Method Article

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

DOI:

10.3791/50521

⸱

July 23rd, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The College of Technology and Innovation, Center for Infectious Disease and Vaccinology, The Biodesign Institute, Arizona State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla komórek ssaków jest główną platformą do komercyjnej produkcji szczepionek ludzkich i białek terapeutycznych. Nie jest jednak w stanie sprostać rosnącemu światowemu zapotrzebowaniu na farmaceutyki ze względu na ograniczoną skalowalność i wysokie koszty. Zakłady okazały się jedną z najbardziej obiecujących alternatywnych platform produkcji farmaceutycznej, które są solidne, skalowalne, tanie i bezpieczne. Niedawny rozwój wektorów opartych na wirusach umożliwił szybką i przejściową ekspresję białek rekombinowanych na wysokim poziomie w roślinach. Aby jeszcze bardziej zoptymalizować użyteczność systemu ekspresji przejściowej, w tym badaniu demonstrujemy prostą, wydajną i skalowalną metodologię wprowadzania docelowego genu zawierającego Agrobacterium do tkanki roślinnej. Nasze wyniki wskazują, że agroinfiltracja zarówno metodą strzykawkową, jak i próżniową doprowadziła do skutecznego wprowadzenia Agrobacterium do liści i solidnej produkcji dwóch białek fluorescencyjnych; GFP oraz DsRed. Ponadto pokazujemy wyjątkowe zalety oferowane przez obie metody. Infiltracja strzykawkowa jest prosta i nie wymaga drogiego sprzętu. Pozwala również na elastyczność w infiltracji całego liścia za pomocą jednego genu docelowego lub wprowadzenia genów wielu celów na jednym liściu. Dzięki temu może być stosowany do ekspresji białek rekombinowanych w skali laboratoryjnej, a także do porównywania różnych białek lub wektorów pod kątem wydajności lub kinetyki ekspresji. Prostota infiltracji strzykawkowej sugeruje również jej przydatność w edukacji szkolnej i studenckiej w zakresie biotechnologii. Natomiast infiltracja próżniowa jest bardziej niezawodna i może być skalowana do komercyjnej produkcji białek farmaceutycznych. Zaletą jest również możliwość agroinfiltracji gatunków roślin, które nie są podatne na infiltrację strzykawkową, takich jak sałata i rzodkiewnik. Ogólnie rzecz biorąc, połączenie agroinfiltracji strzykawkowej i próżniowej zapewnia naukowcom i edukatorom prostą, wydajną i solidną metodologię przejściowej ekspresji białek. Znacznie ułatwi to rozwój białek farmaceutycznych i będzie promować edukację w zakresie nauk ścisłych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od lat siedemdziesiątych rośliny są badane jako alternatywa dla hodowli komórek ssaków, owadów i bakterii do komercyjnej produkcji rekombinowanych białek i terapii białkowych 1. Roślinne systemy do ekspresji biofarmaceutyków okazały się obiecujące w ostatnich latach, ponieważ kilka nowatorskich metod leczenia chorób, takich jak choroba Gauchera 2 i ptasia grypa H5N1 3, odniosło sukces w badaniach klinicznych. Rozwój kompetentnych mechanizmów ekspresji białek rekombinowanych w roślinach w ciągu dziesięcioleci, które upłynęły od tych początkowych eksperymentów, stworzył potencjał dla systemów roślinnych do zmiany obecnego paradygmatu pro....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzrost roślin

  1. Umieść 60 granulek torfu na tacy rozmnożeniowej. Dodaj 4 l wody z kranu i pozwól granulkom torfu wchłonąć wodę przez 2 godziny.
  2. Dodaj 2 nasiona N. benthamiana do każdej granulki torfu za pomocą siewnika, przykryj tacę przezroczystą plastikową kopułą i pozwól im wykiełkować w środowisku o temperaturze 25 °C i wilgotności 84% z 16/8 godzinnym cyklem dnia i nocy (Rysunek 1A).
  3. Zdejmij kopułę dwa tygodnie po wysianiu, spuść wodę z tacy i dodaj 2 litry nawozu Jack's o stężeniu 1,48 g/l (rysunek 1B). Kontynuuj uprawę roślin w środowisku o temperaturze 25 °C i wilgotności 50% z 16/8 go....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekspresja białek fluorescencyjnych przez infiltrację strzykawką

Aby zademonstrować skuteczność infiltracji Agrobacterium przez strzykawkę do tkanki roślinnej, przetestowaliśmy ekspresję dwóch białek fluorescencyjnych - GFP i DsRed - przez dwa różne zdekonstruowane wektory wirusowe roślin - geminiviral i MagnICON - u N. benthamiana. W przypadku liści N. benthamiana, które były całkowicie naciekane przez agrobakterie zawierające wektory geminiwirusowe, ekspres.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnące na całym świecie zapotrzebowanie na farmaceutyki białkowe wymaga nowych platform produkcyjnych, które są solidne, skalowalne, tanie i bezpieczne. Rośliny okazały się jednym z najbardziej obiecujących alternatywnych systemów produkcji białek farmaceutycznych. W ostatnich latach opracowanie zdekonstruowanych wektorów opartych na wirusach umożliwiło przejściową ekspresję białek w roślinach, co znacznie zwiększa szybkość i wydajność roślinnych systemów ekspresyjnych 2,10. Aby jeszcze bardziej zoptymalizowa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy R. Sunowi i innym studentom Laboratorium Chena za ich wkład w tworzenie materiału roślinnego. Dziękujemy również Dr. D. Green za wsparcie badań licencjackich w College of Technology and Innovation (CTI). Badania te były częściowo wspierane przez granty NIH U01 AI075549 i 1R21AI101329 dla Q. Chena oraz grant SSE od CTI z Arizona State University dla Q. Chena. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado i J. Stahnke są studentami studiów licencjackich wspieranymi przez grant SSE.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reodczynniki
GFP InvitrogenV353-20www.invitrogen.com Zobacz odniesienie: Lico i Chen, et al 2008
DsRedClontech632152www.clontech.com Zobacz odniesienie: Baird i Zacharias, et al 2000
MagnICON VectorIcon Geneticsn/awww.icongenetics.com Zobacz odniesienie: giritch i Marillonnet, et al 2006
GeminiviralVector Author' s Labn/aZobacz odniesienie: Chen and He, et al 2011
N. benthamianaAuthor' s Labn/aherbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens szczep gv3101Autor' s Labn/aZobacz odniesienie: Lai i Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, płytkiSigmaL0418www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, płytkiSigmaL0543www.sigmaaldrich.com
Siarczan magnezu hepa hydratSigmaM2773-500 gwww.sigmaaldrich.com
Bacto-TryptoneFisher73049-73-7www.fishersci.com
Ekstrakt drożdżowy BactoBecton, Dickinson CO.REF 212750www.bd.com
Difco Nutrient BulionBecton, Dickinson CO.REF 234000www.bd.com
MES hydrate BufferSigmaM8250-1kgwww.sigmaaldrich.com
CarbenicillinSigmaC1613-1MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"> www.sigmaaldrich.com
KanamycinSigma70560-51-9www.sigmaaldrich.com
Wodorotlenek soduSigma221465www.sigmaaldrich.com
Jack' s NawózHummert International25 lipcawww.hummert.com
Equipment
Vacuubrand MD4 Pompa próżniowaFisher13-878-113www.fishersci.com
Powietrze próżniowe Zawór regulacyjnyFisherNC9386590www.fishersci.com
Eksykator 12 1/8" z O-ringiemFisher08-594-15Cwww.fishersci.com
3 L PojemnikRubber-Maidn/aRubbermaid Servn' Miska oszczędnościowa, 10 filiżanek będzie działać
talerz/półka 230MLFisherNC9489269www.fishersci.com
Peat PelletHummert International14-2370-1www.hummert.com
Taca do rozmnażania Kopułahydrofarm132052www.hydroponics.net
Hydrofarm z tacą propagacyjną138758www.hydroponics.net
Siewnik ręczny VirboGro-Mor INCn/awww.gro-morent.com
Flora Cart 4 półkiHummert International65-6924-1www.hummert.com
15 ml Probówki hodowlane z okrągłym dnemSigmaCLS430172-500EAa href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com
SpektrofotometrBio-Rad170-2525www.bio-rad.com
Spektrofotometr KuwetyBio-Rad223-9950www.bio-rad.com
Probówki do mikrowirówekUSA Scientific1415-2500www.usascientific.com
Wirówka stołowaBio-Rad166-0602EDUa href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com
Inkubator/WytrząsarkaEppendorfExcella E25 www.eppendorf.com
Model światła ultrafioletowego#: UVGL-25UVP95-0021-12www.uvp.com
<<<

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
  2. Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AgroinfiltrationTransient ExpressionRecombinant ProteinsSyringe InfiltrationVacuum InfiltrationPlant BiotechnologyGFP ExpressionDsRed ExpressionAgrobacterium CulturePlant Transformation

Related Articles