Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Znakowanie metaboliczne bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych 1 i 2 radioaktywnym fosforanem

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50523

⸱

18 września 2013

 ,  , 
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven and Leuven Institute for Neuroscience and Disease (LIND)

W tym artykule

Podsumowanie

Bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe 1 i 2 (LRRK1 i LRRK2) są wielodomenowymi białkami, które kodują zarówno domeny GTPazy, jak i kinazy, i które są fosforylowane w komórkach. W tym miejscu przedstawiamy protokół znakowania LRRK1 i LRRK2 w komórkach za pomocą ortofosforanu 32P, zapewniając w ten sposób sposób sposób sposób sposób na pomiar ich ogólnego poziomu fosforylacji komórkowej.

Streszczenie

Bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe 1 i 2 (LRRK1 i LRRK2) są paralogami, które mają podobną organizację domenową, w tym domenę kinazy serynowo-treoninowej Ras (ROC), C-koniec domeny ROC (COR) oraz bogate w leucynę i ankyrynowe powtórzenia na N-końcu. Dokładne role komórkowe LRRK1 i LRRK2 nie zostały jeszcze wyjaśnione, jednak LRRK1 jest zaangażowany w sygnalizację receptora kinazy tyrozynowej1,2, podczas gdy LRRK2 jest zaangażowany w patogenezę choroby Parkinsona3,4. W niniejszym raporcie przedstawiamy protokół znakowania białek LRRK1 i LRRK2 w komórkach ortofosforanem 32P, zapewniając w ten sposób sposób sposób sposób sposób pomiar ogólnych poziomów fosforylacji tych 2 białek w komórkach. Krótko mówiąc, białka LRRK znakowane powinowactwem ulegają ekspresji w HEK293T komórkach, które są wystawione na działanie pożywki zawierającej 32P-ortofosforany. 32P-ortofosforan jest asymilowany przez komórki już po kilku godzinach inkubacji, a wszystkie cząsteczki w komórce zawierające fosforany są w ten sposób znakowane radioaktywnie. Za pomocą znacznika powinowactwa (3xflag) białka LRRK są izolowane od innych składników komórkowych przez immunoprecypitację. Immunoprecytaty są następnie rozdzielane za pomocą SDS-PAGE, osuszane do membran PVDF, a analiza włączonych fosforanów jest przeprowadzana za pomocą autoradiografii (sygnał 32P) i zachodniej detekcji (sygnał białkowy) białek na plamach. Protokół można łatwo dostosować do monitorowania fosforylacji dowolnego innego białka, które może ulegać ekspresji w komórkach i izolować przez immunoprecypitację.

Wprowadzenie

Bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe 1 i 2 (LRRK1 i LRRK2) są wielodomenowymi paralogami, które mają podobną organizację domenową. Oba białka kodują sekwencję GTPazy podobną do rodziny Ras GTPaz (Ras of Complex Proteins lub ROC), a także C-koniec domeny ROC (COR), skutecznie klasyfikując oba białka do rodziny białek ROCO5,6. N-koniec tandemu domeny ROC-COR, oba białka kodują bogatą w leucynę domenę powtórzeniową, a także domenę podobną do ankyryny, podczas gdy tylko LRRK2 koduje dodatkową kopułę pancernika6-8. C-koniec ROC-COR, oba białka mają wspólną domenę kinazy serynowo-treoninowej podczas gdy tylko LRRK2 koduje domenę WD40 w regionie C-końcowym8. Dokładne role komórkowe LRRK1 i LRRK2 nie zostały jeszcze wyjaśnione, jednak LRRK1 jest zaangażowany w sygnalizację receptora kinazy tyrozynowej1,2 , podczas gdy dowody genetyczne wskazują na rolę LRRK2 w patogenezie choroby Parkinsona3,4 .

Fosforylacja białek jest powszechnym mechanizmem regulacyjnym w komórkach. Na przykład fosforylacja może być niezbędna do aktywacji enzymów lub rekrutacji białek do kompleksu sygnalizacyjnego. Fosforylacja komórkowa LRRK2 została szeroko scharakteryzowana, a mapowanie fosfozytów wykazało, że większość miejsc fosforylacji komórkowej występuje w klastrze między powtórzeniami ankyryny i domenami powtórzeń bogatych w leucynę9-11. Chociaż miejsca fosforylacji komórkowej LRRK1 nie zostały jeszcze zmapowane, dowody z badań wykorzystujących barwienie fosfoproteinami blotów immunoprecypitowanego białka LRRK1 z komórek COS7 sugerują, że białko LRRK1 jest fosforylowane w komórkach12.

Ten artykuł zawiera podstawowy protokół do oznaczania ogólnego poziomu fosforylacji LRRK1 i LRRK2 w liniach komórkowych za pomocą znakowania metabolicznego za pomocą 32P-ortofosforanu. Ogólna strategia jest prosta. Białka LRRK znakowane powinowactwem ulegają ekspresji w HEK293T komórkach, które są wystawione na działanie pożywki zawierającej 32P-ortofosforany. 32P-ortofosforan jest asymilowany przez komórki już po kilku godzinach inkubacji, a wszystkie cząsteczki w komórce zawierające fosforany są w ten sposób znakowane radioaktywnie. Znacznik powinowactwa (3xflag) jest następnie używany do izolowania białek LRRK od innych składników komórkowych za pomocą immunoprecypitacji. Immunoprecytaty są następnie rozdzielane za pomocą SDS-PAGE, osuszane do membran PVDF, a analiza włączonych fosforanów jest przeprowadzana za pomocą autoradiografii (sygnał 32P) i zachodniej detekcji (sygnał białkowy) białek na plamach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Obecny protokół wykorzystuje radioaktywny ortofosforan 32znakowany P do śledzenia fosforylacji komórkowej LRRK2. Należy pamiętać, że wszystkie operacje z odczynnikami promieniotwórczymi powinny być wykonywane przy użyciu odpowiednich środków ochronnych, aby zminimalizować narażenie operatora i środowiska na promieniowanie promieniotwórcze. Związki zawierające izotopy emitujące promieniowanie jonizujące mogą być szkodliwe dla zdrowia ludzkiego, a ich stosowanie jest kontrolowane przez ścisłe licencje i przepisy na poziomie instytucjonalnym i krajowym. Eksperymenty w tym protokole zostały przeprowadzone po przeszkoleniu w zakresie stosowania promieniowania open source na Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven) i zgodnie z wytycznymi dobrej praktyki laboratoryjnej dostarczonymi przez wydział zdrowia, bezpieczeństwa i środowiska na uniwersytecie. Kilka kroków w naszym protokole jest szeroko stosowanych, takich jak hodowla komórkowa, SDS-PAGE, western blotting, a tutaj podano szczegóły protokołu stosowanego w naszym laboratorium. Należy zauważyć, że dokładne warunki eksperymentu różnią się w zależności od laboratorium; W związku z tym szczególne środki mające na celu zapewnienie właściwego obchodzenia się z materiałami promieniotwórczymi powinny być dostosowywane do każdego nowego środowiska laboratoryjnego.

Użycie promieniowania open source podlega uprzedniemu zatwierdzeniu przez organy regulacyjne, a organ regulacyjny odpowiedzialny za promieniowanie open source w badaniach laboratoryjnych różni się w zależności od kraju. Użytkownicy powinni skonsultować się ze swoim instytucjonalnym specjalistą ds. bezpieczeństwa radiologicznego, aby upewnić się, że procedura jest zgodna z lokalnymi przepisami i regulacjami. Informacje na temat organów regulacyjnych można znaleźć: w Belgii Federalną Agencję Kontroli Jądrowej (http://www.fanc.fgov.be, stronę internetową w języku francuskim lub niderlandzkim), w Wielkiej Brytanii – Health and Safety Executive (http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm), w Stanach Zjednoczonych – Nuclear Regulatory Commission ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html), w Kanadzie Kanadyjska Komisja Bezpieczeństwa Jądrowego (http://nuclearsafety.gc.ca/eng/), a w Niemczech Das Bundesamt für Strahlenschutz (http://www.bfs.de/de/bfs). Środki ostrożności związane z tym protokołem zostały odnotowane w tekście, wyróżnionym symbolem radioaktywnej koniczyny (figure-protocol-1).

1. Metaboliczne znakowanie komórek

  1. Przygotuj komórki do etykietowania.
    1. Hodowla HEK293T linii komórkowych zgodnie ze standardowymi warunkami hodowli (37 °C, 5% CO2 ) w DMEM z 8% płodową surowicą cielęcą i gentamycyną.
    2. Rozwiń komórki na tyle, aby uzyskać co najmniej 1 x 106 komórek na próbkę do testu.
    3. Trypsynizuj komórki i rozłóż je na 6 dołkach (średnica 35 mm) w 106 komórkach / dołku.
    4. 24 godziny po wysianiu komórek ekspresja białka 3xflag-LRRK2 poprzez transfekcję lub transdukcję za pośrednictwem wektora lentiwirusowego.
      1. Do transfekcji wymieszać na próbkę 4 μg DNA (pCHMWS-3xflag-LRRK2 plazmid13-15 lub pCHMWS-3xflag-LRRK1 plazmid15) i 8 μl liniowego polietylenoiminy (liniowy PEI, 1 mg/ml) z 80 μl DMEM (bez dodatków). Pozostaw do stężenia na 15-30 minut, a następnie dodaj kompleks do komórek, dobrze mieszając z obecnym podłożem.
      2. W przypadku transdukcji za pośrednictwem wektora lentiwirusowego należy rozcieńczyć wektor lentiwirusowy kodujący 3xflag-LRRK1 lub -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, z reguły transdukować z dwukrotnie większą liczbą jednostek transdukcyjnych, tj. liczbą funkcjonalnych cząstek wektora lentiwektora, niż jest komórek) do pożywki hodowlanej. Opis produkcji LV-3xflag-LRRK1/2 został wcześniej opisany15.
    5. Gdy komórki są w 80-100% zlewające się (około 48 godzin po transfekcji lub transdukcji), przepłucz komórki wstępnie podgrzanym (37 °C) DMEM bez fosforanów.
  2. Oznacz komórki 32P-ortofosforanem.
    1. Należy pamiętać o ogólnych zasadach bezpieczeństwa podczas pracy z promieniowaniem.
      1. figure-protocol-2Wykonaj wszystkie operacje z 32P w wyznaczonym obszarze promieniowania.
      2. figure-protocol-3Należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej - zgodnie ze standardową procedurą operacyjną w naszym laboratorium są to fartuch laboratoryjny, podwójne rękawice i okulary ochronne.
      3. figure-protocol-4Wszystkie prace z 32P powinny być osłonięte przed użytkownikami przez 6-milimetrowe ekrany z pleksiglasu, aby zminimalizować ekspozycję.
      4. figure-protocol-5Zawsze należy używać osobistych urządzeń monitorujących - w KUL wszyscy certyfikowani użytkownicy promieniowania open source noszą plakietkę z filmu przymocowaną do kieszeni na piersi fartucha laboratoryjnego, aby monitorować narażenie na promieniowanie podczas eksperymentów.
      5. figure-protocol-6 Wszystkie powierzchnie eksperymentalne powinny być oceniane pod kątem radioaktywności przed i po użyciu za pomocą licznika Geigera.
      6. figure-protocol-7Wszystkie potencjalnie skażone materiały eksploatacyjne powinny być utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi usuwania odpadów radioaktywnych.
    2. Pod przepływem laminarnym przygotować probówkę Falcona z 2,1 ml DMEM bez fosforanów (wstępnie podgrzanych do 37 °C) na 6-dołkową płytkę komórek do znakowania.
      1. Na przykład, aby oznaczyć komórki we wszystkich studzienkach płytki 6-dołkowej, przygotuj 12,6 ml pożywki (= 6 x 2,1). Ma to na celu zapewnienie użycia 2 ml pożywki na 6-dołkową płytkę z komórek o 5% nadwyżce objętości.
    3. figure-protocol-8Przygotuj stanowisko, na którym będą przeprowadzane eksperymenty z promieniowaniem jonizującym. Przestrzeń robocza pokryta jest matą rozlewną, na której umieszczona jest ochronna wyściółka z materiału chłonnego. W przypadku, gdy używasz wkładki z jedną wodoodporną powierzchnią, umieść ją chłonną stroną do góry.
    4. figure-protocol-9Zaopatrz się również w słoik z pleksiglasu w miejscu pracy i umieść w nim tubkę z podłożem bezfosforanowym.
    5. figure-protocol-10Wyjmij z lodówki wyłożony ołowiem pojemnik z fiolką ortofosforanu oznaczonego 32P i przynieś go do stołu radioaktywnego. Monitorować pojemnik pod kątem zewnętrznego skażenia radioaktywnego za pomocą licznika Geigera.
    6. figure-protocol-11Rozcieńczyć ortofosforan znakowany 32P do probówki DMEM bez fosforanów w stężeniu 24 μCi/ml.
      1. Uwaga: przy 2 ml na 6-dołkową płytkę z komórkami odpowiada to 5 μCi 32P znakowanego ortofosforanem/cm2 hodowanych komórek.
      2. figure-protocol-12Trzymaj tubę w słoiku z pleksiglasu.
    7. figure-protocol-13Zamknij pojemnik z pozostałą częścią ortofosforanu oznaczonego 32P i włóż go do lodówki.
    8. figure-protocol-14Wyjmij z inkubatora 6-dołkowe płytki z komórkami, które mają być oznaczone, i umieść je na stole radioaktywnym.
    9. figure-protocol-15Usuń supernatant i wyrzuć. Dodać 2 ml pożywki bezfosforanowej zawierającej ortofosforan znakowany 32P/basenik.
    10. figure-protocol-16Umieść płytki hodowlane w pudełku z pleksiglasu, a następnie monitoruj pojemnik pod kątem zewnętrznego skażenia radioaktywnego za pomocą licznika Geigera.
    11. figure-protocol-17Przenieś pudełko z pleksiglasu z komórkami do inkubatora komórek eukariotycznych dedykowanego do izotopowego znakowania metabolicznego.
    12. figure-protocol-18Inkubować przez 1-20 godzin w temperaturze 37 °C w 5% CO2.
      1. Ogólnie rzecz biorąc, zalecany jest czas włączenia wynoszący 3 godziny lub więcej. Optymalny czas inkubacji można ocenić za pomocą eksperymentów w czasie dla każdego konkretnego białka zgodnie z potrzebami.
    13. figure-protocol-19Opcjonalnie: potraktuj komórki związkiem.
      1. W eksperymentach z leczeniem związkami (takimi jak inhibitor kinazy), etap leczenia związkiem jest włączany po początkowym czasie inkubacji bez związku, aby umożliwić znakowanie. Po upływie pożądanego czasu inkubacji, pudełko z pleksiglasu zawierające płytki hodowlane wyjmuje się z inkubatora i przenosi na stanowisko radioaktywne.
      2. figure-protocol-20Pożywka do etykietowania jest usuwana i zastępowana wstępnie podgrzanym podłożem bezfosforanowym, do którego związek jest rozcieńczany w pożądanym stężeniu. Wyrzuć pożywkę do probówki o pojemności 50 ml do zbierania odpadów, którą umieszcza się w słoiku z pleksiglasu.
      3. figure-protocol-21Komórki są umieszczane w pudełku z pleksiglasu i umieszczane w inkubatorze komórek na żądany czas kontaktu.
  3. figure-protocol-22Zbierz lizaty oznaczonych komórek.
    1. figure-protocol-23Usuń podłoże z komórek i wyrzuć do probówki do zbierania odpadów, która jest umieszczona w słoiku z pleksiglasu.
    2. figure-protocol-24Płucz komórki 2x lodowatym TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, 2 ml/płukanie), wylewając roztwór płuczący do probówki do pojemnika na odpady umieszczonej w słoiku z pleksiglasu.
    3. figure-protocol-25Dodaj 0,5 ml lodowatego buforu do lizy immunoprecypitacji (IP) do każdej studzienki i zbierz lizat, pipetując lizat w górę i w dół, aby rozluźnić wszystkie zlizowane komórki.
      1. Przygotuj wymaganą objętość buforu do lizy IP (0,5 ml/próbkę plus 5% nadmiaru) z wyprzedzeniem, dodając koktajl inhibitorów proteazy i koktajl inhibitorów fosfatazy świeży tuż przed użyciem.
      2. Skład buforu do lizy to Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton 1%, Glicerol 10%, koktajl inhibitorów proteazy i koktajl inhibitorów fosfatazy.
    4. figure-protocol-26Przenieś lizat do probówki mikrowirówki i inkubuj na lodzie przez co najmniej 10 minut.
    5. figure-protocol-27Odwiruj lizaty w mikrowirówce przy >5,000 x g przez 10 min.
    6. figure-protocol-28Odpady radioaktywne należy wyrzucać do specjalnych pojemników na odpady, które są przechowywane za osłonami z pleksiglasu.

2. Analizuj etykietowanie interesujących białek

  1. figure-protocol-29Wyizoluj interesujące białko metodą immunooczyszczania (IP).
    1. figure-protocol-30Przenieś probówki do mikrowirówek z odwirowanymi lizatami z powrotem do lodu i odpipetuj supernatant do probówki mikrowirówki zawierającej 10 μl objętości złoża zrównoważonych kulek agarozowych flag-M2.
      1. Przygotuj probówki z równowagowymi koralikami agarozowymi flag-M2 z wyprzedzeniem.
      2. W tym celu należy odpipetować objętość zawiesiny agarozowej flag-M2 odpowiadającą objętości złoża 10 μl na próbkę plus 5% nadwyżki.
        1. Ogólnie rzecz biorąc, objętość złoża kulek wynosząca 10 μl odpowiada 20 μl gnojowicy. Więcej informacji można znaleźć w karcie danych produktu.
      3. Zrównoważyć kulki, przepłukując 3x w 10 objętościach (w stosunku do objętości złoża) buforu do lizy IP.
      4. Rozprowadź równowagi kulki równomiernie przy objętości złoża 10 μl na probówkę w tylu probówkach, ile jest próbek. Oznaczyć probówki identyfikatorem dla każdej próbki.
    2. figure-protocol-31Przenieś probówki do probówek o pojemności 50 ml (około 6 probówek do mikrowirówek/probówkę 50 ml) oznaczonych symbolem radioaktywnej koniczyny i trzymaj na lodzie.
    3. figure-protocol-32Przenieś próbki do urządzenia obracającego się za osłoną z pleksiglasu w wyznaczonym obszarze chłodni w celu mieszania koniec po końcu w temperaturze 4 °C przez 1-20 godzin.
    4. figure-protocol-33Przenieś próbki do wyznaczonego miejsca pracy na lodzie.
    5. figure-protocol-34Odkręć w mikrowirówce (1,000 x g, 1 min) związane z białkiem kulki agarozowe flag-M2 i wyrzuć supernatant do probówki do pojemnika na odpady.
    6. figure-protocol-35Umyj kulki agarozowe związane z białkiem M2 przez ponowne zawieszenie w 1 ml bufora do płukania IP.
      1. Skład bufora płuczącego IP: Tris 25 mM pH 7,5, NaCl 400 mM, Triton 1%. Zaleca się również włączenie inhibitorów proteazy i fosfatazy do buforu płuczącego dla białek wrażliwych na degradację przez proteazy współoczyszczające lub na defosforylację przez fosfatazy oczyszczające.
      2. figure-protocol-36Odkręć w mikrowirówce (1,000 x g, 1 min) związane z białkiem kulki agarozowe flag-M2 i wyrzuć supernatant do probówki do pojemnika na odpady.
      3. figure-protocol-37Powtórz krok prania 3x.
    7. figure-protocol-38Po umyciu ponownie zawieś kulki w 1 ml buforu do płukania IP (Tris 25 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, ditiotreitol (DTT) 2 mM, Triton 0,02%, beta-glicerofosforan 5 mM, Na3VO4 0,1 mM).
    8. figure-protocol-39Odkręć w mikrowirówce (1,000 x g, 1 min) kulki agarozowe związane z białkiem flaga-M2 i wyrzuć supernatant do probówki do pojemnika na odpady. Usuń cały nadmiar bufora.
    9. figure-protocol-40Zawieś koraliki w 40 μl bufora ładującego SDS próbki IP (Tris-HCl 160 mM pH 6,8, SDS 2%, DTT 0,2 M, glicerol 40%, błękit bromofenolowy 2 mg/ml).
      1. Próbki mogą być analizowane natychmiast lub przechowywane w zamrażarce o temperaturze -20 °C do dalszej analizy.
        1. figure-protocol-41Aby przechowywać próbki w temperaturze -20 °C, umieść próbki w uchwytach na probówki lub pudełkach w pudełku z pleksiglasu w radioaktywnej zamrażarce z symbolem koniczyny, przeznaczonej do przechowywania próbek radioaktywnych.
    10. figure-protocol-42Odpady radioaktywne należy wyrzucać do specjalnych pojemników na odpady, które są przechowywane za osłonami z pleksiglasu.
  2. figure-protocol-43Rozwiąż próbki IP za pomocą SDS-PAGE i zniszcz membranę PVDF.
    1. figure-protocol-44Podgrzewaj próbki w buforze ładującym do 95 °C przez 2 minuty i odwiruj przez 1 minutę przy >1,000 x g, aby granulować kulki.
    2. figure-protocol-45Przygotuj moduł elektroforezy w żelu białkowym na stole radioaktywnym za ekranem z pleksiglasu.
    3. figure-protocol-46Załaduj próbki na 3-8% tris-acetatowe żele SDS-PAGE.
      1. Ten rodzaj żelu nadaje się do rozpuszczania białek o dużej masie cząsteczkowej (HMW). Mogą być również odpowiednie inne rodzaje żeli, takie jak żel 4-20% Bis-Tricine lub żele Tris-glycine 4-20%.
      2. Dołącz marker masy cząsteczkowej, który jest odpowiedni do rozróżnienia rozmiarów białek HMW.
    4. figure-protocol-47Wykonaj elektroforezę pod napięciem 150 V przez 1 godzinę.
    5. figure-protocol-48Po elektroforezie wyjmij żel z plastikowej osłonki i przenieś żel do pojemnika z buforem do transferu Western blotting.
      1. Skład buforu transferowego Western blot: Tris 50 mM, Glicyna 40 mM, SDS 0,04%, Metanol 20%.
      2. figure-protocol-49Odetnij części żelu, które wystają, takie jak separatory studzienek i dolna część żelu, która wystaje.
    6. Przygotować jedną membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) na żel, zanurzając w metanolu na 1 minutę, a następnie umieścić w buforze transferowym.
      1. Membrany są przycinane do tego samego rozmiaru co żel plus margines 3 mm.
    7. Umieścić półsuchy moduł bibuły na stole radioaktywnym i zdjąć pokrywę oraz górną płytkę elektrody.
    8. figure-protocol-50Przygotuj kanapkę z bibułą na powierzchni modułu do bibuły półsuchej.
      1. Zwilż bardzo gruby (2,5 mm grubości, 7,5 x 10 cm duży) filtr bibułkowy w buforze transferowym i umieść na dolnej płycie modułu bibuły.
      2. figure-protocol-51Umieść wstępnie zwilżoną membranę PVDF na filtrze bibułkowym.
      3. figure-protocol-52Ostrożnie umieść żel na membranie PVDF i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza.
      4. figure-protocol-53Uzupełnij kanapkę z blotem, zwilżając bardzo gruby filtr blottingu w buforze transferowym i umieść na dolnej płycie modułu bibuły. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza, które ostatecznie znajdują się w kanapce do bibuły.
        Należy pamiętać, że podany tutaj opis jest zgodny z systemem trans-blot SD firmy BioRad, w którym elektrody są takie, że białka migrują w dół na błonę. Inne systemy blottingu są również kompatybilne z tymi krokami z niewielkimi dostosowaniami, takimi jak te, które ostatecznie muszą uwzględnić inny kierunek blottingu lub, w przypadku blottingu w zbiorniku, dodatkowe odpady płynne, które należy usunąć w taki sam sposób, jak powyższy bufor do elektroforezy.
    9. figure-protocol-54Usuń nadmiar buforu za pomocą chłonnej chusteczki i umieść górną płytkę oraz pokrywę modułu do półsuchego bibuły.
    10. figure-protocol-55Przenoszenie białek pod napięciem 15 V przez 1-2 godziny.
    11. figure-protocol-56W tym czasie wyczyść moduł elektroforezy.
      1. figure-protocol-57Odpady radioaktywne należy wyrzucać do specjalnych pojemników na odpady, które są przechowywane za osłonami z pleksiglasu.
      2. figure-protocol-58Przepłucz moduł elektroforezy wodą destylowaną (AD) i wylej wodę do płukania pojemnika na odpady radioaktywne.
    12. figure-protocol-59Po przeniesieniu, usuń membranę PVDF z białkiem z modułu bibuły.
    13. figure-protocol-60Opcjonalnie: wykonaj barwienie Bangle S w celu wizualizacji białek.
      1. figure-protocol-61Przenieś blot do płytkiego naczynia do inkubacji zawierającego roztwór Ponceau S i inkubuj przez 5 minut.
      2. figure-protocol-62Szybko spłucz 2x w AD.
    14. figure-protocol-63Wysusz membranę.
  3. figure-protocol-64Wykonaj autoradiografię.
    1. figure-protocol-65Wystaw membranę na działanie płytki fosforescencyjnej przez 1-5 dni.
    2. figure-protocol-66Odczytaj 32P z odsłoniętej płyty fosforescencyjnej za pomocą skanera fosforescencji Storm 840 lub jego odpowiednika i zapisz obraz jako plik o wysokiej rozdzielczości.
  4. figure-protocol-67 Wykrywanie poziomu białka za pomocą immunodetekcji.
    1. figure-protocol-68Ponownie nawodnić błony, zanurzając je na krótko w metanolu, a następnie przenieść do płytkiego naczynia do inkubacji blot z PBS.
    2. figure-protocol-69Zablokuj błony w PBS-T (PBS z 0,1% Tritonem) zawierającym 5% mleka.
    3. figure-protocol-70Inkubuj bloty z przeciwciałem anty-LRRK213,16 lub przeciwciałem antyflagowym i przetwarzaj dalej, stosując odpowiednie etapy mycia i inkubację przeciwciał wtórnych.
    4. figure-protocol-71Wykonaj detekcję chemiluminescencji, aby potwierdzić względne poziomy białka LRRK2.
  5. Określ ilościowo włączenie 32P do LRRK2.
    1. Wykonaj analizę densytometryczną prążków na autoradiogramach blot i immunoreaktywności za pomocą odpowiedniego oprogramowania, takiego jak oprogramowanie ImageJ, darmowy program dostępny na stronie internetowej National Institutes of Health (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
    2. Obliczyć poziomy włączenia fosforanów jako stosunek sygnału autoradiograficznego do poziomu immunoreaktywności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby porównać ogólne poziomy fosforylacji LRRK1 i LRRK2 w komórkach, 3xflag oznaczone jako LRRK1 i LRRK2 zostały wyrażone w HEK293T komórkach15. Komórki hodowano na płytkach 6-dołkowych i znakowano 32P i analizowano zgodnie z powyższym opisem w tekście protokołu. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne wyniki znakowania metabolicznego LRRK1 i LRRK2 w komórkach HEK293T. Włączenie radioaktywnych fosforanów obserwuje się zarówno dla LRRK1, jak i LRRK2. Po ilościowym określeniu poziomów

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono podstawowy protokół oznaczania ogólnego poziomu fosforylacji LRRK1 i LRRK2 w liniach komórkowych za pomocą znakowania metabolicznego za pomocą 32P-ortofosforanu. Ogólna strategia jest prosta. Białka LRRK znakowane powinowactwem ulegają ekspresji w HEK293T komórkach, które są wystawione na działanie pożywki zawierającej 32P-ortofosforany. 32P-ortofosforan jest asymilowany przez komórki już po kilku godzinach inkubacji, a wszystkie cząsteczki w komórce zawierające f...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy również wdzięczni Fundacji Michaela J. Foxa, która wspiera to badanie. Dziękujemy Fundacji Badawczej - Flandria FWO (projekt FWO G.0666.09, stypendium dla starszych badaczy w JMT), projektowi IWT SBO/80020 Neuro-TARGET, KU Leuven (OT/08/052A i IOF-KP/07/001) za ich wsparcie. Badania te były również częściowo wspierane przez Fundusz Druwé-Eerdekens zarządzany przez Fundację Króla Baudouina na rzecz JMT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Radionuklid fosforu-32, 1 mCi, bufor fosforanu disodu w 1 ml wodyPerkin ElmerNEX011001MC
Dulbecco’ s Zmodyfikowane podłoże Eagle (D-MEM) (1X), płynne (o wysokiej zawartości glukozy)Invitrogen11971-025To podłoże nie zawiera fosforanów
Żel powinowactwa Anti Flag M2SigmaA2220Aby uzyskać równoważny produkt z żelem w kolorze czerwonym (przydatny do łatwiejszej wizualizacji koralików), użyj cat. Nr F2426.
Ekstra gruby filtr bibułkowyBio-Rad1703965
Ponceau S roztwórSigmaP7170

Bibliografia

  1. Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158(2011).
  2. Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
  3. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
  4. Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
  5. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
  6. Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
  7. Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
  8. Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
  9. Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
  10. Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
  11. Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
  12. Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
  13. Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
  14. Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
  15. Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472(2012).
  16. Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
  17. Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
  18. Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16(2010).
  19. Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
  20. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
  21. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).
  22. Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153(2011).
  23. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

LRRK1 LRRK2immunoprecypitacjaSDS-PAGEautoradiografiaWestern blotkomórki HEK293Tanaliza fosforylacjidetekcja izotopów promieniotwórczych
Znakowanie metaboliczne bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych 1 i 2 radioaktywnym fosforanem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.