Zmierzyliśmy spadek napięcia w aksonie, który został częściowo uszkodzony za pomocą laserowego dysektora, za pomocą jednoczesnego pomiaru spektroskopii siły wykonanego na optycznie uwięzionej sondzie przyklejonej do membrany aksonu. Opracowany protokół eksperymentalny ocenia adhezję aksonów do substratu hodowli.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar zwolnienia napięcia podczas uszkodzenia aksonu indukowanego laserem w celu oceny adhezji aksonów do podłoża z rozdzielczością pikontonów i milisekund
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Na tworzenie funkcjonalnych połączeń w rozwijającej się sieci neuronalnej wpływają zewnętrzne sygnały. Wzrost neurytów rozwijających się neuronów podlega sygnałom chemicznym i mechanicznym, a mechanizmy, za pomocą których wyczuwa i reaguje na sygnały mechaniczne, są słabo poznane. Wyjaśnienie roli sił w dojrzewaniu komórek umożliwi zaprojektowanie rusztowań, które mogą promować adhezję komórek i sprzężenie cytoszkieletu z substratem, a tym samym poprawić zdolność różnych typów neuronów do regeneracji po urazie.
Tutaj opisujemy metodę jednoczesnego stosowania pomiarów spektroskopii siły podczas indukowanej laserem zmiany komórek. Mierzymy uwalnianie napięcia w częściowo uszkodzonym aksonie poprzez jednoczesne interferometryczne śledzenie optycznie uwięzionej sondy przyklejonej do błony aksonu. Nasz eksperymentalny protokół wykrywa zwolnienie napięcia z czułością Piconewtona oraz dynamikę zwolnienia napięcia z rozdzielczością milisekundową. W związku z tym oferuje metodę o wysokiej rozdzielczości do badania, w jaki sposób sprzężenie mechaniczne między komórkami a substratami może być modulowane przez leczenie farmakologiczne i/lub przez odrębne właściwości mechaniczne substratu.
Wprowadzenie
Mikroskopia optyczna jest jednym z mniej inwazyjnych systemów obrazowania dostępnych do obserwacji żywych komórek. Dzięki wykorzystaniu takich efektów, jak ciśnienie promieniowania (jak w pęsetach optycznych1) lub strumień fotonów o wysokiej energii (jak w dyssektorze laserowym2), technologia ta została rozszerzona o nanomanipulację. System obrazowania optycznego zapewnia precyzyjną kontrolę w celu wizualizacji i manipulowania celami subkomórkowymi3. Jednocześnie, dzięki dokładnej kalibracji dostarczanej mocy lasera, narzędzia optyczne umożliwiają miękką lub inwazyjną manipulację próbką z niespotykaną dotąd powtarzalnością.
Kilka laboratoriów zintegrowało, w tym samym układzie eksperymentalnym, pęsety optyczne i laserowe dysektory w celu ablacji organelli4, łączenia ze sobą różnych komórek5 lub stymulowania komórek za pomocą optycznie sterowanych ładunków6,7. Podczas gdy pęseta optyczna, po kalibracji sztywności optycznej, pozwala na kontrolę siły przyłożonej do komórki w skali Piconewtona, systemy preparacji laserowej mogą modulować manipulację optyczną, która waha się od fotoporacji błony po ablację pojedynczych organelli lub rozwarstwienie struktur subkomórkowych. Jednak kalibracja preparacji laserowej opiera się na jakościowej ocenie jednostki manipulacji optycznej w odniesieniu do energii dostarczanej do próbki, głównie w oparciu o analizę obrazu ilustrującą zmiany morfologiczne spowodowane w próbce8. W prezentowanej metodzie pokazujemy, jak wykonać pomiar spektroskopii sił podczas laserowej sekcji aksonalnej rozwijającego się neuronu, w celu ilościowego określenia, w skali Piconewtona, siły wytwarzanej przez zmienioną równowagę w strukturze cytoszkieletu przedziału subkomórkowego9. Wyhodowane neurony przylegają do podłoża i polaryzują się podczas rozwoju. Faza polaryzacji zachodzi w ciągu pierwszych pięciu dni in vitro. W drugim etapie polaryzacji jeden z wytłaczających neurytów staje się dłuższy i różnicuje się, stając się aksonem10. Wydłużenie aksonów w odpowiedzi na siłę ciągnącą na stożku wzrostu było wcześniej modelowane przez model11 Dennerla. Ostatnio model ten został rozszerzony12 o rolę adhezji neurytów do substratów macierzy zewnątrzkomórkowej. Ten model biofizyczny, zaproponowany po obserwacjacheksperymentalnych13, wykazał, że siły ciągnące na stożek wzrostu, rozchodzący się wzdłuż neurytu, są modulowane przez ogniskowe przylegania do podłoża. Podobnie uszkodzenie aksonów powoduje miejscowe uwolnienie napięcia rozchodzącego się w kierunku ciała komórki. W związku z tym zaproponowaliśmy, że pomiar takiego uwolnionego napięcia w miejscu wzdłuż aksonu między zmianą a somą komórkową daje możliwość oceny wyniku tłumienia nienaruszonych zrostów ogniskowych.
Kalibrujemy niezbędny strumień fotonów energii w dyssektorze laserowym, aby kontrolować zakres zadanych uszkodzeń aksonów, od całkowitego przecięcia do częściowego uszkodzenia. Po kalibracji powtórzyliśmy częściowe uszkodzenie aksonów kilku różnicujących się neuronów i opracowaliśmy protokół ilościowego określenia uwalniania napięcia, a tym samym uzyskaliśmy parametr ilościowy do oszacowania adhezji aksonu do substratu14.
W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy opracowany protokół, który stanowi precyzyjną procedurę eksperymentalną do oceny i porównania z czułością pikonewtona adhezji aksonalnej do podłoża w różnych warunkach eksperymentalnych, takich jak leczenie chemiczne14, lub różne rodzaje wspomagania hodowli komórkowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Konfiguracja optyczna
Cały system optyczny został opisany wcześniej15. Krótko mówiąc, system pęsety optycznej oparty jest na laserze światłowodowym iterbowym o fali ciągłej (CW) pracującym przy długości fali 1064 nm (IPG Laser GmbH). Przestrzenny modulator światła (SLM) (LCOS-SLM, model X10468-07 - Hamamatsu) zmienia fazę przychodzącej wiązki laserowej IR, aby kontrolować położenie punktu skupienia pułapki na czaszy hodowlanej za pomocą hologramów generowanych komputerowo. Ogólnodostępne oprogramowanie Blue-tweezers (link do strony internetowej na stole ze sprzętem) generowało hologramy rzutowane na przestrzenny modulator światła. Interferometr do pomiarów spektroskopii sił oparto na fotodiodzie czterokwadrantowej (QPD, S5980 z płytką C5460SPL 6041 - Hamamatsu) oraz fotodiodzie (PD, PDA100A-EC - Thorlabs).
Źródłem analizy laserowej był pulsacyjny sub-nanosekundowy laser UV Nd:YAG o długości fali 355 nm (PNV-001525-040, PowerChip nano-Pulse UV laser - Teem Photonics). Modulator akustyczno-optyczny (MQ110-A3-UV, 355 nm topiona krzemionka -AA-Opto-electronic) sterował mocą lasera UV dostarczanego do próbki.
Holograficzna pęseta optyczna i laserowa mikro-dyssektoryzacja zostały zintegrowane na zmodyfikowanym mikroskopie pionowym (BX51 - Olympus) wyposażonym w obiektyw do zanurzania wody 60X, 0,9 NA. Stolik mikroskopu składa się z 3-osiowego liniowego systemu mikropozycjonowania z silnikiem prądu stałego (M-126. CG1, Physics-Instruments) z oddzielnym 3-osiowym piezoelektrycznym nano-stolikiem pozycjonującym (P-733.3DD, Physics-Instruments) w celu połączenia zgrubnego ruchu próbki z sub-nanometrową rozdzielczością stopnia piezo-dentystycznego. System stolika mikroskopowego został wyposażony w dwie pętle sterujące działające synergistycznie w celu utrzymania punktu ostrości pułapki we właściwej pozycji, w zależności od wybranego trybu pracy (pozycja lub zacisk siłowy, statyczny lub dynamiczny)16. W szczególności wewnętrzna pętla sprzężenia zwrotnego działa na stopień piezoelektryczny, aby utrzymać koralik w wybranej odległości od środka pułapki. Druga zewnętrzna pętla kontroluje położenie zmotoryzowanego stopnia, aby wykorzystać obszar rozpięty przez siłownik piezoelektryczny na większej powierzchni niż jego dostępny skok17. Gdy stopień piezoelektryczny osiągnie granicę dostępnego skoku w jednym kierunku, zewnętrzna pętla przesuwa mikrostopień w przeciwnym kierunku, dzięki czemu piezostopień wraca do swojej pozycji środkowej, ponieważ śledzi uwięziony koralik przylegający do próbki. Kiedy stopień piezoelektryczny osiąga centralne położenie swojego zakresu kursu, stopień mikro zatrzymuje się. Więcej szczegółów na temat systemu można znaleźć w Guiggiani et al16,17.
A Urządzenie Peltiera (QE1 grzałka rezystancyjna z dwukanałowym sterownikiem grzałki TC-344B - Warner Instruments) kontroluje temperaturę hodowli komórkowej pod mikroskopem (37 °C). W hodowli pH i wilgotność utrzymywano w warunkach fizjologicznych poprzez napowietrzanie specjalnie zaprojektowanej tulei z polidimetylosiloksanu (PDMS) (integrującej obiektyw mikroskopu) z nawilżanym karbogenem (95%O2, 5%CO2).
2. Przygotowanie hodowli komórkowej
Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia. Pierwotne kultury uzyskano z hipokampów myszy (C57BL6J, Charles River) w 18 dniu embrionalnym (E18).
- Neurony zostały posiane w stężeniu 25 000 komórek/ml na szalkach Petriego ze szklanym dnem (P35G-0-14-C - MaTek Corporation). Niskie stężenie hodowanych komórek jest konieczne, aby uniknąć tworzenia się gęstej sieci już w pierwszych dniach in vitro. Przy wspomnianym stężeniu komórek prawdopodobieństwo znalezienia izolowanych komórek z dłuższym neurytem niepołączonych z innymi komórkami jest znacznie wyższe.
3. Powłoka koralikowa
- Mikrosfery polimerowe (Ø 4 μm, zakończone COOH - Bangs Laboratories, kod produktu PC05N/6700) zostały pokryte poli-D-lizyną zgodnie z procedurą opisaną w zestawie sprzęgającym białka polyLink (Polysciences, kod produktu 19539). Koraliki są pokryte tą samą cząsteczką, która służy do pokrycia podłoża hodowli i sprzyjania adhezji komórek.
4. Wybierz Izolowany Neuron. Odłącz koralik od podłoża hodowlanego, złap go i przesuń obok neuronu
- Umieść szalkę Petriego na mikroskopie stage. Po ustawieniu ostrości na próbce za pomocą ruchu stolika, skoryguj położenie kondensatora obiektywu oświetlającego, aby ustawić oświetlenie Kohlera. Ustawienie optyki oświetlenia w celu ustawienia warunków oświetlenia Kolhera jest konieczne w celu poprawy jakości obrazowania w jasnym polu. Korzystając z takich warunków wyrównania, konieczne jest również zmaksymalizowanie wydajności zbierania lasera w podczerwieni (poprzez kondensator obiektywu), z rozpraszającej sondy uwięzionej, w celu przeprowadzenia jej śledzenia interferometrycznego przez QPD i PD.
- Odpipetować kilka μl powlekanego roztworu podstawowego mikrosfery do szalki hodowlanej. Mikrosfery będą osadzać się i przylegać do podłoża hodowlanego. Liczba μl wstrzykniętych do szalki hodowlanej zależy od stężenia mikrosfery w roztworze podstawowym. Idealnym warunkiem jest posiadanie od jednej do dwóch mikrosfer w każdym polu widzenia obrazowania. Kiedy do naczynia hodowlanego dodaje się zbyt wiele mikrosfer, mogą one już losowo przyczepiać się do hodowanych neuronów.
- Poruszaj się w naczyniu hodowlanym, szukając izolowanego neuronu z dłuższym neurytem (aksonem) i zapisz pozycję stolika mikroskopu.
- Poruszaj się i szukaj koralika przylegającego do podpory kultury.
- Włącz laser wychwytujący podczerwień. Na tym etapie na SLM nie są rzutowane żadne hologramy, a położenie plamki lasera IR pokrywa się z położeniem plamki lasera UV. Ustaw położenie osiowe plamki IR 2-3 μm nad powierzchnią podparcia hodowli za pomocą ruchu stolika mikroskopu.
- Ustaw moc lasera UV dostarczaną do próbki na mniej niż 1 μW. Dyssektor laserowy UV został wcześniej skalibrowany14:
5-6 μW szklany wspornik jest ablowany
4 μW połączenie neuronalne jest całkowicie rozcięte
2,5 μW neuryt jest częściowo uszkodzony
‹ 1 μW w naczyniu hodowlanym wytwarzana jest fala uderzeniowa. Optyczna fala uderzeniowa jest wystarczająco silna, aby oderwać koralik od szklanego wspornika. - Włącz laser UV, pozostawiając włączony laser na podczerwień i przesuń plamkę UV nad przyklejony koralik za pomocą mikroskopu stage ruch. Koralik odrywa się od powierzchni i zostaje uwięziony przez laser IR. Następnie wyłącz laser UV.
- Przesuń uwięziony koralik kilka mikrometrów nad szklaną podstawkę (20-30 μm). Podniesienie koralika do tej pozycji zapobiegnie jego kontaktowi z innymi komórkami, gdy jest przesuwany w kierunku wcześniej wybranego neuronu. Przesuń ścieg do poprzednio zapisanej pozycji stołu montażowego. Ustaw prędkość stolika na niską wartość (10 μm/s), aby siła płynu oporu nie przekraczała siły pułapki optycznej.
5. Przesuń pozycję pułapki w stosunku do punktu dyssektorowego lasera i pozycji aksonu za pomocą hologramu wygenerowanego komputerowo i skalibruj sztywność pęsety optycznej
- Przesuń koralik w kierunku szklanej podpory, aby wyświetlić akson. Koralik jest trzymany nad komórką, aby uniknąć kontaktu z nią (około 5 μm nad szklanym wspornikiem).
- Przesuń stolik mikroskopu, aby przesunąć punkt ostrości UV na środku szerokości aksonu. Zapisz bieżącą pozycję etapu.
- Przesuń pozycję punktu ostrości w podczerwieni za pomocą hologramu wygenerowanego komputerowo. Na tym etapie etap zostaje zatrzymany w pozycji wybranej w poprzednim kroku. Kiedy wygenerowany komputerowo hologram jest rzutowany na SLM, uwięziony koralik jest przesuwany względem aksonu. Przesuwamy plamkę lasera IR, aby uwięziony koralik był wyrównany w środku neurytu, a plamka lasera UV również była wyśrodkowana na tym samym neurycie. Plamka IR, a tym samym uwięziona kulka, są umieszczone wzdłuż neurytu w odległości 5-10 μm od plamki UV. Przesuwamy położenie IR w stosunku do plamki UV w zależności od geometrii neurytów. W przypadku, gdy pęseta optyczna nie jest wyposażona w system SLM, pozycja może być zmieniana poprzez uchylne lustra lub akustyczne deflektory optyczne na torze optycznym IR. Plamka lasera IR może być umieszczona w odległości 5-10 μm od plamki UV, aby uniknąć optycznej interakcji wiązki preparacyjnej z uwięzioną sondą, co mogłoby wpływać na jej ruch Browna i zmieniać ślady spektroskopii sił.
- Po zdefiniowaniu nowej pozycji plamki IR w odniesieniu do plamki UV i pozycji aksonu, przesuń stolik, aby ustawić uwięziony koralik z dala od aksonu i uniknąć kolizji z nim. Przesunąć położenie osiowe uwięzionego koralika na około 2 μm powyżej szkła nakrywkowego.
- Wyrównaj QPD, aby wyśrodkować na nim prążki interferencyjne: sygnały różnicowe x i y QPD są zerami, gdy QPD jest wyśrodkowany. Uzyskaj 5 sekund ruchu Browna uwięzionego koralika za pomocą interferometru, przy częstotliwości próbkowania 50 kHz. Sztywność (pN/nm) i czułość (V/nm) pułapki optycznej należy obliczyć metodąwidma mocy 18.
6. Przymocuj koralik do Axonu. Wykonaj aksotomię i jednoczesny pomiar siły
- Podnieś pozycję uwięzionego koralika o około 4 μm ponad szkło nakrywkowe i przesuń go do poprzednio zapisanej pozycji stage (patrz krok 3.2).
- Przesuń uwięziony koralik w dół w kierunku aksonu, aż zetknie się z neurytem. Zderzenie między uwięzionym koralikiem a aksonem jest monitorowane przez sygnał z QPD wykrywający przemieszczenie uwięzionego koralika w kierunku osiowym.
- Odczekaj 10 sekund z uwięzionym koralikiem dociśniętym do aksonu, aby sprzyjać jego przyleganiu do błony neurytowej.
- Przesuń mikrostopień, aby przemieścić uwięziony koralik z aksonu, a tym samym zweryfikować jego przyleganie do błony komórkowej. Jeśli koralik przylgnie, wydostaje się z pułapki optycznej.
- Cofnij pułapkę laserową na przyklejonym ściegu i włącz pętlę zacisku siłowego z warunkiem siły równym zero. W ten sposób stopień piezo-stolikowy przestawia koralik, przymocowany do komórki, na środku pułapki optycznej. Jeśli system nie jest wyposażony w sterowanie pętlą sprzężenia zwrotnego, położenie pułapki laserowej można przesunąć za pomocą stolika mikroskopu, aby wyśrodkować ją na przylegającej sondzie. Środek pułapki jest osiągany, gdy sygnały QPD są takie same, jak wtedy, gdy koralik jest uwięziony i nie przylega do komórki (sygnały x i y QPD równe zero, a sygnał z QPD daje taką samą sumę napięcia z czterech kwadrantów, jak wtedy, gdy koralik jest uwięziony daleko od jakiejkolwiek powierzchni).
- Ustaw warunek siła-zacisk na osi z, ustawiając laser pułapkujący nieco powyżej środka ściegu (około 100 nm), aby wytworzyć naprężenie wstępne na przylegającej uwięzionej sondzie. W przypadku, gdy system nie jest wyposażony w regulator siły zaciskowej, pozycja pułapki optycznej może być podniesiona do góry w krokach co 25 nm za pomocą stolika mikroskopu. Sygnał z QPD umożliwia monitorowanie. Dlatego użyj tego sygnału, aby ustawić pozycję pułapki laserowej w stosunku do przylegającej sondy. Takie napięcie wstępne jest potrzebne do wyczucia naprężenia błony po uszkodzeniu aksonalnym, a w konsekwencji zmniejszenia ruchu Browna przylegającej sondy. Podobne podejście zaproponowano do pomiaru uwalniania napięcia w uwięzi membranowej za pomocą obrazowania wideo19.
- Wyłączyć sprzężenie zwrotne siła-zacisk, aby zmierzyć siłę działającą na przylegającą sondę w stanie położenia-cęgowego (stopień piezo-stojący jest zablokowany).
- Rozpocznij jednoczesny zapis pozycji uwięzionej sondy za pomocą interferometru (częstotliwość próbkowania 20 kHz) i komórki podczas laserowego obrazowania poklatkowego w jasnym polu aksotomii (częstotliwość odświeżania 20 Hz).
- Włącz laser UV, aby dostarczać impulsy laserowe, aż zmiana stanie się widoczna na obrazie aksonu (zwykle potrzeba 200-400 impulsów optycznych. Energia na impuls: 25 nJ), a następnie wyłącz laser UV.
- Kontynuuj rejestrację za pomocą interferometru przez około 3 minuty, aż ślady x, y i z QPD osiągną plateau.
7. Określ ilościowo całkowite uwolnienie napięcia
- Przelicz zarejestrowane ślady QPD (w woltach) przez skalibrowaną czułość pułapki optycznej, aby uzyskać odpowiednie ślady w nanometrach.
- Przefiltruj ślady przemieszczenia x, y i z za pomocą filtra górnoprzepustowego z odcięciem przy 10 Hz.
- Oblicz całkowitą wariancję przefiltrowanych ścieżek reprezentujących ruch Browna uwięzionego koralika. Obliczanie wariancji w krokach co 25 ms dla nakładających się okien czasowych wynoszących 500 ms (10 000 punktów danych)20. Filtrowanie górnoprzepustowe śladów wyklucza zmiany ruchu Browna spowodowane fluktuacją błony lub ruchem aktyny korowej. Ruch Browna koralika jest redukowany przez siły optyczne i siły adhezji na błonie komórkowej. Kiedy błona jest napięta z powodu uwolnienia napięcia, jej lepkość wzrasta, a tym samym ruch Browna koralika, wykryty natychmiast po aksotomii, zaczyna się zmniejszać.
- Zdefiniuj t0: początek spadku wariancji ruchów Browna, po dostarczeniu energii lasera UV. Czas chwilowy t0 wskazuje początek odkształcenia błony.
- Zdefiniuj t1: koniec spadku wariancji ruchu Browna (gdy osiągnie plateau). Chwilowy czas t1 wskazuje koniec odkształcenia błonowego.
- Wykonaj śledzenie wideo zanieczyszczeń lub zadrapań na wsporniku szkła nakrywkowego, aby zmierzyć dryf próbki podczas pomiaru siły. Aby śledzić cząstkę na szklanym podłożu, najpierw stosujemy progi do obrazów w jasnym polu, aby uzyskać stos obrazów binarnych z cząstką w kolorze białym na czarnym tle. Następnie śledzimy środek masy cząstek z dokładnością subpikselową (za pomocą darmowego oprogramowania ImageJ).
- Odejmij zmierzony dryft od śladów QPD przemieszczenia. Pomnóż ślady QPD z korekcją dryftu przez odpowiednią skalibrowaną sztywność optyczną (kx, ky, kz), aby otrzymać ślady Fx, Fy, Fz w pikonewtonach.
- Oblicz całkowity ślad siły jako Ftot = √(Fx2 + Fy2 + Fz2).
- Oblicz całkowite zwolnienie siły między t0 a t1 jakozwolnione F = Ftot(t1) - Ftot(t0). Siła zmierzona w t0 musi zostać odjęta, ponieważ jest spowodowana przemieszczeniem sondy od środka pułapki, gdy koralik przylega do neurytu.
- Oblicz obszar kontaktu neurytu między uwięzionym koralikiem a położeniem plamki lasera UV: na obrazie jasnego pola zmierz długą (L) i krótką (D) oś neurytu między uwięzionym koralikiem a pozycją plamki lasera UV. Powierzchnia styku aksonu toakson A = L x D.
- Znormalizuj całkowitą uwolnioną siłę Fuwolnioną przez obszar kontaktuaksonu A aksonu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Komórka generuje siły trakcyjne na podłożu za pomocą swoich adhezji ogniskowych. Siły generowane przez elementy cytoszkieletu znajdują się w równowadze z przeciwdziałającą im siłą podłoża hodowlanego. Po wywołaniu laserem uszkodzenia neurytu, niektóre z napiętych włókien cytoszkieletu ulegają przerwaniu, a ich zrównoważone napięcie zostaje zwolnione, ponieważ znika przeciwstawna siła adhezji do podłoża. Zwolnione napięcie jest częściowo rozkładane na nienaruszone adhezje ogniskowe, a przytwierdzona do błony komórkowej ku...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy przedstawiono ilościową metodę porównania adhezji neurytów do substratu hodowli, wykonując jednoczesny pomiar spektroskopii sił podczas indukowanej laserem zmiany komórkowej. Zmierzone uwolnienie napięcia jest związane ze stopniem przylegania komórki do podłoża: komórki o większej liczbie zrostów ogniskowych powinny uwalniać mniejsze napięcie. Pomiar uwolnienia napięcia w kategoriach pikonewtonów dostarcza wielkości fizycznej, za pomocą której można ocenić adhezję aksonalną do podłoża hodowli w różnych...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Alberto Guiggiani za opracowanie systemu kontroli czasu rzeczywistego, Evelina Chieregatti i Hanako Tsushima za wnikliwe dyskusje, Giacomo Pruzzo i Alessandro Parodi za rozwój niestandardowej elektroniki i oprogramowania, a także Claudia Chiabrera i Marina Nanni za ich fachowe porady i pomoc w przygotowaniu hodowli komórkowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODCZYNNIKI | |||
| Mikrosfery polimerowe, 4 μ m, | Laboratoria Bangs | PC05N/6700 | |
| Zestaw sprzęgający białko PolyLink | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| Laser IR | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | iterbowy laser światłowodowy o fali ciągłej (CW) pracujący przy 1064 nm, z polaryzacją liniową |
| Przestrzenny modulator światła | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Oprogramowanie do niebieskiej pęsety | Grupa optyczna, Uniwersytet w Glasgow | Darmowe oprogramowanie do pobrania | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | Hamamatsu | Darmowe oprogramowanie | do pobraniahttp://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 z płytą C5460SPL 6041 | Czterokwadrantowa fotodioda do pomiaru x i y uwięzionej sondy przemieszczenie |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Fotodioda do pomiaru z uwięziona sonda |
| nano-pulsacyjny laser UV | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Impulsowy laser UVA, długość impulsu 400 ps |
| Akustyczny modulator optyczny | Olympus | MQ110-A3-UV, 355nm topiona krzemionka | |
| Mikroskop pionowy | Andor | BX51 | Wyposażony w obiektyw do zanurzania w wodzie 60, 0,9 NA, |
| CCD | Warner Instruments | EMCCD | |
| Physic Instruments | Ogrzewanie rezystancyjne QE1 z dwukanałową grzałką TC-344B kontroler | ||
| Stolik mikroskopu: mikro + stolik piezoelektryczny | National Instruments | Trzy stopnie liniowe M-126. CG1 z oddzielnym 3-osiowym piezoelektrycznym stolikiem nano-pozycjonującym P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Uzyskiwanie pozycji x, y, z uwięzionej sondy i wysyłanie sygnałów pętli sprzężenia zwrotnego do stolika mikroskopu | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) | System pętli sprzężenia zwrotnego w czasie rzeczywistym, do sterowania pozycją stopnia, opracowany na dedykowanym pulpicie komputera |
Bibliografia
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O'Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
