Różnicowanie komórek macierzystych pochodzących ze skóry nowonarodzonych myszy w komórki rozrodcze podobne do komórek rozrodczych in vitro

Podsumowanie

W ostatnich latach tworzenie komórek rozrodczych przy użyciu metod hodowli in vitro zostało zademonstrowane przy użyciu kilku różnych typów somatycznych komórek macierzystych. W tym artykule wizualnie przedstawimy różnicowanie nowonarodzonych komórek macierzystych pochodzących od myszy do wczesnych komórek podobnych do oocytów.

Streszczenie

Badanie powstawania i różnicowania komórek rozrodczych było tradycyjnie bardzo trudne ze względu na małą liczbę komórek i ich lokalizację głęboko w rozwijających się zarodkach. Dostępność "zamkniętego" systemu opartego na in vitro może okazać się nieoceniona dla naszego zrozumienia gametogenezy. Tworzenie komórek podobnych do oocytów (OLC) z somatycznych komórek macierzystych, wyizolowanych ze skóry nowonarodzonych myszy, zostało zademonstrowane i może być wizualizowane w tym protokole wideo. Powstałe OLC wyrażają różne markery zgodne z oocytami, takimi jak Oct4 , Vasa , Bmp15 i Scp3. Jednak pozostają niezdolne do dojrzewania lub zapłodnienia z powodu nieukończenia mejozy. Protokół ten zapewni system, który jest przydatny do badania wczesnego etapu powstawania i różnicowania się komórek rozrodczych w bardziej dojrzałe gamety. Podczas wczesnego różnicowania liczba komórek wykazujących ekspresję Oct4 (potencjalne komórki rozrodcze) osiąga ~5%, jednak obecnie tworzenie OLC pozostaje stosunkowo nieefektywne. Protokół jest stosunkowo prosty, chociaż należy zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że początkowa populacja komórek jest zdrowa i we wczesnym okresie przejścia.

Wprowadzenie

Podczas wczesnej embriogenezy, gametogeneza zachodzi poprzez szereg etapów, w tym tworzenie pierwotnych komórek rozrodczych (PGC), migrację i w końcu kolonizację grzbietów gonad. W tym czasie PGC ulegają proliferacji i różnicowaniu w coraz bardziej dojrzałe gamety ¹. Fakt, że PGC migrują z podstawy allantois do zarodka jelita tylnego, a na końcu wzdłuż ściany grzbietowej, ostatecznie kolonizując grzbiety gonad, sprawia, że są one niezwykle trudne do zbadania ². Pomimo postępów w tej dziedzinie, badania mające na celu zrozumienie powstawania i różnicowania PGC były utrudnione ze względu na ich ograniczoną liczbę, lokalizację i charakter migracyjny ^3,4.

W ostatnich latach wykazano, że embrionalne komórki macierzyste mają potencjał do tworzenia komórek rozrodczych in vitro ^5,6. Podobnie, wykazano również, że kilka somatycznych komórek macierzystych ma potencjał do tworzenia komórek rozrodczych po hodowli in vitro ^7-11. Niedawno komórki macierzyste wyizolowane ze skóry nowonarodzonych myszy zróżnicowano in vitro w komórki rozrodcze i oocyty we wczesnym stadium ^{rozwoju 12}. W trakcie różnicowania zwiększył się podzbiór komórek macierzystych wykazujących ekspresję Oct4 i powstały struktury przypominające kompleksy wzgórek-oocyt. Komórki podobne do oocytów (OLC) można pobrać z kultur i porównać z naturalnymi oocytami. Za pomocą tej metody hodowli uzyskuje się OLC o wielkości 40-45 μm, które wyrażają podobne markery do oocytów, takich jak Gdf9b, VASA i DAZL. Do tej pory powstałe OLC nie są w stanie dojrzeć ani zostać zapłodnione ¹².

Chociaż OLC nadal nie są w stanie funkcjonować, protokół używany do tworzenia tych OLC może nadal być użyteczny jako test do badania powstawania i rozwoju komórek rozrodczych na wczesnym etapie w zamkniętym systemie in vitro. W oryginalnej publikacji omawiającej tworzenie OLC z somatycznych komórek macierzystych wykorzystano skórę płodu świni jako źródło komórek macierzystych ⁸. Rozszerzając to badanie, wykazano, że komórki podobne do PGC, które powstały wcześnie podczas indukowanego różnicowania, są prekursorami OLC i wyrażają takie markery PGC, jak OCT4, VASA, STELLA, C-KIT i DAZL ¹³. Dane te potwierdzają potencjał wykorzystania tego systemu do badania powstawania i różnicowania komórek rozrodczych in vitro. Protokół wykorzystany do tworzenia OLC ze skóry nowonarodzonej myszy zostanie zademonstrowany w tym artykule wideo. Protokół ten oferuje model in vitro do badania rozwoju komórek rozrodczych, który może dostarczyć środków do wyjaśnienia czynników ważnych dla ich proliferacji i różnicowania.

Protokół

1. Przygotowanie mediów

1. Przygotuj pożywkę na 2-3 godziny przed użyciem i umieść z poluzowaną nakrętką w inkubatorze do hodowli komórkowych, w którym będzie się odbywał eksperyment. Nośniki używane w niniejszym protokole:
   1. Przygotować pożywkę z komórek macierzystych składającą się z DMEM/F12 uzupełnioną 1 x B27, 40 ng/ml bFGF i 20 ng/ml EGF.
   2. Przygotować pożywkę do różnicowania komórek rozrodczych składającą się z m199 uzupełnionego 0,05 j.m. FSH, 0,03 j.m. LH, 3 mg/ml BSA, 5 μl/ml ITS, 0,23 mM pirogronianu sodu, 1 mg/ml fetuiny i 1 ng/ml EGF. Pożywka bazowa składająca się ze wszystkich dodatków, ale z pominięciem FSH, LH i EGF, może być przygotowana i przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.

2. Przygotowanie hodowli komórek macierzystych

1. Wyizoluj komórki macierzyste od nowonarodzonych młodych myszy, jak opisano wcześniej¹². Wykorzystaj komórki macierzyste w pasażu 2-4 do różnicowania komórek rozrodczych in vitro. Efektywność tworzenia OLC jest bezpośrednio związana z jakością wyjściowych komórek macierzystych. Najlepiej jest rozpocząć różnicowanie, gdy tylko populacja wydaje się czysta i zdrowa, co zwykle ma miejsce około pasażu 2. Dalsza hodowla komórek macierzystych po pasażu 2 negatywnie wpływa na efektywność tworzenia OLC (wyniki niepublikowane).
2. 48 godzin przed rozpoczęciem subhodowli różnicowania komórek macierzystych. Usunąć wszystkie zawieszone kuliste agregaty komórek i zużyte pożywki z naczynia hodowlanego za pomocą pipety serologicznej i umieścić w probówce o pojemności 15 ml. Ważne jest, aby zbierać tylko zawieszone kuliste agregaty komórek, a nie komórki przyczepione do dna naczynia, które spontanicznie się różnicują.
3. Osadzać komórki w masie 500 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 500 μl świeżej pożywki z komórek macierzystych ogrzanej do temperatury 37 °C. Delikatnie pipetować agregaty, aby częściowo oddzielić komórki. Nie należy agresywnie pipetować komórek, ponieważ zmniejszy to ich żywotność. Umyj częściowo zdysocjowane komórki w 9,5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki z komórek macierzystych na naczyniu do hodowli komórkowych o niskim nasadce o średnicy 10 cm.
4. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na 48 godzin przed rozpoczęciem różnicowania.

3. Różnicowanie OLC

1. Za pomocą pipety serologicznej usunąć komórki macierzyste z szalki hodowlanej i umieścić w probówce o pojemności 15 ml, pozostawiając wszelkie przyczepione komórki. Osadzać komórki w stężeniu 500 x g i ponownie zawiesić w 500 μl sterylnego PBS. Energicznie pipetować komórki za pomocą końcówki o szerokim otworze 1 000 μl w grudki nie większe niż 10-20 komórek. Okresowo usuwaj niewielką ilość komórek podczas dysocjacji i sprawdzaj pod mikroskopem światła białego, aby potwierdzić, że zagregowane komórki znajdują się w kępkach 10-20 pojedynczych komórek. Nadmierna dysocjacja spowoduje zmniejszoną żywotność komórek.
2. Dodać 9,5 ml PBS do zdysocjowanych komórek i dodać 15 μl tej zawiesiny komórek do hemocytometru w celu zliczenia komórek. Granulować komórki w rozmiarze 500 x g przez 5 minut.
3. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1,32X10⁶ komórek/ml w pożywce różnicowej.
4. Płytki na płytki komórek, dodając 500 μl na studzienkę do naczynia na zawiesinę z płaskim dnem 24-dołkowym.
5. Umieścić 24-dołkową szalkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 48 godzin. Usunąć 250 μl pożywki z każdej studzienki i umieścić w odpowiednio oznakowanej probówce o pojemności 1,5 ml. Do każdego dołka dodać 250 μl świeżej pożywki różnicującej. Odwirować zużytą pożywkę o sile 500 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić wszystkie granulowane komórki w 50 μl świeżej pożywki różnicującej i powrócić do odpowiedniej hodowli na płytce różnicującej.
6. Co 48 godzin zmieniaj połowę podłoża do 12 dnia różnicowania.

Wyniki

Początkowo komórki przywierają do dna naczynia hodowlanego i rozprzestrzeniają się. W 42-72 godzinie różnicowania tworzą się i proliferują małe, zawieszone komórki wykazujące pozytywną ekspresję OCT4 (Rycina 1A). Wkrótce po pojawieniu się tych komórek większość z nich znika, a komórki przywierające tworzą gęste agregaty kolonii na dnie hodowli. Po kilku dniach agregaty te odrywają się od powierzchni hodowli. W niektórych z tych agregatów można zaobserwować dużą komórkę (Rycina 1b i

Dyskusja

Do tej pory funkcjonalne OLC nie zostały opracowane przy użyciu testu całkowicie in vitro. Niedawne badanie przeprowadzone przez Hayashi i wsp. było w stanie wyprodukować potomstwo z komórek podobnych do PGC utworzonych in vitro i przeniesionych in vivo w celu dalszego rozwoju14. Zaczynając od komórek ES lub indukowanych komórek pluripotencjalnych, były one w stanie tworzyć komórki podobne do PGC, które po odzyskaniu po przeszczepieniu in vivo były w stanie dojrzeć,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM/F12	Invitrogen	12500
B27	Invitrogen	17504044
EGF	Invitrogen	PHG0311
bFGF	Invitrogen	PHG0266
ITS	Invitrogen	41400-045
BSA	Sigma	A-6003
Pirogronian sodu	Invitrogen	11360-070
Fetuin	Sigma	F3385
FSH	Sioux Biochemicals	915
LH	Sioux Biochemicals	925
M199	Invitrogen	31100-035
Płytki 24-dołkowe	Nunc	144530
Naczynia 10 cm	VWR	25384-088
15 ml dętki	BD	352095