Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Kahlin Leuzinger; Matthew Dent; Jonathan Hurtado; Jake Stahnke; Huafang Lai; Xiaohong Zhou; Qiang Chen

doi:10.3791/50521

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

51.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50521

⸱

23 lipca 2013

Kahlin Leuzinger^*¹ , Matthew Dent^*¹ , Jonathan Hurtado¹ , Jake Stahnke¹ , Huafang Lai¹ , Xiaohong Zhou¹ , Qiang Chen¹

¹The College of Technology and Innovation, Center for Infectious Disease and Vaccinology, The Biodesign Institute, Arizona State University

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Streszczenie

Hodowla komórek ssaków jest główną platformą do komercyjnej produkcji szczepionek ludzkich i białek terapeutycznych. Nie jest jednak w stanie sprostać rosnącemu światowemu zapotrzebowaniu na farmaceutyki ze względu na ograniczoną skalowalność i wysokie koszty. Zakłady okazały się jedną z najbardziej obiecujących alternatywnych platform produkcji farmaceutycznej, które są solidne, skalowalne, tanie i bezpieczne. Niedawny rozwój wektorów opartych na wirusach umożliwił szybką i przejściową ekspresję białek rekombinowanych na wysokim poziomie w roślinach. Aby jeszcze bardziej zoptymalizować użyteczność systemu ekspresji przejściowej, w tym badaniu demonstrujemy prostą, wydajną i skalowalną metodologię wprowadzania docelowego genu zawierającego Agrobacterium do tkanki roślinnej. Nasze wyniki wskazują, że agroinfiltracja zarówno metodą strzykawkową, jak i próżniową doprowadziła do skutecznego wprowadzenia Agrobacterium do liści i solidnej produkcji dwóch białek fluorescencyjnych; GFP oraz DsRed. Ponadto pokazujemy wyjątkowe zalety oferowane przez obie metody. Infiltracja strzykawkowa jest prosta i nie wymaga drogiego sprzętu. Pozwala również na elastyczność w infiltracji całego liścia za pomocą jednego genu docelowego lub wprowadzenia genów wielu celów na jednym liściu. Dzięki temu może być stosowany do ekspresji białek rekombinowanych w skali laboratoryjnej, a także do porównywania różnych białek lub wektorów pod kątem wydajności lub kinetyki ekspresji. Prostota infiltracji strzykawkowej sugeruje również jej przydatność w edukacji szkolnej i studenckiej w zakresie biotechnologii. Natomiast infiltracja próżniowa jest bardziej niezawodna i może być skalowana do komercyjnej produkcji białek farmaceutycznych. Zaletą jest również możliwość agroinfiltracji gatunków roślin, które nie są podatne na infiltrację strzykawkową, takich jak sałata i rzodkiewnik. Ogólnie rzecz biorąc, połączenie agroinfiltracji strzykawkowej i próżniowej zapewnia naukowcom i edukatorom prostą, wydajną i solidną metodologię przejściowej ekspresji białek. Znacznie ułatwi to rozwój białek farmaceutycznych i będzie promować edukację w zakresie nauk ścisłych.

Wprowadzenie

Od lat siedemdziesiątych rośliny są badane jako alternatywa dla hodowli komórek ssaków, owadów i bakterii do komercyjnej produkcji rekombinowanych białek i terapii białkowych ¹. Roślinne systemy do ekspresji biofarmaceutyków okazały się obiecujące w ostatnich latach, ponieważ kilka nowatorskich metod leczenia chorób, takich jak choroba Gauchera ² i ptasia grypa H5N1 ³, odniosło sukces w badaniach klinicznych. Rozwój kompetentnych mechanizmów ekspresji białek rekombinowanych w roślinach w ciągu dziesięcioleci, które upłynęły od tych początkowych eksperymentów, stworzył potencjał dla systemów roślinnych do zmiany obecnego paradygmatu pro....