Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Od lat siedemdziesiątych rośliny są badane jako alternatywa dla hodowli komórek ssaków, owadów i bakterii do komercyjnej produkcji rekombinowanych białek i terapii białkowych ¹. Roślinne systemy do ekspresji biofarmaceutyków okazały się obiecujące w ostatnich latach, ponieważ kilka nowatorskich metod leczenia chorób, takich jak choroba Gauchera ² i ptasia grypa H5N1 ³, odniosło sukces w badaniach klinicznych. Rozwój kompetentnych mechanizmów ekspresji białek rekombinowanych w roślinach w ciągu dziesięcioleci, które upłynęły od tych początkowych eksperymentów, stworzył potencjał dla systemów roślinnych do zmiany obecnego paradygmatu produkcji białek z trzech głównych powodów. Po pierwsze, nastąpił znaczny spadek kosztów, ponieważ bioreaktory ssaków, owadów i bakterii wymagają znacznych kosztów rozruchu, drogich pożywek wzrostowych i skomplikowanych procesów oczyszczania ⁴. Stworzenie stabilnych transgenicznych linii roślinnych pozwala im również wyprzedzić skalowalność innych systemów ekspresji, ponieważ rośliny wykazujące ekspresję białka mogą być uprawiane i zbierane na skalę rolniczą ⁵. Po drugie, roślinne systemy ekspresji znacznie zmniejszają ryzyko przeniesienia ludzkiego lub zwierzęcego patogenu z gospodarza wykazującego ekspresję białka na człowieka, co świadczy o ich wyższości w zakresie bezpieczeństwa publicznego ⁶. Wreszcie, rośliny wykorzystują eukariotyczny system endomembranowy, który jest podobny do komórek ssaków, co pozwala na prawidłową potranslacyjną modyfikację białek, w tym glikozylację i składanie białek wielopodjednostkowych ⁷. Ta zdolność stawia systemy roślinne przed tymi opartymi na systemach prokariotycznych, takich jak bakterie, ponieważ większa liczba farmaceutycznych białek rekombinowanych, w tym przeciwciał monoklonalnych (mAb), ma bardziej skomplikowaną strukturę i wymaga rozległych modyfikacji potranslacyjnych lub składania ⁸.

Istnieją dwa główne podejścia do wyrażania białek rekombinowanych w roślinach. Pierwszym z nich jest opracowanie stabilnej linii transgenicznej, w której DNA kodujące białko docelowe jest klonowane do kasety ekspresyjnej i wprowadzane do genomu jądrowego lub chloroplastowego. W ten sposób obce DNA staje się dziedziczne przez kolejne pokolenia i pozwala na ogromnie lepszą skalowalność, znacznie przewyższającą inne systemy ekspresji ¹. Wprowadzenie egzogennego DNA do genomu jądrowego następuje zwykle poprzez zakażenie tkanki roślinnej przez Agrobacterium tumefaciens lub, rzadziej, przez bombardowanie tkanki mikropociskami ⁹. Hormony roślinne są następnie wykorzystywane do indukowania różnicowania i wzrostu transgenicznych tkanek roślinnych, takich jak korzenie i liście. Transformacja genomu chloroplastów nie może być osiągnięta za pomocą A. tumefaciens, ale opiera się całkowicie na cząsteczkach złota lub wolframu pokrytych DNA wystrzeliwanym balistycznie do komórek roślinnych. Drugą metodą ekspresji białka rekombinowanego w roślinach jest ekspresja przejściowa ¹⁰. W tym scenariuszu wektory pochodzące od wirusa, które zawierają gen będący przedmiotem zainteresowania, są dostarczane przez A. tumefaciens do w pełni rozwiniętych roślin w procesie zwanym agroinfiltracją. Zamiast integrować się z genomem rośliny, dostarczony konstrukt genu zacznie kierować przejściową produkcją pożądanego białka, które można zebrać i wyizolować po krótkim okresie inkubacji. Przejściowa ekspresja genów ma tę zaletę, że zapewnia większą ogólną akumulację białka, a także lepszy czas produkcji białka, ponieważ rośliny będą gotowe do zbiorów około 1-2 tygodnie po agroinfiltracji ¹¹. Jest to znacznie szybsze niż procesy generowania, selekcji i potwierdzania stabilnych linii roślin transgenicznych, które mogą trwać od kilku miesięcy do roku. Jest to jednak również ograniczenie systemu ekspresji przejściowej, ponieważ nie da on genetycznie stabilnych linii roślin, które można wykorzystać do wygenerowania banku nasion do produkcji komercyjnej na dużą skalę. Mimo to opracowano podejścia mające na celu poprawę ekspresji przejściowej na dużą skalę. Tutaj pokazujemy jedną z metod generowania przejściowych roślin Nicotiana benthamiana wykazujących ekspresję białka przy użyciu zdekonstruowanych wektorów wirusowych dostarczanych przez A. tumefaciens.

Opracowywane są dwie główne metody dostarczania A. tumefaciens do tkanek roślinnych: infiltracja na skali laboratoryjnej za pomocą strzykawki i infiltracja na dużą skalę za pomocą komory próżniowej. Oba protokoły zostały opisane tutaj przy użyciu N. benthamiana, która jest blisko spokrewniona z pospolitą rośliną tytoniu, jako roślina żywicielska dla przejściowej ekspresji dwóch białek fluorescencyjnych: białka zielonej fluorescencji (GFP) z meduzy Aequorea victoria i białka czerwonej fluorescencji z Discosoma coral (DsRed) ^12,13. N. benthamiana jest najczęstszą rośliną żywicielską dla białka rekombinowanego, ponieważ jest podatna na transformację genetyczną, może szybko wytwarzać duże ilości biomasy i jest płodnym producentem nasion do produkcji na dużą skalę ¹⁴. Kolejną zaletą stosowania N. benthamiana jako gospodarzy do ekspresji białek jest dostępność różnorodnych wektorów ekspresyjnych ^2,5. W tym badaniu dwa zdekonstruowane wektory wirusowe, jeden oparty na systemie replikonów RNA wirusa mozaiki tytoniu (TMV) (wektory MagnICON), a drugi pochodzący z systemu replikonów DNA wirusa żółtego karła fasoli (BeYDV) (wektory geminiwirusowe) ^4,11,15-18 , są używane do przenoszenia genu GFP i DsRed i dostarczania ich do komórek N. benthamiana za pośrednictwem A. tumefaciens. Trzy konstrukty DNA zostaną wykorzystane do ekspresji GFP lub DsRed za pomocą wektorów MagnICON. Obejmują one moduł 5' (pICH15879) zawierający promotor i inne elementy genetyczne do kierowania ekspresją genu docelowego, moduł 3' zawierający gen będący przedmiotem zainteresowania (pICH-GFP lub pICH-DsRed) oraz moduł integrazy (pICH14011) kodujący enzym, który integruje moduły 5' i 3' razem po ekspresji ^8,15. Trzy konstrukty DNA są również potrzebne do ekspresji z wektorami geminiwirusowymi. Oprócz wektorów zawierających replikon genu docelowego ( pBYGFP lub pBYDsRed), do amplifikacji docelowego replikonu ^11,14,16 wymagane jest kodowanie wektorowe białka replikacyjnego (pREP110). Ponadto pożądane jest włączenie wektora kodującego supresor wyciszający p19 z wirusa karłowatości pomidora dla ekspresji genów docelowych ^{wysokiego poziomu 11,16}.

Ogólnie rzecz biorąc, istnieją trzy główne etapy wprowadzania genów białek rekombinowanych do komórek roślinnych poprzez agroinfiltrację, w tym wzrost roślin, przygotowanie kultury A. tumefaciens i infiltracja. Ponieważ każdy krok ma kluczowe znaczenie dla ostatecznego sukcesu tej procedury, poniżej znajduje się szczegółowy opis każdego z nich zarówno dla infiltracji strzykawki, jak i infiltracji próżniowej.

1. Wzrost roślin

1. Umieść 60 granulek torfu na tacy rozmnożeniowej. Dodaj 4 l wody z kranu i pozwól granulkom torfu wchłonąć wodę przez 2 godziny.
2. Dodaj 2 nasiona N. benthamiana do każdej granulki torfu za pomocą siewnika, przykryj tacę przezroczystą plastikową kopułą i pozwól im wykiełkować w środowisku o temperaturze 25 °C i wilgotności 84% z 16/8 godzinnym cyklem dnia i nocy (Rysunek 1A).
3. Zdejmij kopułę dwa tygodnie po wysianiu, spuść wodę z tacy i dodaj 2 litry nawozu Jack's o stężeniu 1,48 g/l (rysunek 1B). Kontynuuj uprawę roślin w środowisku o temperaturze 25 °C i wilgotności 50% z 16/8 godzinnym cyklem dnia i nocy. Dostarczaj 2 litry nawozu Jack's co 2 dni na tacę.
4. W 4. tygodniu przenieś rośliny z granulkami torfu na nową tacę, na której znajduje się sześć roślin, aby zapewnić odpowiednią przestrzeń do dalszego wzrostu (ryc. 1C), aż będą gotowe do infiltracji w wieku 6 tygodni (ryc. 1D).

2. A. tumefaciens Przygotowanie kultury

2.1 Przygotowanie do infiltracji strzykawki

1. Szczepy Streak A. tumefaciens GV3101 zawierające wektory geminiwirusowe p19, pREP110, pBYGFP i pBYDsRed na płytkach agarowych LB zawierających kanamycynę (100 μg/ml). Umieść jedną odmianę na talerzu i hoduj w temperaturze 30 °C przez 48 godzin.
2. Podobnie, smugi i wzrost szczepów GV3101 zawierających wektory MagnICON modułu 5' (pICH15879), modułu 3' zawierającego docelowy gen GFP lub DsRed (pICH-GFP lub pICH-DsRed) i integrazy (pCH14011) na płytkach agarowych LB zawierających karbenicylinę (100 μg / ml).
3. Z pojedynczej kolonii na płytce agarowej LB zaszczepić szczepy GV3101 zawierające wektory geminiwirusowe w 3 ml pożywki YENB (0,75% ekstraktu drożdżowego Bacto, 0,8% bulionu odżywczego, dostosować pH do 7,5 za pomocą NaOH) + kanamycyny (100 μg / ml) w 15 ml probówce do hodowli okrągłodennej, wyhodować płynną kulturę w temperaturze 30 °C w wytrząsarce przez noc z prędkością obrotową 300 obr./min.
4. Podobnie, zaszczepij i hoduj szczepy GV3101 zawierające wektory MagnICON w pożywce YENB + karbenicylina (100 μg/ml) w wytrząsarce przez noc w temperaturze 30 °C.
5. Zmierzyć i zapisać wartości OD₆₀₀ dla każdej ciekłej kultury za pomocą spektrofotometru i użyć poniższego wzoru do obliczenia niezbędnej objętości (_{V sub}) do subhodowli dla nowej kultury o początkowym OD₆₀₀ wynoszącym 0,025 w 10 ml pożywki YENB z odpowiednimi antybiotykami.
   V_sub (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD₆₀₀
6. Przenieść V_sub (ml) hodowli przez noc do (10 - V_sub) ml pożywki YENB z odpowiednimi antybiotykami dla każdego szczepu. Nową kulturę należy uprawiać przez noc w temperaturze 30 °C w wytrząsarce z prędkością obrotową 250 obr./min, aż wartość OD₆₀₀ znajdzie się w zakresie 1,7-2,0.
7. Zmierzyć i zapisać wartości OD₆₀₀ dla każdej ciekłej kultury i użyć poniższego wzoru do obliczenia niezbędnej objętości (V_inf), którą należy rozcieńczyć w 50 ml buforu infiltracyjnego, aby uzyskać końcowy OD₆₀₀ 0,12 dla każdego szczepu.
   V_inf (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD₆₀₀
8. Przenieść V_inf (ml) każdej kultury do probówki mikrowirówki i odwirować komórki przez odwirowanie przy 12 000 x g przez 2 minuty, usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w 10 ml buforze infiltracyjnym (10 mM MES, pH 5,5; 10 mM_MgSO4) przez krótkie wirowanie.
9. Wymieszać zawieszone komórki pBYGFP + pREP110 + p19, odwirować komórki w temperaturze 12 000 x g przez 2 minuty i ponownie zawiesić w sumie 50 ml buforu infiltracyjnego. Ta kombinacja agrobakterii służy do geminiwirusowej ekspresji GFP.
10. Podobnie, wymieszaj następujące kombinacje komórek Agrobacteria, odwiruj je i ponownie zawieś w 50 ml buforu infiltracyjnego. Obejmują one (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 dla geminiwirusowej ekspresji DsRed, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110 + p19 dla koekspresji geminiwirusa GFP i DsRed, (3) pREp110 + p19 jako negatywna kontrola ekspresji geminiwirusa, (4) pICH-GFP + pICH15879 + pCH14011 dla ekspresji MagnICON GFP, (5) pICH-DsRed + pICH15879 + pCH14011 dla ekspresji MagnICON oraz (6) pICH15879 + pCH14011 jako kontrola negatywna dla ekspresji MagnICON.

2.2 Przygotowanie do infiltracji próżniowej

1. Zaszczepić i wyhodować każdy szczep GV3101 zawierający wektory geminiwirusowe lub wektory MagnICON w 15 ml pożywki YENB z odpowiednimi antybiotykami w 50 ml autoklawizowanej kolbie i hodować przez noc, jak opisano powyżej dla infiltracji strzykawki.
2. Zmierzyć i zapisać wartości OD₆₀₀ dla każdej ciekłej kultury za pomocą spektrofotometru i użyć poniższego wzoru do obliczenia niezbędnej objętości (V_sub) do subhodowli dla nowej kultury o początkowym OD₆₀₀ wynoszącym 0,025 w 250 ml pożywki YENB z odpowiednimi antybiotykami><. V_sub (ml) = (250 ml) x (0,025) / OD₆₀₀
3. Przenieść V_sub (ml) nocnej hodowli do (250 - V_sub) ml pożywki YENB w autoklawizowanej kolbie o pojemności 1 l z odpowiednimi antybiotykami dla każdego szczepu i hodować nową kulturę przez noc, jak opisano powyżej dla infiltracji strzykawki.
4. Zmierzyć i zapisać wartości OD₆₀₀ dla każdej ciekłej kultury i użyć poniższego wzoru do obliczenia niezbędnej objętości (V_inf), którą należy rozcieńczyć w 3 litrach buforu infiltracyjnego, aby uzyskać końcowy OD₆₀₀ 0,12 dla każdego szczepu.
   V_inf (ml) = (3000 ml) x (0,12) / OD₆₀₀
5. Osadzać i ponownie zamieszać V_inf (ml) każdej kultury w buforze infiltracyjnym zgodnie z opisem dla infiltracji strzykawki i wymieszać ponownie zawieszone kultury zgodnie z kombinacjami opisanymi dla infiltracji strzykawki. Ponownie otocz wymieszane komórki agrobakterii i umieść je ponownie w 3 l buforu infiltracyjnego.

3. Infiltracja

3.1 Infiltracja strzykawki

1. Wybierz cztery 6-tygodniowe rośliny N. benthamiana z 5 liśćmi każda. Pierwsze trzy liście, licząc od wierzchołka każdej rośliny, zostaną całkowicie zinfiltrowane jedną z kombinacji szczepów A. tumefaciens w buforze infiltracyjnym. Czwarty liść zostanie naciekany punktowo wszystkimi czterema kombinacjami szczepów do ekspresji geminiwirusa lub wszystkimi trzema kombinacjami do ekspresji MagnICON. Ostatni liść na każdej roślinie zostanie zinfiltrowany kombinacjami kontroli ujemnych.
2. Utwórz małe nacięcie za pomocą igły w naskórku na tylnej stronie liścia (ryc. 2A). Uwaga: uważaj, aby nie zadrapać tak mocno, aby przebić liść z obu stron, ponieważ komórki Agrobacteria w mieszaninie infiltracyjnej przejdą przez nakłucie na drugą stronę liścia.
3. Chwyć mocno przednią stronę liścia i delikatnie wywierając przeciwny nacisk na nacięcie kciukiem jednej ręki, wstrzyknąć mieszaniny Agrobacterium w buforze infiltracyjnym do nacięcia za pomocą strzykawki bez igły (ryc. 2B). Uwaga: Gdy mieszanina Agrobacterium dostanie się do przestrzeni międzykomórkowej liścia, naciekany obszar zmieni widocznie kolor na ciemnozielony (ryc. 2C).
4. Kontynuuj wstrzykiwanie mieszanin Agrobacterium do nacięcia, aż ciemniejsze zielone kółko przestanie się rozszerzać. Utwórz kolejne nacięcie i powtarzaj kroki 3.1.2-3.1.4, aż cały liść zostanie naciekany i cały liść zmieni kolor na ciemnozielony dla pierwszych trzech liści i ostatniego liścia.
5. W przypadku czwartego liścia każdej rośliny wszystkie cztery (wektor geminiwirusowy) lub trzy (wektor MagnICON) kombinacje zostaną do niej przeniknięte. Zrób jedno nacięcie dla każdej kombinacji szczepów Agrobacterium i zinfiltruj każde nacięcie jedną kombinacją.
6. Po infiltracji przenieś rośliny z powrotem do pomieszczenia wzrostowego i monitoruj ekspresję białka między 2-15 dniem po infiltracji (dpi).

3.2 Infiltracja próżniowa

1. Umieścić wannę w eksykatorze próżniowym i przenieść do niej 3 l buforu infiltracyjnego zawierającego szczepy Agrobacterium. Podłączyć eksykator do membranowej pompy próżniowej Vacuubrand (Rysunek 3A).
2. Umieść roślinę do góry nogami na płycie eksykatora (Rysunek 3B) i opuść płytkę wraz z rośliną, aż cały system liści i łodyg zostanie zanurzony w buforze infiltracyjnym z płytką spoczywającą na górze wanny. Umieść O-ring eksykatora wzdłuż krawędzi i umieść pokrywę eksykatora na komorze (Rysunek 3C).
3. Włącz pompę próżniową i rozpocznij odmierzanie czasu, gdy podciśnienie osiągnie 100 mbar. Powoli otwórz zawór spustowy na eksykatorze po 1 minutach przy ciśnieniu 100 mbar, aby umożliwić przedostanie się agrobakterii do przestrzeni śródmiąższowych zanurzonej tkanki roślinnej. Powtórz ten krok jeszcze jeden raz, aby zapewnić dobrą infiltrację.
4. Po infiltracji wyjąć roślinę z eksykatora i ustawić ją z powrotem w pozycji pionowej. Przenieś rośliny z powrotem do pomieszczenia wzrostowego i monitoruj ekspresję białka w zakresie 2-15 dpi.

4. Wykrywanie i fotografowanie białek fluorescencyjnych

1. Zaczynając od 2 dpi, przenieś rośliny do ciemnego pomieszczenia i skieruj światło UV na tylną stronę infiltrowanych liści za pomocą ręcznej lampy UV.
2. Obserwuj zieloną fluorescencję GFP lub czerwoną fluorescencję DsRed. GFP emituje silniejszy sygnał w przypadku długofalowego światła UV, podczas gdy DsRed jest silniejszy w przypadku krótkofalowego światła UV.
3. Rób zdjęcia fluorescencyjnych liści zwykłym aparatem cyfrowym bez lampy błyskowej.
4. Przenieś rośliny z powrotem do pomieszczenia wzrostu po obserwacji lub fotografii.

1. Ekspresja białek fluorescencyjnych przez infiltrację strzykawką

Aby zademonstrować skuteczność infiltracji Agrobacterium przez strzykawkę do tkanki roślinnej, przetestowaliśmy ekspresję dwóch białek fluorescencyjnych - GFP i DsRed - przez dwa różne zdekonstruowane wektory wirusowe roślin - geminiviral i MagnICON - u N. benthamiana. W przypadku liści N. benthamiana, które były całkowicie naciekane przez agrobakterie zawierające wektory geminiwirusowe, ekspresję GFP obserwowano na całej powierzchni liści w świetle UV, zaczynając już od 2 dpi i osiągając szczytową akumulację przy 4 dpi (Figura 4C). Ta wczesna ekspresja GFP przez wektor geminiwirusowy jest zgodna z wcześniejszymi wynikami innych rekombinowanych białek 14,16,18,19. Natomiast liście naciekane kombinacjami Agrobacterium zawierającymi wektory MagnICON wykazywały fluorescencję GFP dopiero po 5 dpi i osiągnęły maksymalną akumulację przy 7 dpi (Figura 4D). Nie zaobserwowano zielonej fluorescencji z liści naciekanych kontrolnymi mieszaninami Agrobacterium pREP110 + p19 (Figura 4B) lub pICH15879 + pCH14011 (dane nie pokazane), co wskazuje, że fluorescencja była specyficzna dla genu GFP i nie była wynikiem fluorescencji tła z liści. W szczytowej akumulacji fluorescencja GFP wyrażanego przez wektor MagnICON jest bardziej intensywna niż wektora geminiwirusowego (Figura 4C i 4D), podobnie jak wyniki uzyskane wcześniej dla innych białek rekombinowanych 8,18. Wzorzec ekspresji czasowej i względna intensywność fluorescencji DsRed są podobne do GFP (dane nie pokazane). Nie zaobserwowano większej martwicy na liściach naciekanych konstruktami GFP (ryc. 4A). Podobne wyniki zaobserwowano również w przypadku roślin wykazujących ekspresję DsRed, co wskazuje, że żadne z białek fluorescencyjnych nie jest wysoce toksyczne dla komórek roślinnych. Zaobserwowano jednak miejscową martwicę w miejscu nacięcia, które na zdjęciach wyglądały jak "" (ryc. 4). Gdy oba białka fluorescencyjne uległy ekspresji na tym samym liściu za pośrednictwem wektorów geminiwirusowych z naciekiem strzykawkowym, wykryto je z oczekiwanym kolorem fluorescencyjnym w miejscu, w którym były naciekane (Figura 5). Co ciekawe, jednoczesna infiltracja GFP i DsRed spowodowała żółtawą fluorescencję (Figura 5). Intensywność fluorescencji DsRed okazała się słabsza niż GFP na tym samym liściu. Może to jednak nie odzwierciedlać słabszej ekspresji DsRed, ale raczej mniej niż optymalne wzbudzenie DsRed przez światło UV. Ogólnie rzecz biorąc, nasze wyniki pokazują, że infiltracja strzykawką skutecznie wprowadza rekombinowane agrobakterie przenoszące geny do liści roślin i skutkuje silną ekspresją naszych docelowych białek. Ponadto wykazaliśmy, że metoda ta pozwala na elastyczność w infiltracji całych liści w celu maksymalnej akumulacji jednego białka docelowego lub punktowej infiltracji wielu celów białkowych za pomocą wielu wektorów w celu porównania ich ekspresji i wzorca ekspresji.

2. Ekspresja białek fluorescencyjnych przez infiltrację próżniową

Infiltracja próżniowa została również zbadana w celu opracowania skalowalnej metody agroinfiltracji, która może być wykorzystana do produkcji na dużą skalę rekombinowanych białek przez roślinne systemy ekspresji przejściowej. Nasze wyniki wskazują, że czasowy wzorzec ekspresji GFP lub DsRed przez wektory geminiwirusowe i MagnICON nie został zmieniony przez zmianę metody infiltracji i pozostał podobny do infiltracji strzykawki. Ponieważ cały pęd rośliny jest zanurzony w mieszaninie infiltracyjnej podczas infiltracji próżniowej, zaobserwowano fluorescencję GFP (ryc. 6) dla wszystkich liści infiltrowanych roślin. W porównaniu z infiltracją strzykawkową jest bardziej wytrzymały i może osiągnąć infiltrację każdej rośliny w znacznie krótszym czasie. Na przykład, wykwalifikowany uczeń potrzebuje 15 minut, aby przeniknąć strzykawką do całej 6-tygodniowej rośliny N. benthamiana. W przeciwieństwie do tego, ta sama roślina może być infiltrowana w ciągu 3 minut przez próżnię od początku do końca, a wiele roślin może być infiltrowanych w tym samym czasie.

Rysunek 1. Wzrost roślin N. benthamiana za pomocą granulek torfu i tac wzrostowych. Rośliny typu dzikiego w 0 (A), 2 (B), 4 (C) i 6 (D) tygodniu po wysianiu.

Rysunek 2. Naciek strzykawkowy liści N. benthamiana z Agrobacterium tumefaciens. Szczep GV3101 A. tumefaciens zawierający wektory MagnICON wykazujące ekspresję GFP został ponownie zawieszony w buforze infiltracyjnym i załadowany do strzykawki bez igły. Nacięcie zostało utworzone za pomocą igły na tylnej stronie 6-tygodniowego liścia rośliny (A). Otwór strzykawki umieszczono przy nacięciu (B), a agrobakterie w buforze infiltracyjnym wstrzyknięto do przestrzeni międzykomórkowej liścia przez nacięcie (C).

Rysunek 3. Naciekanie próżniowe liści N. benthamiana przez Agrobacterium tumefaciens. Szczep GV3101 A. tumefaciens zawierający docelowe wektory eksprymujące białko zawieszono ponownie w buforze infiltracyjnym i załadowano do 3-litrowej wanny. Wannę umieszczono następnie w eksykatorze próżniowym, który był podłączony do pompy próżniowej (A). 6-tygodniową roślinę umieszczono do góry nogami na płycie eksykatora (B). Cały system liści i łodyg został następnie zanurzony w wannie, gdy płyta została umieszczona na szczycie komory (C). Agroinfiltrację osiągnięto poprzez dwukrotne zastosowanie i uwolnienie próżni o ciśnieniu 100 mbar przez 1 minutę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą liczbę.

Rysunek 4. Ekspresja GFP w liściach agroinfiltrowanych strzykawki. Całe liście N. benthamiana były infiltrowane szczepem GV3101 A. tumefaciens zawierającym gen GFP w wektorze geminiwirusowym (A i C) lub MagnICON (D). Liście kontroli ujemnej zostały naciekane szczepami agrobakterii, które nie zawierają tego genu GFP (B). Liście fotografowane były w świetle białym (A) lub UV (B-D) o rozdzielczości 4 dpi (A-C) lub 7 dpi (D).

Rysunek 5. Ekspresja GFP i DsRed w liściach strzykawkowych agroinfiltrowanych. Liście N. benthamiana były naciekane punktowo przez GV3101 zawierający geny GFP, DsRed lub zarówno GFP, jak i DsRed w wektorach geminiwirusowych. Punkt kontroli ujemnej infiltrowano pREP110+p19. Liście zostały sfotografowane w świetle UV w rozdzielczości 4 dpi.

Rysunek 6. Ekspresja GFP w liściach agroinfiltrowanych próżniowo. Liście N. benthamiana zostały naciekane przez GV3101 zawierającego gen GFP w wektorach MagnICON. Liście zostały sfotografowane w świetle UV w rozdzielczości 7 dpi.

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.