Artykuł metodologiczny

Protokół trawienia trypsyny do analizy unaczynienia siatkówki w modelu myszy

DOI:

10.3791/50489

⸱

13 czerwca 2013

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trawienie trypsyny jest jedną z najczęściej używanych metod analizy unaczynienia siatkówki. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje metodę, w tym kluczowe zmiany mające na celu optymalizację techniki i usunięcie tkanki nienaczyniowej przy jednoczesnym zachowaniu ogólnej architektury naczyń.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trawienie trypsyny jest złotym standardem do analizy unaczynienia siatkówki 1-5. Umożliwia wizualizację całej sieci złożonych trójwymiarowych naczyń krwionośnych siatkówki i naczyń włosowatych poprzez tworzenie dwuwymiarowego płaskiego montażu połączonych ze sobą kanałów naczyniowych po strawieniu nienaczyniowych składników siatkówki. Pozwala to na badanie różnych patologicznych zmian naczyniowych, takich jak mikrotętniaki, zwyrodnienie naczyń włosowatych i nieprawidłowy stosunek śródbłonka do perycytów. Metoda ta jest jednak technicznie trudna, zwłaszcza u myszy, które stały się najszerzej dostępnym modelem zwierzęcym do badania siatkówki ze względu na łatwość manipulacji genetycznych 6,7. W oku myszy szczególnie trudno jest całkowicie usunąć składniki nienaczyniowe przy zachowaniu ogólnej architektury naczyń krwionośnych siatkówki. Do tej pory brakuje literatury, która szczegółowo opisuje technikę trawienia trypsyny u myszy. Ten manuskrypt zawiera szczegółową metodologię trawienia trypsyny krok po kroku w siatkówce myszy, a także zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania trudnych kroków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja unaczynienia siatkówki jest niezwykle ważnym podejściem do analizy mechanizmów różnych chorób oczu, takich jak retinopatia cukrzycowa. Pozwala na ocenę najwcześniejszych nieprawidłowości naczyniowych, w tym mikrotętniaków, zwyrodnień naczyń włosowatych i utraty okołocytów 8,9 . Do tej pory opracowano kilka technik analizy unaczynienia siatkówki. Perfuzja różnych barwników została użyta do podkreślenia naczyń, ale wszystkie miały podobne ograniczenia. Wstrzyknięcie rzadko uwydatnia całe unaczynienie siatkówki, chyba że jest podawane pod wysokim ciśnieniem, co grozi pęknięciem i uszkodzeniem naczyń krwionośnych 1. Barwienie immunologiczne śródbłonka naczyń krwionośnych izolektyną G B4 znakowaną fluoroforem (Alexa Fluor 594 sprzężona; I21413; Invitrogen; Rozcieńczenie 1:100) i płaskie mocowania siatkówki mogą podkreślić ogólną architekturę naczyń, ale bez szczegółowej wizualizacji naczyń włosowatych, błon podstawnych i perycytów. Friedenwald zauważył, że naczynia mogą być podświetlone przez barwienie płaskich mocowań siatkówki kwasem okresowym Schiffa (PAS) lub barwieniem hematoksyliną i eozyną (H&E) 10. Jednak barwienie nie było specyficzne dla naczyń i uwydatniało również tkankę nienaczyniową, co utrudniało rozróżnienie naczyń. W latach sześćdziesiątych XX wieku Cogan i Kuwabara opracowali technikę trawienia trypsyny, która ułatwiła wizualizację unaczynienia siatkówki poprzez trawienie nienaczyniowych składników siatkówki 1. Od tego czasu trawienie trypsyny stało się złotym standardem w analizie unaczynienia siatkówki 2-5. Należy jednak zauważyć, że opisano inne alternatywne techniki izolacji układu naczyniowego. Zastosowanie lizy osmotycznej zostało wykorzystane do izolacji układu naczyniowego i umożliwienia badań biochemicznych tkanki 11,12, ale procedura ta nie została wykorzystana jako podstawowa metoda badań anatomicznych. Metoda druku tkankowego została wykorzystana do izolacji dużych segmentów mikrokrążenia i pozwala na badanie elektrotonicznej architektury układu naczyniowego 13. Teoretycznie technika ta może być również wykorzystywana do badania zmian anatomicznych, ponieważ jakość naczyń jest wysoka. Jest jednak w stanie wyizolować tylko odcinki całej sieci naczyniowej. Chociaż metody te nie mogą zastąpić trawienia trypsyny, należy zauważyć, że mają one różne zalety i wady i są pod tym względem komplementarne.

Metoda trawienia trypsyny jest technicznie wymagająca i trudna do konsekwentnego wykonywania 6,7. Ponadto zauważono, że trawienie trypsyny jest szczególnie trudne w modelu mysim, szczególnie jeśli chce się zachować ogólną architekturę naczyniową siatkówki 6,7. Wyzwania obejmują (1) nadmierne trawienie siatkówki, które powoduje utratę zarówno układu naczyniowego, jak i tkanki nienaczyniowej, (2) niedostateczne trawienie, wymagające rozległej mechanicznej sekcji, która z kolei może prowadzić do uszkodzenia łożyska naczynia, (3) słabe oddzielenie tkanki nienaczyniowej od układu naczyniowego, co prowadzi do niespecyficznego barwienia. Kilka manuskryptów podkreślało te wyzwania, ale żaden z nich nie zawierał szczegółowego i spójnego protokołu, który pozwoliłby im przezwyciężyć 14,15. Niniejszy manuskrypt przedstawi krok po kroku metodologię szczegółowo opisującą technikę trawienia trypsyny na siatkówkach myszy i szczurów wraz ze szczegółowymi wskazówkami dotyczącymi radzenia sobie ze szczególnie trudnymi krokami. Schematyczny przegląd przedstawiono na rysunku 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie siatkówki

  1. Wyłuszczenie oka myszy. Jedną ręką otwórz powieki tak, aby oko było widoczne. Z drugiej strony, używając zakrzywionych kleszczy (zakrzywionych skierowanych do góry), wywieraj nacisk na górne i dolne aspekty orbity, aż kula ziemska wysunie się. Delikatnie zamknij kleszcze w tylnej części oka i podnieś ciągłym ruchem, aby wyłuszczyć oko.
  2. Napraw oko 10% neutralną buforowaną formaliną przez co najmniej 24 godziny.
  3. Umieścić oko w roztworze PBS na małej szalce Petriego.
  4. Dokładnie wypreparuj siatkówkę pod mikroskopem, uważając, aby nie wywołać dużych łez. Wykonaj wstępne nacięcie w rogówce za pomocą nożyczek preparacyjnych. Następnie, przytrzymując obszar cięcia prostymi kleszczami, użyj nożyczek, aby przeciąć wzdłuż granicy rogówki i twardówki, usuwając rogówkę. Za pomocą cienkich zakrzywionych i prostych kleszczy ostrożnie oderwij twardówkę i naczyniówkę od siatkówki w kierunku nerwu wzrokowego. Ten krok wymaga cierpliwości, ponieważ szybkie uwolnienie siatkówki może prowadzić do łez. Usuń soczewkę i nadmiar tęczówki i zanieczyszczeń z siatkówki 16.

2. Mycie wodą

  1. Umieść siatkówkę w naczyniu z 24 dołkami i zalej wodą (około 500 μl, przefiltrowaną filtrem co najmniej 45 μm).
  2. Zmieniaj wodę co 30 min-1 godzinę, co najmniej 4-5 razy.
  3. Pozostaw na noc w wodzie z delikatnym wstrząsaniem o temperaturze pokojowej.

Uwaga: Etapy mycia są bardzo ważne, ponieważ pomagają oddzielić warstwy nerwowe siatkówki od naczyń krwionośnych.

3. Trawienie trypsyny

  1. Usunąć wodę i inkubować siatkówkę w roztworze 3% trypsyny (Difco 1:250) w 0,1 M buforze Tris (pH 7,8) w temperaturze 37 °C, delikatnie lub bez wstrząsania. Trawienie trypsyny jest zakończone, gdy tkanka zaczyna wykazywać oznaki rozpadu (około 1,5 godziny).
    Uwaga: Unikaj gwałtownego potrząsania, ponieważ może to uszkodzić naczynia krwionośne.
  2. Ostrożnie odpipetuj trypsynę do osobnego dołka za pomocą mikroskopu, aby uniknąć dotykania siatkówki. Ten nadmiar trypsyny można wykorzystać później, podczas manipulowania naczyniami pod mikroskopem, w kroku 4.3.

4. Oddzielanie naczyń krwionośnych

  1. Dodaj przefiltrowaną wodę do siatkówki. Następnie spróbuj odkleić wewnętrzną membranę ograniczającą za pomocą kleszczy, w razie potrzeby używając nożyczek. Wstrząsać z lekkim mieszaniem przez 5 minut. Ostrożnie odpipetuj wodę pod mikroskopem, aby uniknąć uszkodzenia siatkówki.
  2. Powtarzaj płukanie wodą (po 5 minut każde), aby pomóc uwolnić sieć naczyń z przylegającej tkanki siatkówki. Mycie wodą jest zakończone, gdy po umyciu w wodzie pozostaje niewiele zanieczyszczeń lub nie ma ich wcale.
  3. Konieczne są teraz ostrożne manipulacje pod mikroskopem preparacyjnym, aby jeszcze bardziej uwolnić sieć naczyń. Poniżej znajduje się kilka przydatnych technik, które mogą być stosowane kolejno lub indywidualnie, aby osiągnąć pożądany rezultat w oparciu o preferencje techniczne:
    1. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl ostrożnie odpipetuj wodę w górę i w dół w pobliżu naczyń, wdmuchując wodę do naczyń, powodując delikatne mieszanie.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl odpipetuj trypsynę w górę i w dół, aby pokryć ścianki pipety. Następnie OSTROŻNIE odpipetuj całą sieć naczyń krwionośnych w górę iw dół, aby pomóc rozbić tkankę nienaczyniową.
      Uwaga: Wyśrodkowanie końcówki pipety na nerwie wzrokowym, a nie na krawędziach sieci naczyniowej, może również zapobiec przywieraniu układu krwionośnego do końcówki.
    3. Delikatnie wyjmij naczynia krwionośne cienkimi kleszczami z wody, aby usunąć elementy nienaczyniowe.
    4. Jeśli powyższe kroki nie zadziałają, dodaj trypsynę do siatkówki, aby pomóc w rozbiciu tkanki, i inkubuj w temperaturze 37 °C przez kilka minut. Następnie usuń trypsynę i powtórz kroki 4.1-4.3.

Uwaga: Upewnij się, że wszystkie narzędzia, które będą miały kontakt z naczyniami, są pokryte trypsyną (np. końcówka pipety, kleszcze). Pomoże to uniknąć przylegania naczyń krwionośnych do sprzętu.

5. Wizualizacja układu naczyniowego

  1. Umieść kroplę wody na czystym szkiełku. Za pomocą pipety lub kleszczyków o pojemności 200 μl przenieś strawione naczynia do wody. Upewnij się, że płaski uchwyt naczyniowy jest rozłożony. Napięcie powierzchniowe wody pomaga rozwinąć przeźroczystą sieć naczyniową. Jeśli chusteczka się nie rozwija, dodaj więcej wody i delikatnie potrząśnij szkiełkiem, aby ułatwić rozkładanie.
  2. Nadmiar wody należy usuwać bardzo powoli, pipetując lub używając ręcznika papierowego.
  3. Pozostaw szkiełka do całkowitego wyschnięcia.
  4. Barwienie przesuwa się za pomocą odpowiedniego protokołu z barwieniem PAS/hematoksyliną lub H&E.
    Uwaga: PAS / hematoksylina jest przydatna do identyfikacji ścian naczyń i jąder komórkowych; H&E jest również przydatny do demonstracji RBC.
  5. Odwodnić i zamontować (medium montażowe Permount).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Końcowym produktem udanej procedury jest preparat typu flat-mount całej sieci naczyń krwionośnych siatkówki myszy z zachowaną architekturą, barwiony metodą PAS/hematoksyliną lub H&E, jak pokazano na Rysunkach 2-4. Wyraźne rozróżnienie między komórkami śródbłonka a perycytami jest widoczne na Rysunku 3. W siatkówce jądra komórek śródbłonka są owalne lub wydłużone i znajdują się całkowicie w obrębie ściany naczynia. Jądra perycytów są małe, sferyczne, barwią się intensywnie i zazwyczaj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trawienie trypsyny jest standardową metodą oceny unaczynienia siatkówki. Niestety, jest to wyzwanie techniczne i może skutkować dużą utratą próbki, jeśli nie zostanie wykonane prawidłowo. Co więcej, procedura ta jest szczególnie trudna u myszy, co może ograniczać zastosowanie tej techniki w powszechnie stosowanych genetycznych modelach zwierzęcych chorób oczu. Niniejszy artykuł zawiera wskazówki, jak skutecznie i konsekwentnie wykonywać zabieg w oczach myszy.

W protokole znajduje się kilka kry...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Society for Prevention of Blindness (JCC, AAF), nieograniczone fundusze dla Departamentu Okulistyki z Research to Prevent Blindness (RPB), NY oraz RPB Medical Student Fellowship Grant (JCC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ODCZYNNIKI
10% neutralna buforowana formalinaFischer ScientificSF100-4
Trypsyna (1:250)Amresco0458-50GWytwarzaj 3% trypsyny w 0,1 M Tris
TRIZMA bazaSigmaT1503-1KGUtwórz 0,1 M bufor Tris (pH 7,8 @ 37 ° C)
TRIZMASigmaT3253-500G
Steritop sterylna butelka próżniowaMilliporeSCGPS05RETworzenie przefiltrowanej wody
EQUIPMENT
MikroskopKażdy mikroskop, który umożliwia dobrą wizualizację siatkówki, jest wystarczający. (10x jest wystarczające przy odległości roboczej 24 mm)
Nożyczki prosteFine Science Tools15024-10Krawędź tnąca: 8 mm; Średnica końcówki: 0,2 mm; Kleszcze proste 10 cm
(Inox)Dumont #511252-20Końcówka Biologie; 0,05 x 0,02 mm; 11 cm
Zakrzywione Forcepts (Dumostar)Dumont #711297-10Końcówka Biologie; 0,07 x 0,04 mm; 11,5 cm
Inkubator Dubnoff Metabolic ShakerPrecision Scientific BDG59442Shaker opcjonalna
24-dołkowa szalkaFalcon353047
Preparaty mikroskopoweVWR82027-132
preparacyjny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
  2. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
  3. Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
  4. Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
  5. Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
  6. Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
  7. Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
  8. Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
  9. Chapter 30. Diabetic Retinopathy. , Lippincott Williams and Wilkins. (2005).
  10. Rosenblatt, B., Benson, W. E. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. Yannoff, M., Duker, J. , 3rd edition, Mosby, Inc. (2008).
  11. Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
  12. Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).
  13. Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
  14. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
  15. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
  16. Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
  17. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
  18. The Jackson Laboratory [Internet]. , Available from: http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Siatk wka myszyizolacja naczytrawienie tkanekdegeneracja naczy kapilarnychmikro t tniakistosunek kom rek endotelialnych do perycyt wprzygotowanie preparatu typu flat mountanaliza sieci naczyniowej

Powiązane artykuły