W ostatnich latach tworzenie komórek rozrodczych przy użyciu metod hodowli in vitro zostało zademonstrowane przy użyciu kilku różnych typów somatycznych komórek macierzystych. W tym artykule wizualnie przedstawimy różnicowanie nowonarodzonych komórek macierzystych pochodzących od myszy do wczesnych komórek podobnych do oocytów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Różnicowanie komórek macierzystych pochodzących ze skóry nowonarodzonych myszy w komórki rozrodcze podobne do komórek rozrodczych in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie powstawania i różnicowania komórek rozrodczych było tradycyjnie bardzo trudne ze względu na małą liczbę komórek i ich lokalizację głęboko w rozwijających się zarodkach. Dostępność "zamkniętego" systemu opartego na in vitro może okazać się nieoceniona dla naszego zrozumienia gametogenezy. Tworzenie komórek podobnych do oocytów (OLC) z somatycznych komórek macierzystych, wyizolowanych ze skóry nowonarodzonych myszy, zostało zademonstrowane i może być wizualizowane w tym protokole wideo. Powstałe OLC wyrażają różne markery zgodne z oocytami, takimi jak Oct4 , Vasa , Bmp15 i Scp3. Jednak pozostają niezdolne do dojrzewania lub zapłodnienia z powodu nieukończenia mejozy. Protokół ten zapewni system, który jest przydatny do badania wczesnego etapu powstawania i różnicowania się komórek rozrodczych w bardziej dojrzałe gamety. Podczas wczesnego różnicowania liczba komórek wykazujących ekspresję Oct4 (potencjalne komórki rozrodcze) osiąga ~5%, jednak obecnie tworzenie OLC pozostaje stosunkowo nieefektywne. Protokół jest stosunkowo prosty, chociaż należy zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że początkowa populacja komórek jest zdrowa i we wczesnym okresie przejścia.
Wprowadzenie
Podczas wczesnej embriogenezy, gametogeneza zachodzi poprzez szereg etapów, w tym tworzenie pierwotnych komórek rozrodczych (PGC), migrację i w końcu kolonizację grzbietów gonad. W tym czasie PGC ulegają proliferacji i różnicowaniu w coraz bardziej dojrzałe gamety 1. Fakt, że PGC migrują z podstawy allantois do zarodka jelita tylnego, a na końcu wzdłuż ściany grzbietowej, ostatecznie kolonizując grzbiety gonad, sprawia, że są one niezwykle trudne do zbadania 2. Pomimo postępów w tej dziedzinie, badania mające na celu zrozumienie powstawania i różnicowania PGC były utrudnione ze względu na ich ograniczoną liczbę, lokalizację i charakter migracyjny....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie mediów
- Przygotuj pożywkę na 2-3 godziny przed użyciem i umieść z poluzowaną nakrętką w inkubatorze do hodowli komórkowych, w którym będzie się odbywał eksperyment. Nośniki używane w niniejszym protokole:
- Przygotować pożywkę z komórek macierzystych składającą się z DMEM/F12 uzupełnioną 1 x B27, 40 ng/ml bFGF i 20 ng/ml EGF.
- Przygotować pożywkę do różnicowania komórek rozrodczych składającą się z m199 uzupełnionego 0,05 j.m. FSH, 0,03 j.m. LH, 3 mg/ml BSA, 5 μl/ml ITS, 0,23 mM pirogronianu sodu, 1 mg/ml fetuiny i 1 ng/ml EGF. Pożywka bazowa składająca się ze wszystkich dodatków, ale z pominięciem FSH, L....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Początkowo komórki przywierają do dna naczynia hodowlanego i rozprzestrzeniają się. W 42-72 godzinie różnicowania tworzą się i proliferują małe, zawieszone komórki wykazujące pozytywną ekspresję OCT4 (Rycina 1A). Wkrótce po pojawieniu się tych komórek większość z nich znika, a komórki przywierające tworzą gęste agregaty kolonii na dnie hodowli. Po kilku dniach agregaty te odrywają się od powierzchni hodowli. W niektórych z tych agregatów można zaobserwować dużą komórkę (Rycina 1b i
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Do tej pory funkcjonalne OLC nie zostały opracowane przy użyciu testu całkowicie in vitro. Niedawne badanie przeprowadzone przez Hayashi i wsp. było w stanie wyprodukować potomstwo z komórek podobnych do PGC utworzonych in vitro i przeniesionych in vivo w celu dalszego rozwoju14. Zaczynając od komórek ES lub indukowanych komórek pluripotencjalnych, były one w stanie tworzyć komórki podobne do PGC, które po odzyskaniu po przeszczepieniu in vivo były w stanie dojrzeć,.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
PWD jest wspierane przez stypendium Canadian Institutes of Health Research (CIHR) oraz grant CIHR dla Geralda M. Kiddera na Western University. Autor pragnie również podziękować Julang Li z Uniwersytetu w Guelph za pomoc w opracowaniu przedstawionego tutaj protokołu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Pirogronian sodu | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| Płytki 24-dołkowe | Nunc | 144530 | |
| Naczynia 10 cm | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml dętki | BD | 352095 |
Bibliografia
- van den Hurk, R., Zhao, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).
- Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. Time-lapse analysis of living ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
