Inhibitory LSD1 i LSD2 16 Rozdział 41 17/20 Pokój   Inhibitory HLA-DR1 13 6   (25) Inhibitory PNP 5 13    

Tabela 1. Podsumowanie zaprojektowanych białek i peptydów przy użyciu ram projektowania białek de novo. # przewidywań obliczeniowych jest przedstawiana jako liczba korzystnych przewidywań (tj. specyficzności krotności powyżej pewnego punktu odcięcia lub przybliżonego powinowactwa wiązania większego niż sekwencja natywna). # walidacji eksperymentalnych daje dwie liczby: pierwsza to liczba przewidywań, które zostały zweryfikowane eksperymentalnie, a druga to całkowita liczba przewidywań, które zostały przetestowane eksperymentalnie.

Projekt human-beta-defensin-2 (hβD-2) został wykonany w celu zwiększenia właściwości przeciwdrobnoustrojowych peptydu. ¹⁷ W tym projekcie rozważyliśmy dwa przypadki: 1) do 10 mutacji wzdłuż hβD-2 i 2) pełny projekt sekwencji wszystkich pozycji reszty hβD-2 z wyjątkiem cystein (8, 15, 20, 30, 37 i 38). W projekcie wykorzystano trzy różne szablony projektowe i trzy różne modele wyboru sekwencji. Zaobserwowano wysoki poziom podobieństwa mutacji między modelami średniej ważonej i modelu przedziału odległości zarówno dla projektu 10 mutacji, jak i projektu pełnej sekwencji. Ponadto stwierdzono, że duża liczba sekwencji ma korzystniejsze obliczone wartości swoistości krotności niż sekwencja natywna.

Inhibitory układu dopełniacza (C3, C3a i C5a) zostały zaprojektowane do zwalczania wielu chorób immunologicznych, takich jak udar, atak serca, choroba Alzheimera, astma, reumatoidalne zapalenie stawów, odrzucenie ksenotransplantacji, choroby układu oddechowego dorosłych, łuszczyca i choroba Leśniowskiego-Crohna. Trzy inhibitory C3c kompstatyny przewidywane przez ramy projektowania białek oraz trzy racjonalnie zaprojektowane sekwencje zostały eksperymentalnie potwierdzone jako lepsze spoiwa niż natywna compstatyna. ^{Rozdział 18,19}

Dalsze badania badały utratę aktywności kompstatyny przeciwko C3c innym niż naczelne i zaprojektowały szereg potencjalnych inhibitorów C3c dla szczurów i myszy. Wykazano, że pięć sekwencji ma korzystniejsze energie wolne od asocjacji ze szczurzym C3c niż mutant kompstatyny W4A9, o którym wiadomo, że hamuje C3c. Dzieje się tak za sprawą nowego mostka solnego utworzonego przez Arg1. ²⁰ Przewidywano, że osiem sekwencji z N-końcowym rozszerzeniem będzie lepszymi spoiwami niż W4A9 z przedłużeniem di-seryny. Wreszcie, przewidywano, że 18 sekwencji kompstatyny stabilizuje związaną konformację W4A9, dostarczając silnych kandydatów na inhibitory C3c naczelnych i innych niż naczelne.

Oprócz inhibitorów C3c, agoniści i antagoniści receptora C3a i C5a zostali zaprojektowani na podstawie struktur C3a i C5a. Siedem sekwencji C3a przewidywanych przez model zostało przetestowanych eksperymentalnie. Dwie z tych sekwencji były silnymi agonistami, podczas gdy dwie inne były częściowymi agonistami. ²¹ Dwaj silni agoniści wykazali 58-krotną poprawę w stosunku do wcześniej odkrytego "superagonisty". Konstrukcja agonistów i antagonistów receptora C5a pozwoliła na stworzenie zestawu 61 sekwencji. Wszystkie sekwencje zostały zsyntetyzowane i okazało się, że dwie z nich są nowymi agonistami C5a.

Inhibitory fuzji HIV-1, wirusa wywołującego AIDS, zostały zaprojektowane, aby zapobiec infekowaniu komórek przez HIV-1. Pierwszy projekt był ukierunkowany na gp41, glikoproteinę otoczkową wirusa HIV-1. Ramy projektowania białek przewidywały sześć sekwencji, które były lepszymi spoiwami niż sekwencja natywna. Cztery z tych przewidywanych sekwencji zostały eksperymentalnie potwierdzone pod kątem hamowania HIV-1, przy czym najlepsza sekwencja miała IC₅₀ tak niskie, jak 29 μM. Sekwencja ta wykazała 3-15-krotną poprawę w stosunku do sekwencji natywnej i nie miała utraty aktywności przeciwko szczepowi wirusa opornemu na enfuwirtyd. ²² Drugi projekt był ukierunkowany na gp120, inną glikoproteinę otoczkową HIV-1. Przewidywano, że czternaście sekwencji będzie spoiwami gp120 i zapewni dodatkowe potencjalne inhibitory fuzji HIV-1.

Liczne białka związane z rakiem stanowiły obiecujące cele dla terapii przeciwnowotworowych. Bcl-2 i Bcl-x_L są białkami antyapoptotycznymi, które zapobiegają śmierci komórki. Inhibitory tych dwóch białek zostały zaprojektowane w celu indukowania śmierci komórek nowotworowych. Przewidywano, że dziesięć sekwencji będzie lepszymi spoiwami niż natywne, a wyniki te uchwyciły wcześniejsze wyniki eksperymentalne i mutagenezy. ²³ Inne białko docelowe, ERK2, bierze udział w kaskadach transdukcji sygnału, co czyni je obiecującym celem w antyproliferacyjnych terapiach przeciwnowotworowych. Przewidywano, że dwadzieścia pięć sekwencji będzie inhibitorami ERK2.

Metylotransferazy histonowe i demetylazy dynamicznie kontrolują metylację histonów, która jest powiązana z wieloma typami raka, w tym prostatą, piersią, chłoniakiem, szpiczakiem, pęcherzem moczowym, okrężnicą, skórą, wątrobą, endometrium, płucami i żołądkiem. Ramy projektowania białek de novo zidentyfikowały 17 inhibitorów EZH2 (metylotransferazy lizyny) i stwierdzono, że spośród dziesięciu testowanych eksperymentalnie wszystkie hamują EZH2. ²⁴ Najsilniejszy peptyd miał IC₅₀ wynoszący około 13 μM, był równie skuteczny przy podwyższonych stężeniach enzymów i nie konkurował z kofaktorem. Peptydy te były pierwszym zestawem inhibitorów EZH2. 53 inhibitory LSD1 (demetylazy) zostały przewidziane przez ramy, a z 20 testowanych eksperymentalnie, 17 było inhibitorami LSD1, a 18 było inhibitorami LSD2. Najlepsze inhibitory miały wartości IC₅₀ poniżej 1 μM, co czyni je najsilniejszymi inhibitorami peptydowymi odkrytymi do tej pory.

Ostatnie dwa systemy białkowe dostarczyły celów do leczenia różnych chorób autoimmunologicznych, takich jak celiakia, cukrzyca typu 1, toczeń rumieniowaty układowy, zespół Sjögrena, zespół Churga-Straussa, zapalenie tarczycy Hashimoto, choroba Gravesa-Basedowa, idiopatyczna plamica małopłytkowa, reumatoidalne zapalenie stawów i alergie. Żaden z tych potencjalnych inhibitorów nie został zweryfikowany eksperymentalnie, jednak ramy przewidywały sześć sekwencji, które wiążą się z HLA-DR1 i 13 sekwencji, które wiążą się z PNP.

Tabela 2 podsumowuje eksperymentalnie potwierdzone inhibitory i agonistów przewidywane przy użyciu struktury projektowania białek de novo. Przybliżona metryka powinowactwa wiązania została wykorzystana do przewidzenia dziewięciu sekwencji (inhibitorów ludzkiego C3c, HIV-1 gp41, EZH2, LSD1 i LSD2), podczas gdy metryka swoistości krotności została wykorzystana do identyfikacji czterech sekwencji (agonistów/antagonistów C3aR). Peptydy te podkreślają sukces ram projektowania białek de novo, w szczególności dodanego przybliżonego wskaźnika powinowactwa wiązania. Framework jest niezwykle wszechstronny w swoim zastosowaniu. Sześć różnych białek związanych z dwudziestoma pięcioma różnymi chorobami zostało z powodzeniem zaprojektowanych i zweryfikowanych eksperymentalnie.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:

nazwa	Silnik IC50	Klasa EC50	Białko docelowe	Obowiązujące choroby
Zobacz materiał SQ027	0,94 μM		C3c u ludzi	udar mózgu, atak serca, choroba Alzheimera, astma, reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń rumieniowaty układowy, stwardnienie rozsiane, łuszczyca, cukrzyca typu I, choroba Leśniowskiego-Crohna, zapalenie trzustki i mukowiscydoza
Zobacz materiał SQ086	1,98 μM		C3c u ludzi
Zobacz materiał SQ059	4,73 μM		C3c u ludzi
SQ110-4		15,2 nM	C3aR
SQ060-4		36,4 nM	C3aR
Zobacz materiał SQ007-5	15,4 nM		C3aR
Zobacz materiał SQ002-5	26,1 nM		C3aR
Zobacz materiał SQ435	29 - 253 μM		HIV-1 gp41	AIDS
Zobacz materiał SQ037	13,57 μM		EZH2	rak prostaty, piersi, chłoniaka, szpiczaka, pęcherza moczowego, okrężnicy, skóry, wątroby, endometrium, płuc i żołądka
SQ011-1	0,521 μM		Przekaźnik LSD1
SQ016-1	0,249 μM		Przekaźnik LSD1
Zobacz materiał SQ026-1	2,51 μM		Zobacz materiał LSD2
SQ015-1	1,332 μM		Zobacz materiał LSD2

Tabela 2. Peptydy przewidywane obliczeniowo i potwierdzone eksperymentalnie ukierunkowane na różne choroby.

Protokół

Przegląd metody

Struktura projektowania de novo wykorzystywana w Protein WISDOM składa się z dwóch etapów. W pierwszym etapie generowana jest uporządkowana lista sekwencji aminokwasowych, które będą zwijać się w określoną strukturę matrycową. Drugi etap służy do walidacji tych sekwencji poprzez obliczenie specyficzności zwijania, przybliżonego powinowactwa wiązania lub obu tych parametrów. Pierwsza z tych metod jest stosowana głównie w przypadku projektowania pojedynczego białka, natomiast druga znajduje zastosowanie przy projektowaniu kompleksów (peptydu wiążącego się z białkiem docelowym). Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat kroków wchodzących w skład tej struktury.

Dane wejściowe projektu: Dla frameworka do projektowania białek de novo należy zdefiniować szereg danych wejściowych. Pierwszym z nich jest szablon projektu. Jest to trójwymiarowa (3D) struktura białka, która zawiera współrzędne wszystkich atomów w białku. Struktura może być sztywna lub elastyczna. Szablony sztywne stanowią zestaw stałych współrzędnych atomów i są pozyskiwane ze struktur uzyskanych metodą krystalografii rentgenowskiej. Szablony elastyczne mogą być zestawem stałych współrzędnych atomów lub górnymi i dolnymi granicami współrzędnych atomów. Szablony te można uzyskać z rozwiązań strukturalnych NMR, dynamiki molekularnej lub symulacji dokowania.

Szablon projektowy jest wykorzystywany do generowania dopuszczalnego zestawu mutacji dla projektowanego białka. Zestaw ten definiuje, które pozycje w sekwencji mogą ulec mutacji oraz na jakie aminokwasy. Zestaw mutacji jest generowany poprzez obliczenie powierzchni dostępnej dla rozpuszczalnika (SASA) każdego pozostałości w szablonie projektowym. Jeśli pozostałość jest w więcej niż 50% wystawiona na działanie rozpuszczalnika, dopuszczalny jest zestaw aminokwasów hydrofilowych (D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, T). Jeśli pozostałość jest w mniej niż 20% wystawiona na działanie rozpuszczalnika, dopuszczalny jest zestaw aminokwasów hydrofobowych (A, F, I, L, M, V, W, Y). Jeśli stopień wystawienia pozostałości mieści się w przedziale od 20% do 50%, dopuszczalne są wszystkie aminokwasy. Cysteinę zazwyczaj wyklucza się z zestawu mutacji, chyba że dane eksperymentalne lub literaturowe uznają to za stosowne. Małe aminokwasy (A, G, T) są zazwyczaj uwzględniane we wszystkich zestawach mutacji. W przypadku dostępności, dane eksperymentalne lub literaturowe mogą zostać wykorzystane do ręcznej modyfikacji zestawów mutacji dla konkretnych pozycji aminokwasowych.

W celu obliczenia energii oddziaływań parami sekwencji w szablonie projektowym wybierane jest pole sił. Choć do zastosowania w ramach tej struktury można dostosować dowolne pole sił, opracowano dwa pola sił zależne od odległości, które są szeroko stosowane w strukturze projektowania de novo. Pierwszym jest pole sił wysokiej rozdzielczości C^α-C^α,²⁶ w którym odległości mierzone są pomiędzy atomami węgla C^α reszt. Drugim jest pole sił wysokiej rozdzielczości centroid-centroid,²⁷ w którym odległości mierzone są pomiędzy centroidami reszt. Parametry energii w polach sił zostały wyznaczone poprzez rozwiązanie problemu estymacji parametrów programowania liniowego, który wymagał, aby niskoenergetyczne atrapy (decoys) o wysokiej rozdzielczości dla dużego zbioru treningowego białek były energetycznie mniej korzystne niż ich konformacje natywne. Zarówno pole sił wysokiej rozdzielczości centroid-centroid, jak i pole sił C^α-C^α zostały przetestowane i zwalidowane w poprzednich badaniach nad ludzką beta-defenzyną-2.¹⁷ Rzeczywista elastyczność szkieletu białkowego zostaje włączona do modelu poprzez dyskretyzację pól sił na przedziały odległości. Odległość między parą aminokwasów będzie odpowiadać przedziałowi odległości, co przypisuje tę samą wartość energii do określonego zakresu odległości. Pozwala to modelowi optymalizacji wyboru sekwencji uwzględnić ruchy szkieletu białkowego.

Ograniczenia biologiczne, w postaci ograniczeń ładunku lub ograniczeń zawartości, mogą zostać wprowadzone ręcznie przez użytkownika jako dodatkowe dane wejściowe projektu. Ograniczenia ładunku określają konkretny ładunek lub zakres ładunków, które muszą zostać spełnione dla zaprojektowanej sekwencji lub jej części. Ładunek jest obliczany jako suma reszt naładowanych dodatnio (K i R) pomniejszona o sumę reszt naładowanych ujemnie (D i E). Ograniczenia zawartości określają górne i dolne granice występowania konkretnego aminokwasu w sekwencji. Ograniczenia biologiczne są zazwyczaj definiowane poprzez rozległe dopasowanie sekwencji do sekwencji natywnej. Ma to na celu uchwycenie znanych biologicznych limitów ładunku i zawartości aminokwasów występujących w naturze dla danej rodziny białek. Dalsze ograniczenia są definiowane ręcznie na podstawie analizy znanych danych eksperymentalnych.

Etap pierwszy: Wybór sekwencji: Pierwotna metoda wyboru sekwencji została opracowana przez Klepeis et al.^15,16 Wybiera ona i szereguje sekwencje aminokwasów zgodnie z ich energią w szablonie projektowym, wykorzystując model całkowitoliczbowego programowania liniowego (ILP). Metoda ta została później udoskonalona poprzez zastosowanie bardziej wydobnego obliczeniowo modelu wyboru sekwencji dla szablonów sztywnych (pojedynczych) i rozszerzona o rozwój modeli dla szablonów elastycznych. Ta metoda optymalizacji globalnej nie opiera się na losowych mutacjach i teoretycznie gwarantuje przeszukanie całej przestrzeni sekwencji oraz wyznaczenie rozwiązania globalnego. Jest to główna zaleta naszego podejścia w porównaniu do wszystkich innych istniejących metod.

Model pojedynczej struktury: Oryginalna forma modelu wyboru sekwencji zaproponowana przez Klepeis et al.^15,16 została dalej udoskonalona przez Fung et al.²⁸ Jej ostateczna postać została przedstawiona w równaniu 1.

Zbiór i=1,...,n definiuje pozycje reszt w szablonie projektowym. W każdej pozycji i mutacje są reprezentowane przez j{i}=1,...,m_i, gdzie m_i=20, jeżeli w pozycji i dopuszczalna jest mutacja do dowolnego z dwudziestu naturalnych aminokwasów. Zbiory aliasów k≡i oraz l≡j, przy k>i, są wykorzystywane do reprezentacji wszystkich unikalnych oddziaływań parzystych. W celu modelowania mutacji aminokwasów wprowadzono zmienne binarne oraz . Zmienna przyjmie wartość jeden, jeżeli model przypisuje aminokwas j do pozycji i, a w przeciwnym razie wartość zero (podobnie dla ). Funkcja celu reprezentuje sumę wszystkich parzystych oddziaływań energetycznych w szablonie projektowym. Parametr , który jest oddziaływaniem energetycznym między pozycją i zajmowaną przez aminokwas j a pozycją i zajmowaną przez aminokwas l, zależy od odległości między węglami α lub centroidami łańcuchów bocznych w dwóch pozycjach (x_i,x_j,) oraz od typu aminokwasów j i l. Wnosi on do funkcji celu tylko wtedy, gdy zarówno , jak i są równe jeden.

Fung et al.²⁸ stwierdzili, że sformułowanie (1) jest znacznie bardziej wydajne obliczeniowo niż dwanaście innych równoważnych modeli typu kwadratowego przypisania stosowanych do wyboru sekwencji.^28,29 W szczególności okazało się ono skuteczniejsze od oryginalnego modelu zaproponowanego przez Klepeisa et al.^15,16 w dwóch problemach wyboru sekwencji dla ludzkiej beta-defensyny-2: jednym o poziomie złożoności 3,4x10⁴⁵ oraz drugim o poziomie 6,4x10³⁷ z 49 dodatkowymi liniowymi więzami biologicznymi. Stwierdzono, że oryginalny model zaproponowany przez Klepeisa et al.^15,16 wymagał odpowiednio 53 263 s czasu procesora (CPU) oraz 4 578 s czasu CPU w celu rozwiązania obu problemów do optymalności globalnej przy użyciu CPLEX 9.0³⁰ na procesorze Pentium IV 3,2 GHz. Sformułowanie (1) wymagało jedynie 649 s czasu CPU oraz 14 s czasu CPU do wykonania tych samych zadań, co odpowiada 82-krotnej i 327-krotnej poprawie wydajności obliczeniowej.

Model średniej ważonej: Fung et al.²⁸ opracowali dwa modele do obsługi typowych przypadków projektowania białek de novo, w których szablon projektu jest elastyczny i zawiera zestaw struktur. Model średniej ważonej wykorzystuje ważoną średnią energię, , zamiast parametru energii (x_i,x_k) stosowanego w modelu pojedynczej struktury (Równ. 1). Wagi wt(x_i,x_k,d) są określone przez częstotliwość występowania odległości między x_i a x_k mieszczącej się w przedziale odległości d w strukturach szablonu. Końcowa postać modelu średniej ważonej została podana w Równ. 2.

Model przedziałów odległości (Distance Bin Model): Drugi model wyboru sekwencji dla elastycznych struktur szablonowych uwzględnia informacje o odległościach z wielu struktur poprzez wprowadzenie zmiennej binarnej b_ikd. Zmienna ta przyjmuje wartość jeden, jeśli odległość między x_i a x_k mieści się w przedziale odległości d, a w przeciwnym razie wartość zero. Wprowadzono również inny parametr, disbin(x_i, x_k, d), który przyjmuje wartość jeden, jeśli odległość między x_i a x_k w dowolnej z struktur szablonowych mieści się w przedziale odległości d, a w przeciwnym razie wartość zero. Ponieważ tylko jeden przedział odległości dla danej pary aminokwasów będzie przyczyniał się do całkowitej energii, w funkcji celu zostaje zastąpione przez . Powoduje to jednak wprowadzenie nieliniowości do funkcji celu. Dalsze szczegóły dotyczące linearyzacji modelu oraz dodatkowych ograniczeń, które należy dodać w celu zapewnienia wykonalności, znajdują się w pracy Fung et al.²⁸ Model przedziałów odległości przedstawiono w Równaniu 3.

Każdy z powyższych sformułowanych problemów całkowitoliczbowego programowania liniowego (ILP)^15-17 można rozwiązać rygorystycznie przy użyciu technik rozgałęziania i ograniczania (branch-and-bound).^28-30 Techniki te gwarantują spójną i niezawodną zbieżność do globalnego minimum energii sekwencji.

Etap drugi: Walidacja: Rycina 2 przedstawia szczegółowy przegląd dwóch podejść stosowanych w etapie drugim. Rycina ukazuje kroki niezbędne do obliczenia końcowej metryki rankingu oraz liczbę struktur wygenerowanych na każdym etapie.

Specyficzność fałdowania: Specyficzność fałdowania to miernik stosowany do rankingowania wstępnych projektów opracowanych w Etapie Pierwszym. Celem obliczeń jest ustalenie, jak dobrze każda sekwencja fałduje się w strukturę szablonu w stosunku do oryginalnej sekwencji szablonu, w oparciu o obliczenia energetyczne. Istnieją dwa podejścia do przeprowadzenia tej procedury, z których każde wiąże się z innym zapotrzebowaniem obliczeniowym.

Pierwsze podejście zostało zaimplementowane przez Klepeis et al.^15,16 Metoda ta wykorzystuje framework do przewidywania struktury białek ASTRO-FOLD, ^26,27,31-47 oparty na deterministycznej optymalizacji globalnej. Podejście to nie jest obecnie stosowane w implementacji Protein WISDOM, ponieważ jest ono bardzo wymagające obliczeniowo. Dostrzegając ograniczenia zasobów obliczeniowych oraz potrzebę przeprowadzenia tych obliczeń dla potencjalnie setek lub tysięcy sekwencji w procesie projektowania, Fung et al.¹⁷ zaproponowali bardziej wydajną metodę z wykorzystaniem TINKER/CYANA.^48-50 Podejście to polega na zdefiniowaniu elastycznego szablonu struktury. Elastyczny szablon można zdefiniować, określając górne i dolne granice odległości między atomami C^α oraz kąty ϕ i ψ reszt. Dla pojedynczej struktury wykorzystuje się początkowe odległości i kąty dwuścienne, a granice definiuje się jako stałą odległość lub wartość procentową. Domyślne granice wynoszą ±10% dla odległości C^α lub ±10° dla granic kątów dwuściennych. W przypadku szablonu elastycznego granice mogą być wyznaczone na podstawie maksymalnych i minimalnych wartości zaobserwowanych we wszystkich strukturach szablonowych wprowadzonych do projektowania. Po zdefiniowaniu początkowych granic dla każdej sekwencji, przy użyciu CYANA 2.1 generowane są ansamble zawierające setki konformerów.^48,49 Konformery są generowane w programie CYANA przy użyciu protokołu symulowanego wyżarzania dynamiki kątów torsyjnych, który gwałtownie nagrzewa białko, a następnie powoli je chłodzi, śledząc próbkowane konformacje. Po symulowanym wyżarzaniu przeprowadza się lokalną minimalizację energii, która minimalizuje kolizje wynikające z nakładania się promieni Van der Waalsa oraz naruszenia ograniczeń odległości i kątów. Domyślnie generowanych jest 500 struktur końcowych. Każda struktura w ansamblu dla każdej sekwencji poddawana jest lokalnej minimalizacji w programie TINKER 3.6,⁵⁰ z wykorzystaniem pola siłowego AMBER.⁵¹ Końcowa energia potencjalna każdej zminimalizowanej struktury jest tabulowana. Cały proces jest przeprowadzany dla sekwencji wyjściowej, jak i dla każdej kandydującej sekwencji mutanta. Następnie, swoistość sfałdowania (Fold Specificity) każdej sekwencji mutanta względem docelowego sfałdowania może zostać obliczona w stosunku do sekwencji natywnej przy użyciu następującego rozkładu Boltzmanna (Równanie 4).

Przybliżone powinowactwo wiązania: Metoda obliczania przybliżonego powinowactwa wiązania jest wykorzystywana do rankingowania zaprojektowanych sekwencji tworzących kompleks z białkiem docelowym. Obliczenia te można przeprowadzić bezpośrednio na sekwencjach z Pierwszego Etapu lub na sekwencjach o wysokiej swoistości fałdowania uzyskanych na etapie określania swoistości fałdowania.

Lilien et al.⁵² zaproponowali podejście do obliczania przybliżonych powinowactw wiązania kompleksów białko-ligand. Opiera się ono na generowaniu zespołów rotamerowych białka, ligandu oraz kompleksu białko-ligand i wykorzystaniu tych zespołów do obliczenia funkcji rozdziału. To przybliżone powinowactwo wiązania jest oznaczone jako K* i zdefiniowane zgodnie z równaniem 5.

Tutaj q_PL to funkcja partycji kompleksu białko-ligand, q_b to funkcja partycji wolnego białka, a q_L to funkcja partycji wolnego ligandu. Funkcje partycji zdefiniowano w równaniu 6, gdzie zbiory B, F i L zawierają konformacje oparte na rotamerach odpowiednio dla związanego kompleksu białko-ligand, wolnego białka oraz wolnego ligandu. E_n to energia konformacji n, R to stała gazowa, a T to temperatura.

Przewidywanie struktury: Aby rozpocząć obliczenia K*, konieczna jest trójwymiarowa struktura każdej sekwencji. Jest to realizowane przy użyciu funkcji Rosetta AbRelax,^53-55 będącej częścią pakietu oprogramowania Rosetta 3.4. Strategia algorytmu AbRelax opiera się na obserwacjach eksperymentalnych, zgodnie z którymi lokalna struktura białka jest modyfikowana, ale nie wyznaczona jednoznacznie przez lokalną sekwencję białka. Wykorzystano algorytm Monte Carlo do zastąpienia lokalnych struktur białkowych fragmentami strukturalnymi pochodzącymi z sekwencji. Metoda ta pozwala uzyskać końcowe, kompaktowe struktury białek, które uwzględniają oddziaływania nielokalne, takie jak zakopane reszty hydrofobowe, sparowane nici β oraz specyficzne oddziaływania łańcuchów bocznych.

Klasteryzacja: Struktury z AbRelax są następnie klastrowane na podstawie kątów φ i ψ przy użyciu OREO.^56,57 Ta metoda klastrowania pozwala wyłonić reprezentatywne struktury szkieletowe z całego zespołu strukturalnego. Do dokowania do białka docelowego wybiera się struktury średnie z dziesięciu największych klastrów oraz strukturę o całkowicie najniższej energii. Zapewnia to 11 unikalnych struktur szkieletowych dla każdej sekwencji peptydowej, co pozwala na uwzględnienie elastyczności szkieletu w procesie generowania zespołu.

Przewidywanie dokowania: Przewidywanie dokowania jest wykonywane przy użyciu programu RosettaDock.^58-60 Dla każdej sekwencji każda z 11 struktur szkieletu peptydowego jest dokowana do białka docelowego. W tym przypadku, ponieważ miejsce wiązania jest znane, peptydy są umieszczane w pobliżu miejsca wiązania i dopuszczalne jest ich przesunięcie o 3 Å prostopadle do miejsca wiązania, 8 Å równolegle do miejsca wiązania oraz obrót o 8°. RosettaDock wykorzystuje algorytm Monte Carlo do ruchów dokowania o niskiej i wysokiej rozdzielczości. Każdy proces dokowania generuje duży zespół struktur kompleksów. Dziesięć kompleksów o najniższej energii z każdego z 11 przebiegów służy jako struktury startowe w końcowym generowaniu zespołu konformacyjnego opartego na rotamerach (110 struktur startowych na sekwencję).

Generowanie końcowego ansamblu: RosettaDesign⁶¹ jest wykorzystywany do generowania końcowego ansamblu konformacyjnego opartego na rotamerach, ponieważ umożliwia on stworzenie wielu struktur poprzez samą regulację rotamerów w łańcuchach bocznych za pomocą funkcji fixbb. Do programu RosettaDesign wprowadza się szereg struktur startowych, a dla każdej z nich losowo wybierany jest aminokwas, którego rotamer ulega zmianie zgodnie z algorytmem Monte Carlo. Proces ten jest powtarzany do momentu przeprowadzenia tysięcy prób podstawienia rotamerów, co pozwala uzyskać końcową konformację o niskiej energii, która będzie wnosić znaczący wkład do funkcji partycji.

Aby wygenerować zespół peptydów, dziesięć struktur peptydowych o najniższej energii z każdego z dziesięciu największych klastrów oraz dziesięć struktur peptydowych o najniższej energii w całym zbiorze zostaje wykorzystanych jako struktury startowe dla RosettaDesign (łącznie 110 struktur startowych). Dla każdej struktury startowej generowanych jest 200 konformerów rotamerowych, co daje końcowy zespół 22 000 struktur (zbiór L w równaniu 6). Zespół ten uwzględnia zarówno elastyczność szkieletu, jak i elastyczność rotamerów.

Złożony zespół struktur generowany jest w podobny sposób, poprzez wykorzystanie 110 struktur wyjściowych z etapu przewidywania dokowania i wygenerowanie 200 konformerów rotamerowych dla każdej struktury wyjściowej. Końcowa wielkość zespołu wynosi 22 000 struktur (zbiór B w równaniu 6). Elastyczność uwzględniono poprzez zastosowanie różnych struktur szkieletu peptydowego, różnorodnych konformacji dokowania oraz konformerów rotamerowych dla każdej struktury wyjściowej.

Zestaw białek jest generowany poprzez uruchomienie programu RosettaDesign wyłącznie na strukturze białka docelowego. W tym przypadku dla pojedynczej struktury wyjściowej generowanych jest 2 000 konformacji rotamerów, zatem końcowy rozmiar zestawu wynosi 2 000 struktur (ustalenie F w równ. 6).

Białko WISDOM

Protein WISDOM, skrót od Protein Workbench for In Silico De novo design Of bioMolecules, to narzędzie online, które umożliwia społeczności akademickiej przyjazny dla użytkownika dostęp do naszego systemu projektowania białek de novo. Narzędzie to pozwala na realizację kilku powszechnie występujących celów projektowych, od projektowania pojedynczych łańcuchów białkowych przyjmujących strukturę wzorcową (template fold), po projektowanie nowych peptydów wiążących się z białkiem docelowym. Dwa kolejne rozdziały opisują możliwości Protein WISDOM w odniesieniu do dwóch głównych typów problemów projektowania białek. Pierwszy typ wykorzystuje dobór sekwencji do wyłonienia nowych sekwencji korzystnych dla danego wzorca projektowego, a następnie stosuje specyficzność fałdowania w celu walidacji tych nowych sekwencji. Drugi typ wykorzystuje dobór sekwencji do wyłonienia nowych sekwencji peptydu związanego w kompleksie, a następnie stosuje zarówno specyficzność fałdowania, jak i przybliżone obliczenia powinowactwa wiązania w celu walidacji nowych sekwencji.

Rejestracja użytkownika

Odwiedź stronę internetową Protein WISDOM pod adresem http://www.proteinwisdom.org.

Kliknij przycisk Logowania Użytkownika w prawym górnym rogu strony. Kliknij „Kliknij tutaj”, aby przejść do rejestracji.

Wypełnij informacje dotyczące adresu e-mail oraz żądanej nazwy użytkownika, a następnie kliknij kontynuuj.

Uzupełnij dodatkowe informacje dotyczące imienia i nazwiska, instytucji, grupy oraz adresu. Zaznacz pole wyboru, aby zaakceptować warunki użytkowania. Kliknij przycisk „Prześlij rejestrację”.

Etap pierwszy: Wybór sekwencji

Przesłanie sekwencji białka i struktury (struktur) szablonu

Kliknij przycisk Logowanie użytkownika, aby rozpocząć eksperyment projektowania białek. Użytkownikowi wyświetla się jego „Strona główna użytkownika” (Rysunek 3), na której znajduje się liczba przesłanych zadań, liczba przesłanych struktur (szablonów) oraz lista struktur przesłanych do tej pory.

Rozpocznij nowe zadanie projektowe, klikając „Create New Job”. Użytkownik zostanie przeniesiony na stronę „Job Submission” (Rycina 4). Nadaj zadaniu nazwę i określ, czy opiera się ono na poprzednim zadaniu (i.e. ten sam szablon projektu, zestawy mutacji i ograniczenia biologiczne mogą zostać zaimportowane do nowego zadania, przy czym użytkownik będzie miał możliwość zmodyfikowania zestawów mutacji oraz ograniczeń biologicznych). Kliknij „continue”.

Prześlij strukturę (struktury) białka szablonu projektowego (Rycina 5). Szablon ten musi być w standardowym formacie Protein Data Bank (PDB). Może to być szablon sztywny (jeden zestaw współrzędnych dla każdego atomu) lub szablon elastyczny (wiele modeli, np. uzyskanych z rozwiązań struktur NMR). W przypadku projektowania pojedynczego białka, w szablonie może znajdować się tylko jeden łańcuch. Użytkownik może przesłać nowy szablon lub wybrać z istniejących szablonów przesłanych wcześniej. Opcjonalnie wskaż identyfikator pdb szablonu, jeśli jest dostępny. W przypadku przesłania wielu szablonów upewnij się, że każdy model zaczyna się od "MODEL #" i kończy na "ENDMDL". Upewnij się, że każdy resztą jest wyznaczona przez naturalny aminokwas. Kliknij "Continue".

Po pomyślnym przesłaniu szablonu, Protein WISDOM wyświetli liczbę pozostałości, łańcuchów i modeli znalezionych w szablonie, wypisze sekwencję i poprosi użytkownika o zweryfikowanie szablonu. Jeśli struktura szablonu została wprowadzona poprawnie, potwierdź ją i kliknij „Continue”.

Po pomyślnym przesłaniu i potwierdzeniu szablonu użytkownik zostaje przeniesiony na „Główną stronę sterowania” (Rysunek 6). Na tej stronie użytkownik może sprawdzić status zadania, zmodyfikować zestawy mutacji oraz ograniczenia biologiczne, a następnie przekazać zadanie do Etapu pierwszego: Wyboru sekwencji. W tym momencie, ponieważ Etap pierwszy nie został jeszcze zakończony, opcje dla Etapu drugiego nie są dostępne. Pojawią się one po uzyskaniu wyników z Etapu pierwszego.

Wybór zestawów mutacji

Kliknij link „Mutation Sets” na „Main Control Page”, aby zdefiniować zestawy mutacji.

Wybierz reszty, które mogą ulec mutacji, oraz aminokwasy, na które mogą zostać przekształcone (Rysunek 7). Domyślnie dopuszczalne aminokwasy w danej pozycji są wybierane na podstawie dostępnej powierzchni kontaktu z rozpuszczalnikiem (SASA). Wymagane jest określenie zestawów mutacji.

Po wybraniu zestawów mutacji kliknij „Save Changes”. Użytkownik może kontynuować edycję zestawu mutacji. Po zakończeniu edycji zestawu mutacji kliknij, aby powrócić do „Main Control Page”.

Wybór ograniczeń biologicznych

Kliknij łącze „Biological Constraints” na „Main Control Page”, aby zdefiniować ograniczenia biologiczne.

Określ ograniczenia dotyczące ładunku lub zawartości aminokwasów w obrębie całego białka lub jego fragmentu (Rysunek 8).

W razie potrzeby ogranicz całkowitą liczbę dopuszczalnych mutacji. Ograniczenia biologiczne są opcjonalne. Po zakończeniu kliknij, aby powrócić do „Głównej strony sterowania”.

Przesłanie Etapu Pierwszego: Wybór Sekwencji

Kliknij łącze „Begin Stage 1”, aby przejść do strony „Submit Stage 1”.

Wybierz łańcuch do zaprojektowania (Rycina 9), liczbę sekwencji do wygenerowania, zależne od odległości pole siłowe oraz model. Jeśli projektowany jest kompleks i wymagane jest obliczenie specyficzności sfałdowania (Fold Specificity), należy wybrać tylko jeden łańcuch do zaprojektowania. Jeśli przesłany szablon był pojedynczą strukturą lub „szablonem sztywnym” (rigid template), dozwolony jest wyłącznie model Single Structure. Jeśli przesłany szablon jest elastyczny, użytkownik ma możliwość wyboru spośród trzech modeli: Single Structure, Weighted Average oraz Distance Bin. Należy zwrócić uwagę na złożoność obliczeniową optymalizacji do rozwiązania. Górna granica dopuszczalnej złożoności obliczeniowej wynosi 20²⁵.

Prześlij zadanie. Użytkownik zostanie przekierowany z powrotem do „Głównej strony sterowania” (Rysunek 10). Status zadania zostanie zaktualizowany, aby wskazać bieżący postęp prac. Po przesłaniu zadanie zostanie zablokowane przed edycją.

Po zakończeniu zadania użytkownik otrzymuje wiadomość e-mail z wynikami, które obejmują listę zaprojektowanych sekwencji. Wyniki są również widoczne na „Głównej stronie sterowania”. Na stronie pojawia się pole Etap 2: Specyficzność składania, umożliwiające użytkownikowi przeprowadzenie tej walidacji.

Etap drugi: Obliczenia specyficzności krotnej

Przesłanie specyficzności sfałdowania

Kliknij „Begin Stage 2: Fold Specificity”, aby przejść do strony „Build Stage 2”. Zdefiniuj górne i dolne granice odległości C^α-C^α, określając współczynnik elastyczności szablonu (Template flexibility factor) albo jako procent odległości, albo jako stałą odległość. Zdefiniuj górne i dolne granice kątów dla kątów dwuściennych φ i ψ, określając współczynnik elastyczności szablonu jako wartość procentową. Uwzględnij, że przy użyciu elastycznego szablonu górne i dolne granice odległości są przyjmowane jako najniższe i najwyższe wartości odległości we wszystkich modelach szablonu. Podobnie górne i dolne granice kątów są pobierane z najwyższych i najniższych wartości kątów we wszystkich modelach.

Kliknij przycisk „Submit”.

Określ liczbę struktur na sekwencję do wygenerowania i kliknij „Continue”. Należy pamiętać, że górna granica wynosi 500 struktur na sekwencję.

Kliknij „Kontynuuj”, aby potwierdzić zamiar przesłania do walidacji sfałdowania. Etap Pierwszy i Etap Drugi są zablokowane do edycji do momentu zakończenia Etapu Drugiego.

Po zakończeniu zadania użytkownik otrzymuje wiadomość e-mail z wynikami. Wyniki można wyświetlić w Protein WISDOM na „Głównej stronie sterowania” (Rycina 11). Tutaj można przejrzeć i pobrać pliki tekstowe zawierające zaprojektowane sekwencje, odpowiadające im wartości energii z etapu pierwszego (Stage One) oraz wartości specyficzności zwijania z etapu drugiego (Stage Two). Dodatkowo użytkownik może kliknąć łącze „View Results”, które wyświetla w przeglądarce tabelę z rankingami i wartościami energii z etapu pierwszego, a także rankingami i wartościami specyficzności zwijania z etapu drugiego.

Etap trzeci: Przybliżone obliczenia powinowactwa wiązania dla kompleksów białko-peptyd

Obliczenia przybliżonego powinowactwa wiązania służą do wyznaczenia powinowactwa zaprojektowanego białka/peptydu ligandu do pozostałej części kompleksu. Obliczenia te można przeprowadzić bezpośrednio po Etapie Pierwszym lub po zakończeniu obliczeń swoistości zwijania.

Kliknij „Sequence #”, aby wybrać sekwencję i rozpocząć przybliżone obliczanie powinowactwa wiązania. Użytkownik zostanie przekierowany do strony „Select Sequence”, na której znajduje się lista zaprojektowanych sekwencji wraz z ich rankingiem wyboru sekwencji oraz specyficzności fałdowania. Do przybliżonego obliczania powinowactwa wiązania można wybrać tylko jedną sekwencję naraz, ponieważ obliczenia te są bardzo wymagające pod względem mocy obliczeniowej. Po zakończeniu analizy danej sekwencji użytkownik może wybrać kolejną sekwencję do obliczenia przybliżonego powinowactwa wiązania, a wynik ten zostanie dodany do poprzedniego, wyświetlając przybliżone powinowactwo wiązania dla wszystkich przetworzonych sekwencji. Po wybraniu i zapisaniu sekwencji użytkownik zostanie przekierowany do „Main Control Page”.

Kliknij „Begin Stage 2: Approximate Binding Affinity”, aby wysłać zadanie. Po zakończeniu wyniki zostaną przesłane do użytkownika drogą mailową; wiadomość zawiera załącznik z numerem sekwencji, przybliżoną powinowactwem wiązania oraz wartościami funkcji partycji z równania 6. W przypadku każdego kolejnego zadania wyznaczania przybliżonego powinowactwa wiązania, plik ten będzie zawierał wyniki dla wszystkich ukończonych sekwencji. Pełne wyniki (z doboru sekwencji, specyficzności fałdowania i przybliżonego powinowactwa wiązania) można również przeglądać, przechodząc do „Main Control Page” dla danego zadania (Rysunek 12).

Wyniki

De Novo Projektowanie inhibitorów wejścia dla HIV-1

Struktura projektowania de novo zaimplementowana w Protein WISDOM została wykorzystana do zaprojektowania peptydów inhibitorowych dla kilku istotnych układów terapeutycznych (Tabele 1 i 2). Jednym z istotnych przykładów jest projektowanie peptydów hamujących wniknięcie HIV-1 do receptora CD4 w komórce gospodarza, który posłuży tutaj jako reprezentatywny układ do zademonstrowania praktycznego zastosowania interf...

Dyskusja

Ramy projektowania białek de novo składają się z dwóch etapów: etapu wyboru sekwencji i etapu walidacji. Struktura jest wystarczająco solidna, aby poradzić sobie ze sztywnymi i elastycznymi szablonami projektowymi i może być stosowana do projektowania pojedynczych białek lub złożonych projektów białkowych. Ramy te zostały z powodzeniem zastosowane w wielu układach białkowych z zastosowaniem w dziesiątkach chorób. Wiele z tych projektów zostało zweryfikowanych eksperymentalnie, dostarczając najsilniejszych inhibi...