Charakterystyka reakcji zapalnych podczas kolonizacji donosowej Streptococcus pneumoniae

Podsumowanie

Opisano kolonizację mysiego nosogardzieli Streptococcus pneumoniae i późniejszą ekstrakcję przylegających lub zrekrutowanych komórek. Technika ta polega na przepłukiwaniu nosogardzieli i zbieraniu płynu przez nozdrza i można ją dostosować do różnych odczytów, w tym różnicowej kwantyfikacji komórek i analizy ekspresji mRNA in situ.

Streszczenie

Kolonizacja nosogardzieli przez Streptococcus pneumoniae jest warunkiem wstępnym do inwazji na płuca lub krwioobieg¹. Organizm ten jest zdolny do kolonizacji powierzchni błony śluzowej nosogardzieli, gdzie może przebywać, rozmnażać się i ostatecznie pokonać mechanizmy obronne gospodarza, aby zaatakować inne tkanki gospodarza. Pojawienie się infekcji w normalnie dolnych drogach oddechowych powoduje zapalenie płuc. Alternatywnie, bakterie mogą rozprzestrzeniać się do krwiobiegu, powodując bakteriemię, która wiąże się z wysoką śmiertelnością², lub prowadzić bezpośrednio do rozwoju pneumokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Zrozumienie kinetyki i odpowiedzi immunologicznej na kolonizację nosogardzieli jest ważnym aspektem modeli infekcji S. pneumoniae.

Nasz mysi model kolonizacji wewnątrznosowej jest zaadaptowany z modeli ludzkich³ i był używany przez wiele grup badawczych w badaniu odpowiedzi gospodarz-patogen w nosogardzieli^4-7. W pierwszej części modelu używamy klinicznego izolatu S. pneumoniae, aby ustalić samoograniczającą się kolonizację bakteryjną, która jest podobna do zdarzeń nosicielstwa u dorosłych ludzi. Procedura opisana w niniejszym dokumencie polega na przygotowaniu inokulum bakteryjnego, a następnie ustaleniu zdarzenia kolonizacyjnego poprzez dostarczenie inokulum drogą donosową. Makrofagi rezydentne są dominującym typem komórek w nosogardzieli w stanie stacjonarnym. Zazwyczaj u niezakażonych myszy występuje niewiele limfocytów⁸, jednak kolonizacja błony śluzowej doprowadzi do stanu zapalnego o niskim lub wysokim stopniu (w zależności od zjadliwości gatunku bakterii i szczepu), który spowoduje odpowiedź immunologiczną, a następnie rekrutację komórek odpornościowych gospodarza. Komórki te można wyizolować przez płukanie treści tchawicy przez nozdrza i skorelować z gęstością bakterii kolonizacyjnych, aby lepiej zrozumieć kinetykę infekcji.

Protokół

Zanim zaczniesz: wszystkie kroki są wykonywane w Gabinecie Bezpieczeństwa Biologicznego (BSC) poziomu zagrożenia biologicznego 2 (BSL), chyba że zaznaczono inaczej. Przed rozpoczęciem eksperymentów należy upewnić się, że uzyskali Państwo odpowiednie zatwierdzenie zagrożenia biologicznego na stosowanie zakaźnych patogenów bakteryjnych zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Dodatkowo należy upewnić się, że posiada się przygotowane wcześniej wszystkie materiały i odczynniki niezbędne do przeprowadzenia zabiegu. Myszy użyte w tych eksperymentach obejmowały samice myszy C57BL / 6 z Jackson Laboratories, Charles River lub Taconic i były w wieku 10-14 tygodni (chociaż nie znaleźliśmy żadnych zależnych od płci istotnych różnic w kinetyce usuwania kolonizacji nosa lub infekcji). Wszystkie myszy użyte w tych eksperymentach były hodowane i utrzymywane w warunkach wolnych od specyficznych patogenów i były wolne od powszechnych wirusów (LCMV, MNV, MPV, reowirus ECTV i inne) bakterii (np. H. pylori) i pasożytów (np. owsików, ektopasożytów) poprzez badanie próbek kału, a także częstą ocenę anatomiczną myszy wskaźnikowych trzymanych w ich pomieszczeniach mieszkalnych. Podczas przeprowadzania tych eksperymentów zalecamy używanie myszy kontrolnych nie młodszych niż 10-12 tygodni i nie starszych niż 6 miesięcy. Myszy młodsze lub starsze niż ten przedział wiekowy są bardziej podatne na dłuższy czas nosicielstwa przez nosogardziel i zwiększone prawdopodobieństwo rozsiania infekcji. Tło myszy jest kolejnym ważnym czynnikiem, który może mieć wpływ na wyniki eksperymentu kolonizacyjnego, ponieważ kilka grup wykazało, że myszy o różnym pochodzeniu genetycznym mają różną podatność na szczep S. pneumoniae D39 (serotyp 2)^9,10. S. pneumoniae nie jest naturalnie występującym mysim patogenem, a jego jedynym naturalnym rezerwuarem jest ludzka nosogardzieli. Przenoszenie odbywa się za pośrednictwem kropelek oddechowych, a ponieważ myszy nie wytwarzają wydzieliny oddechowej, poszczególne myszy nie mogą przenosić bakterii na inne myszy, więc nie ma obaw o transmisję z myszy na mysz¹¹. Aby zapoznać się z wizualnym przeglądem procedur opisanych w tym manuskrypcie, zapoznaj się z rysunkiem 1.

1. Przygotowanie kultury S. pneumoniae

1. Zaszczepić 5 ml tryptycznego agaru sojowego w celu uzyskania zawiesiny wzrostu Streptococcus pneumoniae.
2. Hodowla w warunkach statycznych w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ do momentu, gdy inokulum bakteryjne osiągnie wzrost w fazie logarytmicznej z odpowiednią gęstością cieczy 10,8 jtk/ml, określoną za pomocą licznika kilometrów ustawionego na 600 nm. Dokładny odczyt odpowiadający temu CFU będzie się różnić w zależności od konkretnego wybranego szczepu bakteryjnego; dla większości szczepów S. pneumoniae odpowiada to zakresowi OD₆₀₀ wynoszącemu 0,45-0,55. Zazwyczaj szczepy S. pneumoniae w płynnej kulturze osiągają tę gęstość w ciągu 1,5-2,5 godziny w zalecanych warunkach, bez potrzeby subkulturacji. Nie należy dopuścić do przerostu kultury (powyżej odczytu OD 0,75), ponieważ stanowi to punkt, w którym bakterie nie są już w fazie logarytmicznej wzrostu i przechodzą rozległą autolizę.
3. Każda mysz zostanie zaszczepiona około 10⁷ bakteriami. Dlatego na każde 9 myszy, które mają zostać skolonizowane, należy odpipetować 1 ml inokulum do probówki Eppendorfa i wirować z prędkością 15 000 x g przez 1 minutę. Powinna być widoczna biaława kulka. Usunąć sklarowany osad, uważając, aby nie naruszyć osadu i ponownie zawiesić bakterie w 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), zwiększając w ten sposób stężenie do^10,9 jtk/ml. Na tym etapie bakterie powinny pozostać żywotne, ale nie będą się łatwo namnażać.
4. W przypadku stosowania wielu podwielokrotności należy połączyć w jedną probówkę, aby kontrolować niewielkie różnice w gęstości bakterii między próbkami.
5. Trzymaj bakterie na lodzie do momentu, gdy będą gotowe do zaszczepienia, maksymalnie przez 1 godzinę.
6. Aby uzyskać dokładną liczbę bakterii, wykonaj serię szeregowych rozcieńczeń logarytmicznych, zaczynając od schludnego inokulum bakteryjnego. Rozcieńczyć seryjnie 10-krotnie, dodając 10 μl do 90 μl sterylnego PBS.
7. Umieść 3 krople po 10 μl próbek rozcieńczeń ^10-5 - ^10-9, plus kontrolę zanieczyszczenia tylko za pomocą PBS, na oddzielnie oznakowanych odcinkach płytki z tryptycznym agarem sojowym (TSA) uzupełnionej 5% krwią owczą (ryc. 2). Upewnij się, że końcówki pipet są wymieniane na każdym etapie, rozcieńczając z wyższego stężenia CFU do niższego stężenia CFU, aby uniknąć przenoszenia nadmiaru bakterii i zwiększenia zmienności wyników. Płytki z agarem z ludzką krwią (HBA) mogą być również używane zamiast TSA. Ponieważ wiele szczepów S. pneumoniae jest opornych na neomycynę (od 5-20 μg/ml), antybiotyk ten może być również dodawany do wybranego podłoża agarowego w fazie przygotowania płytki. Ułatwia to wyliczanie, ponieważ eliminuje bakterie nieoporne. Wrażliwość każdego szczepu na antybiotyki musi być wcześniej przetestowana w celu określenia optymalnego stężenia antybiotyku do stosowania dla każdego szczepu bakteryjnego.
8. Pozostawić do wyschnięcia na 15-30 minut bez przykrycia, następnie przykryć płytki i umieścić do góry nogami w inkubatorze bakteryjnym ustawionym na 37 °C i 5% CO₂ . Hoduj kolonie bakterii na talerzu przez 24 godziny.
9. Określ liczbę jednostek tworzących kolonie i odpowiadające im stężenie. Na podstawie oznaczeń wartości OD₆₀₀ stężenie powinno mieścić się w zakresie 1-4 x 10⁹ CFU/ml. Kolonie S. pneumoniae powinny wyglądać jak małe, okrągłe kolonie o żółtawo-beżowym kolorze, z małym wgłębieniem w środku, nadającym im wygląd pączka (ryc. 3).

2. Mysia kolonizacja donosowa

1. Unieruchomić myszy, umieszczając je w aparacie powstrzymującym myszy (zmodyfikowana rurka Falcon o pojemności 50 ml z końcówką odciętą w celu utworzenia otworu), zabezpieczając je kciukiem za podstawę ciała tak, aby ich nosy po prostu wyłaniały się ze zwężającego się końca aparatu ograniczającego (ryc. 4). Zastosowanie tego aparatu pozwala na unieruchomienie głowy myszy i segregację jej nozdrzy w sposób minimalizujący ruch, a także utrudniający próbom przeżucia końcówki pipety przez zwierzę, co pozwala na całkowite podanie inokulum. Alternatywnie, myszy mogą być unieruchomione poprzez drapanie szyi i ręczne unieruchomienie. Nie zalecamy znieczulenia zwierząt przed inokulacją donosową. Podawanie inokulum zwierzętom w znieczuleniu powoduje, że część inokulum rozprzestrzenia się do płuc^12,13.
2. Używając pipety P10 lub P20, zaszczepić każdą mysz, deponując 10 μl przygotowanej kultury, rozprowadzając ją równomiernie między obydwoma nozdrzami (pozwól, aby inokulum kapało do nosa, pulsując inokulum stopniowo, dając myszom czas na wdychanie inokulum). Aby osiągnąć pełne dostarczenie inokulum, należy wstrzymać podawanie w dowolnym momencie, w którym mysz zaczyna nadmiernie poruszać nosem. Nie można wstrzyknąć całego inokulum do nozdrza, ponieważ myszy mogą wydalić niektóre przez nos podczas wydechu; Jednakże, ponieważ wydalana ilość jest zwykle znikoma, a inokulum zawiera bardzo dużą ilość bakterii, nie wpływa to znacząco na obciążenie bakteriami kolonizującymi. Dodatkowo, powierzchnia dostępna do kolonizacji w błonie śluzowej nosogardzieli jest ograniczona, w związku z czym my i inni stwierdziliśmy, że zalecana dawka 10⁷ jest wystarczająca do uzyskania stałego poziomu bakterii u wszystkich myszy, co skutkuje minimalną zmiennością początkowych ilości bakterii kolonizujących^14,15 .
3. Zważ myszy, jeśli używasz wskaźników wagi w ramach monitorowania punktu końcowego. Monitoruj myszy co 12-24 godziny pod kątem objawów klinicznych, w tym letargu, potarganej sierści i utraty wagi. Myszy zazwyczaj nie wykazują objawów choroby do 3-5 dni po kolonizacji, a te będą poprzedzone utratą wagi, która może wynosić średnio około 5% całkowitej masy ciała dziennie. W miarę jak myszy stają się coraz bardziej chore, przyjmują zgarbioną postawę i wykazują zmniejszoną aktywność oraz zmniejszoną reakcję na stymulację, w tym obsługę. Na tym etapie choroba zwykle wskazuje na sepsę i/lub zapalenie płuc i prawdopodobnie będzie nieuleczalna, chociaż myszy mogą być leczone 1 ml podskórnej soli fizjologicznej dziennie, aby poprawić wyniki. Myszy, które przeżyły, powinny zacząć wykazywać poprawę po 7 dniu po kolonizacji, o czym świadczy stabilizacja masy ciała, a następnie przyrost masy ciała, chociaż różne szczepy S. pneumoniae mogą szybciej wywoływać chorobę i powodować progresję objawów klinicznych w innym czasie. Patrz rysunek 5, aby zapoznać się z reprezentatywnym wynikiem śledzenia masy ciała u myszy skolonizowanych szczepem P1547.

3. Pobieranie próbek z płukania nosa

Zanim zaczniesz: przygotuj igły kaniulowane za pomocą strzykawek o pojemności 1 ml zakończonych igłami skośnymi 26 3/8 G. Wytnij 2,5 cm kawałki rurki polietylenowej PE20 o średnicy wewnętrznej 0,38 mm, upewniając się, że każdy koniec ma ściętą końcówkę. Za pomocą kleszczy nasuń kawałek rurki polietylenowej PE20 o długości 2,5 cm (średnica wewnętrzna 0,38 mm) na końcówkę igły, unikając przebicia strony rurki. Igły kaniulowane można przechowywać w 70% etanolu, dopóki nie będą potrzebne.

1. Poddaj eutanazji myszy eksperymentalne. Ponieważ zwichnięcie szyjki macicy może potencjalnie uszkodzić tchawicę, należy unikać tej metody eutanazji. Naszą preferowaną metodą jest znieczulenie izofluranem, a następnie wykrwawienie, jednak przy wyborze metody eutanazji należy postępować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
2. Używając 70% wodnego etanolu, wysterylizuj przednią sierść zwierzęcia, zwłaszcza szyję, uważając, aby etanol nie dostał się do nozdrzy.
3. Wykonaj pojedyncze podłużne cięcie wzdłuż linii środkowej szyi zwierzęcia i dwa poziome nacięcia na obu końcach, tworząc otwór, aby wyobrazić sobie tchawicę.
4. Ostrożnie odklej skórę po obu stronach, odsłaniając tkankę szyi pod spodem.
5. Tchawica powinna być widoczna, otoczona podłużnymi mięśniami po obu stronach. Ostrożnie je odetnij, aby zapewnić wyraźny widok samej tchawicy, uważając, aby nie przeciąć otaczającego naczynia krwionośnego.
6. Jeśli układ krwionośny został przecięty i obecna jest krew, przed kontynuowaniem poczekaj, aż krwawienie się zatrzyma, a następnie kilkakrotnie oczyść obszar, dozując sterylny PBS i używając sterylnej gazy, aby delikatnie wchłonąć nadmiar wilgoci w okolicy.
7. Gdy tchawica jest odpowiednio odsłonięta, wykonaj poprzeczne, półksiężycowate nacięcie w tchawicy mniej więcej w połowie wysokości (ryc. 6).
8. Pobrać 1 000 μl wysterylizowanego PBS do wcześniej przygotowanej igły kaniulowanej.
9. Włóż kaniulę do tchawicy w kierunku nosa, trzymając skośną krawędź skierowaną w dół, aby ułatwić wprowadzenie (ryc. 7). Gdy igła znajdzie się na miejscu, obróć ją o 180° i delikatnie sonduj w górę, aż poczujesz lekki opór.
10. Umieść Eppendorf przeznaczony do pobierania próbek tuż pod noskiem myszy.
11. Przetestuj prawidłowe ułożenie igły, dozując minimalną (~20 μl) ilość płynu do płukania PBS - kropla płynu powinna utworzyć się wokół nozdrzy myszy; jeśli tak jest, przejdź do kroku 3.13).
12. Jeśli testowy PBS wyłania się bezpośrednio z pyska zwierzęcia, pociągnij kaniulę do tyłu i zmień pozycję, ponownie delikatnie sondując do przodu, aż poczujesz bardzo niewielki opór - uważaj, aby nie wypchnąć kaniuli zbyt daleko poza ten opór, ponieważ przesuniesz ją przez podniebienie nosowe i do jamy ustnej.
13. Szybko dozuj zawartość igły, aby pomóc w przemieszczeniu i zebraniu maksymalnej ilości komórek - zawartość powinna wypłynąć przez nozdrzy myszy i do probówki zbiorczej. Natychmiast umieścić próbkę na lodzie.
14. Aby pobrać próbki do analizy RNA, powtórz kroki 3.8-3.13) za pomocą kaniulowanej igły zawierającej 500 μl buforu do lizy RNA na tej samej myszy. Umożliwi to pobranie próbki lizatu z pozostałych populacji komórek, składających się w dużej mierze z nabłonka błony śluzowej nosogardzieli, ponieważ nieprzylegające komórki powinny zostać usunięte po początkowym płukaniu PBS. Należy pamiętać, że bufor do lizy RNA zniszczy nabłonek i zniszczy otaczające tkanki, dlatego należy zachować ostrożność, aby uniknąć kontaktu z narządami, takimi jak płuca, jeśli pożądane jest zatrzymanie tych tkanek. Po zebraniu umieść próbkę w buforze do lizy RNA bezpośrednio na suchym lodzie w celu szybkiego zamrożenia. Po umieszczeniu w buforze do lizy próbki mogą być przechowywane zgodnie z instrukcjami producenta i są stabilne zwykle w temperaturze -70 °C przez kilka miesięcy.

4. Oznaczanie obciążenia bakteryjnego w nosogardzieli

1. Ocenić ilościowo bakterie, przygotowując serię seryjnych rozcieńczeń dla każdej próbki mysiego płukania nosa. Ogólnie rzecz biorąc, można oczekiwać, że obciążenie bakteryjne wyniesie od 0 do^{10 4} CFU, dlatego należy przeprowadzić trzy 10-krotne seryjne rozcieńczenia. Dodać 10 μl czystej próbki płukania nosa (100 jtk/ml) do pierwszej probówki o stężeniu ^10-1 jtk/ml. Dokładnie przemieszać.
2. Podzielić płytkę bakteriologiczną na ćwiartki i oznaczyć każdą ćwiartkę elementem serii rozcieńczeń (10 0-10-3 jtk/ml). Umieścić 3 krople po 10 μl próbek z 3 rozcieńczeń i czystą próbkę na płytkach z agarem sojowym tryptycznym uzupełnionych 5% krwią owczą, jak pokazano na rysunku 2.
3. Pozostawić do wyschnięcia na 15-30 minut bez przykrycia, następnie przykryć płytki i umieścić do góry nogami w inkubatorze bakteryjnym o optymalnych warunkach do rozwoju bakterii (zwykle 37 °C i 5% CO₂ ).
4. Hoduj kolonie bakterii na talerzu przez 18-24 godziny.
5. Określ liczbę bakterii kolonizujących, uśredniając kolonie utworzone na płytce dla każdego rozcieńczenia (ryc. 3). Rycina 8 pokazuje gęstość bakterii w różnych punktach czasowych, określoną przez posiew płukanek nosowych, u myszy skolonizowanych 3 różnymi szczepami S. pneumoniae przez okres do 21 dni.

5. Przygotowanie próbek do cytometrii przepływowej

Przed rozpoczęciem: Przygotuj mieszankę przeciwciał. Do ilościowego oznaczania populacji leukocytów zalecamy następującą mieszaninę w określonych rozcieńczeniach: PE-Ly6G (klon 1A8, 1 μg/ml), FITC-Ly6C (klon AL-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (klon 30-F11, 2,67 μg/ml), APC-F4/80 (klon PM8 RUO, 0,67 μg/ml), PerCP-Cy5.5-CD11c (klon N418 RUO, 0,5 μg/ml), PE-Cy7-CD11b (klon M1/70, 0,33 μg/ml), Alexa Fluor 700-CD3 (klon 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 (klon GK1,5, 6,67 μg/ml). Należy pamiętać, że ta mieszanka ma stężenie 2x (patrz krok 5.5). Wszystkie przeciwciała należy rozcieńczyć w buforze FAC Wash (0,5% płodowa surowica cielęca, 2 mM EDTA, 0,1% azydek sodu w PBS), który również należy przygotować wcześniej. W mieszaninie przeciwciał kontrolnych dopasowanych izotypowo, najlepiej pochodzących od tego samego dostawcy, co znakowane przeciwciała i w tych samych stężeniach co przeciwciała specyficzne, należy je przygotować. Próbki poddane działaniu przeciwciał kontrolnych izotypu będą pełnić funkcję kontroli ujemnej. Wszelka fluorescencja zaobserwowana w próbkach poddanych działaniu przeciwciał kontrolnych izotypu powinna być uważana za tło.

1. Schłodzić wirówkę zdolną do obracania 1,5 ml probówek Eppendorfa do temperatury 4 °C.
2. Odwirować próbki z płukania nosa o masie 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odpipetować supernatant i odczekać. Uwaga: ze względu na niewielką ilość komórek w nosogardzieli, osad komórkowy nie będzie widoczny, chyba że wystąpi niepożądane zanieczyszczenie czerwonych krwinek, które będą jaskrawoczerwone. Jeśli jest to widoczne, próbkę należy wyrzucić.
3. Zawiesić próbkę w 50 μl Fc? Przeciwciało RIIb/CD16-2 (2,4G2) (które wiąże receptory Fc i zmniejsza wiązanie przeciwciał nieswoistych) w buforze FAC Wash w stężeniu 4 μg/ml.
4. Inkubować próbkę na lodzie przez 30 minut.
5. Dodać 50 μl wstępnie przygotowanej mieszaniny 2x skoncentrowanych przeciwciał fluorescencyjnych do próbki. Odłóż na bok reprezentatywną próbkę z każdej grupy eksperymentalnej, która będzie działać jako kontrola izotypu. Dodać mieszaninę przeciwciał izotypowych do tej próbki zamiast mieszanki barwienia.
6. Inkubować próbkę na lodzie przez 1 godzinę.
7. Odwirować próbki o masie 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 200 μl PBS.
8. Powtórz krok 5.7.
9. Po drugim przemyciu ponownie odwirować próbki o masie 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
10. Zawiesić ponownie w PBS (jeśli próbka jest uruchamiana natychmiast) lub 2% paraformaldehydu (jeśli próbki są uruchamiane 1-3 dni po barwieniu).
11. Przeprowadzając cytometrię przepływową, należy zebrać maksymalną liczbę zdarzeń na próbkę lub do momentu zassania całej próbki. U niezainfekowanych, zdrowych, młodych myszy będzie to zaledwie 1000-2000 zdarzeń; Podczas kolonizacji bakteryjnej liczba ta może wzrosnąć ponad 2 do 5 razy w zależności od statusu choroby u zwierząt i czynników, takich jak wiek i tło genetyczne. Rysunek 9 przedstawia reprezentatywne wyniki cytometrii przepływowej zebrane za pomocą 3-laserowego cytometru przepływowego Becton Dickenson LSRII przy użyciu rozproszenia do przodu 450 i rozproszenia bocznego 300, chociaż zalecamy optymalizację parametrów dla konkretnego cytometru przepływowego, którego zamierzasz użyć przed pobraniem próbki. Uwaga: jeśli próbka zawiera nawet śladowe ilości zanieczyszczenia krwi, łączna liczba pobranych zdarzeń będzie znacznie wyższa niż oczekiwano i próbka powinna zostać wyłączona z analizy.

6. Ilościowa analiza PCR (qPCR) płukania nosa

1. Rozmrozić lizaty komórkowe od kroku 3.14 temperatura pokojowa.
2. Postępuj zgodnie z zalecanym protokołem dostarczonym z preferowaną ekstrakcją RNA do wyboru.
3. Po zakończeniu procedury ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcją, określ ilościowo ilość RNA za pomocą spektrofotometru lub metody opartej na elektroforezie (ryc. 10). Rutynowo uzyskujemy od 975 do 3,250 ng całkowitego RNA na próbkę przy stosunku 260/280 nm wynoszącym >1,7 lub liczbie integralności RNA (RIN) około 8,1±0,13.
4. Transkrybuj cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy M-MULV zgodnie z protokołem producenta z 1,000 ng RNA (maksymalnie 13 μl).
5. Otrzymane próbki cDNA rozcieńczyć 8 razy i równo rozdzielić do 4 oddzielnych probówek w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 lub -80 °C.
6. Aby zmierzyć ekspresję genów metodą qPCR, należy przygotować 25 μl próbek reakcji w trzech egzemplarzach na lodzie lub zimnym bloku zawierającym: 12,5 μl 2x qPCR master mix z wybranego zestawu qPCR, 0,25 μl barwnika referencyjnego, 2 μl rozcieńczonego cDNA (krok 7.5), 1 μl zmieszanych starterów do przodu i do tyłu (400 nM final), 9,25 μl wody wolnej od RNAse-DNAzy. Protokół ten jest adaptacją wcześniej opublikowanych metod¹⁶.
7. Ogólnie rzecz biorąc, stwierdzamy, że dwuetapowa amplifikacja qPCR (95 °C przez 10 minut, a następnie do 40 cykli x [95 °C x 15 sekund, 60 °C x 1 min]) jest skuteczna (rysunek 11a); jednak każda para starterów musi być zoptymalizowana. Krzywe dysocjacji (topnienia) muszą być wykonane po amplifikacji, aby upewnić się, że nie wystąpiła amplifikacja niespecyficzna. wzmocnienie (Rysunek 11b)
8. Rutynowo przeprowadzamy standardowe krzywe dla każdego analizowanego genu, a także standardowy kalibrator (pochodzący z homogenatu płuc lub śledziony) dla każdej analizowanej 96-dołkowej płytki. Względne ilości transkryptu uzyskuje się poprzez uprzednią normalizację wartości progu cyklu surowego (Ct) za pomocą barwnika referencyjnego i przekształcenie wynikowych wartości przez odpowiednią krzywą wzorcową. Te względne ilości są następnie normalizowane do wzorcowego kalibratora i genu porządkowego, jeśli ma to zastosowanie.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schemat poglądowy podsumowujący główne kroki protokołu. Rysunki 2-3 przedstawiają wizualizację metodologii mikrobiologicznej nieodłącznie związanej z opisanymi w niniejszym dokumencie protokołami. Rycina 4 przedstawia prawidłowe ułożenie myszy w celu przeprowadzenia kolonizacji donosowej, podczas gdy rycina 5 przedstawia typowe zmiany masy ciała myszy skolonizowanych szczepem S. pneumoniae P1547. Ryciny 6-7...

Dyskusja

W tym badaniu przedstawiono szczegółowe metody kolonizacji donosowej myszy przy użyciu klinicznego izolatu szczepu Streptococcus pneumoniae, a następnie izolacji i charakterystyki komórek odpornościowych rekrutowanych do nosogardzieli w odpowiedzi na bakterie. Pokazaliśmy, w jaki sposób inokulum bakteryjne może być hodowane w pożywkach bogatych w składniki odżywcze i wykorzystywane do ustalenia zdarzenia kolonizacji u myszy, które początkowo ogranicza się do nosogardzieli. Następnie pokazaliśmy, w jaki sposób re...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Anty-mysz Ly6C FITC	BD Pharmingen	553104
Anti-Mouse Ly6G PE	BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience		48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antic	APC eBioscience	17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0114-82
Anty-Myszy CD11b PE-Cy7	eBioscience	25-0112-82
Anty-Mysz CD3 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0032-82
Anty-Mysz CD4 eFluor 605NC	eBioscience	93-0041-42
Rurka polietylenowa Intramedic - PE20	Becton Dickinson	427406
BD 1 ml Strzykawka	Becton Dickinson	309659
BD 26 G 3/8 Śródskórny skos	Becton Dickinson	305110
Bufor do lizy RLT	Qiagen	79216
Difco Tryptic Soy Agar	Becton Dickinson	236950
Defibrynowana krew owcza	PML Microbiologicals	A0404
RNAqueous-Micro Kit	Ambion	AM1931
M-MuLV Odwrotna transkryptaza	New England Biolabs	M0253L
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001