Metody wykonywania krzyżówek w Setaria viridis, nowym systemie modelowym dla traw

Podsumowanie

Opracowaliśmy metodologię przeprowadzania krzyżówek w Setaria viridis (S. viridis). Metoda polega na przycięciu wiechy przed zabiegiem gorącej wody w celu zabicia żywotnego pyłku. Krzyżówki są wykonywane zgodnie z dobrze kontrolowanym reżimem wzrostu i zazwyczaj skutkują odzyskaniem od 1 do 7 nasion zapylonych krzyżowo na wiechę.

Streszczenie

Setaria viridis to wyłaniający się system modelowy dla traw C₄. Jest ściśle spokrewniony z bioenergetycznym materiałem paszowym proso rózgowatym i prosem zbożowym, wyczyniec polowy. Ostatnio genom o długości 510 Mb prosa wyczynowego, S. italica, został zsekwencjonowany ^1,2, a sekwencja genomu o 25-krotnym pokryciu chwastów jest w toku. S. viridis ma szereg cech, które sprawiają, że jest to potencjalnie doskonały modelowy system genetyczny, w tym szybki czas generacji, niski wzrost, proste wymagania dotyczące wzrostu, płodna produkcja nasion ³ oraz rozwinięte systemy zarówno przejściowej, jak i stabilnej ^{transformacji4}. Jednak genetyka S. viridis jest w dużej mierze niezbadana, częściowo z powodu braku szczegółowych metod wykonywania krzyżówek. Do tej pory nie przyjęto żadnego standardowego protokołu, który pozwoliłby na szybką produkcję nasion z kontrolowanych krzyżówek.

Przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowany do przeprowadzania krzyżówek genetycznych u S. viridis, akces A10.1. Zastosowaliśmy prostą obróbkę cieplną ciepłą wodą w celu wykastrowania po przycięciu wiechy, aby zachować 20-30 różyczek i etykietowaniu kwiatów, aby wyeliminować nasiona powstałe z nowo rozwiniętych kwiatów po wykastrowaniu. Po przetestowaniu serii obróbki cieplnej w dopuszczalnych temperaturach i zróżnicowaniu czasu zanurzania, ustaliliśmy optymalny zakres temperatur i czasu 48 °C przez 3-6 minut. Dzięki tej metodzie jeden pracownik może wykonać co najmniej 15 krzyżówek dziennie i odzyskać średnio 3-5 potomstwa krzyżówek na wiechę. W związku z tym jedna osoba może wyprodukować średnio 45-75 potomstwa krzyżowego w ciągu jednego dnia. Szerokie zastosowanie tej techniki ułatwi rozwój rekombinowanych populacji linii wsobnych S. viridis X, S. viridis lub S. viridis X S. italica, mapowanie mutacji poprzez masową analizę segregantów i tworzenie mutantów wyższego rzędu do analizy genetycznej.

Wprowadzenie

S. viridis to trawa NADP-ME podtyp_{C 4} ściśle spokrewniona z proso bioenergetyczne (podtyp NAD-ME), proso wyczyniec polowy i trawa gwinejka rolnicza ⁵. Genom o długości 510 Mb hodowlanej formy Setaria, S. italica, został niedawno zsekwencjonowany ^1,2, a sekwencja genomu o 25-krotnym pokryciu chwastów, S. viridis, jest w toku (nieopublikowana). S. viridis ma wiele cech, które sprawiają, że jest to potencjalnie doskonały modelowy system genetyczny, w tym szybki czas generacji, niski wzrost, proste wymagania dotyczące wzrostu i płodna produkcja nasion ³. Co ważne, w ostatnim czasie opracowano metody zarówno przejściowej, jak i stabilnej transformacji S. viridis, które dają możliwość tworzenia roślin transgenicznych ⁴. Jednak głównym wąskim gardłem w rozwoju narzędzi genetycznych dla S. viridis jest jego oporność na krzyżowanie. Do tej pory nie opublikowano żadnego standardowego protokołu, który pozwoliłby na szybką produkcję nasion z kontrolowanych krzyżówek.

Krzyżówki genetyczne u S. italica są zazwyczaj wykonywane przez kastrację poprzez usunięcie pylników z kwiatów ^6,7,8 lub poprzez obróbkę cieplną kwiatów żeńskich rodziców ^9-11. Po tych zabiegach pylniki lub wiechy z nietraktowanych kwiatów/męskich rodziców są delikatnie ścierane w celu uzyskania znamion uwalniających pyłek. W przypadku kastracji pylniki usuwa się za pomocą drobnych kleszczy natychmiast po otwarciu różyczki, a pylnik zaczyna się rozwijać, ale jeszcze nie zrzucił pyłku ^6-8. Jednym z wyzwań związanych z tą ostatnią metodą jest trudność w wykonaniu kastracji w wąskim odstępie czasu między otwarciem a zrzuceniem pyłku kwiatu. Czas otwierania i zamykania pojedynczego kwiatu będzie się różnić w zależności od akcesji i warunków środowiskowych i może wynosić od 7 min ⁶ do 2,5 godz. ¹² w S. italica. Ponieważ zrzucanie pyłku następuje w miarę wyrastania pylników z różyczki, pylniki należy usuwać ostrożnie i szybko, a zatem trudno jest uniknąć zanieczyszczenia z powodu samozapylenia. Ponadto, ponieważ zapylanie odbywa się natychmiast po kastracji, liczba krzyżówek, które można wykonać na osobę/dziennie, jest ograniczona.

Jako alternatywna metoda, dojrzałe wiechy mogą być zanurzone w ciepłej wodzie, aby zabić ciepło rozwijające się ziarna pyłku ^9,10,13,14 z korzyścią wykonywania krzyżówek na dużej liczbie wiech. Jednak temperatura i czas trwania obróbki cieplnej różnią się znacznie w zależności od różnych doświadczeń (np. 47 °C przez 10 min ¹⁴ i 42 °C przez 20 min ¹⁰). Ponadto nie opublikowano systematycznych analiz dotyczących skuteczności kastracji za pośrednictwem ciepła. W związku z tym standardowa i prosta metoda przeprowadzania krzyżówek genetycznych u S. viridis znacznie przyspieszyłaby rozwój zasobów genetycznych i ustanowienie S. viridis jako systemu modelowego w społeczności naukowej.

Informujemy o rozwoju i optymalizacji standardowego protokołu do przeprowadzania krzyżówek genetycznych u S. viridis. Rośliny są uprawiane w kontrolowanym środowisku, aby zsynchronizować rozwój kwiatów i zwiększyć powtarzalność zabiegu. Krzyżówki są wykonywane przy użyciu transgenicznej linii S. viridis jako męskiego rodzica zawierającego gen reporterowy ^{GUS 4}, aby ułatwić identyfikację udanych kontrolowanych krzyżówek genetycznych. Transgen GUS jest napędzany przez promotor ubikwityny w ryżu, który umożliwia punktację nasion F1 natychmiast po zbiorach, a tym samym zapewnia łatwy test jakościowy w celu określenia skuteczności kastracji i zapylania. Zastosowaliśmy prostą obróbkę cieplną ciepłą wodą w celu wykastrowania, której towarzyszy etykietowanie kwiatów, które zostały wykastrowane w celu wyeliminowania nasion powstałych z nowo powstałych kwiatów po wykastrowaniu. Po przetestowaniu serii obróbki cieplnej w dopuszczalnych temperaturach i zmianie czasu zanurzania w ciepłej wodzie, ustaliliśmy optymalną temperaturę i czas trwania 48 °C od 3 do 6 minut. Stwierdzono, że leczenie zimnem przed świtem sprzyja synchronicznej antezie u obojga rodziców, aby ułatwić zapylenie krzyżowe. Omówiliśmy również kluczowe kroki w protokole i przyszłe zastosowanie tej metody do innych akcesji Setarii.

Protokół

1. Wzrost S. viridis

1. Ustaw warunki w komorze wzrostowej na 31 °C/22 °C (dzień/noc), 12 godzin światła/12 godzin ciemności, 50% wilgotności względnej z obróbką przed świtem 15 °C od 8:30 do 9:00. (Rysunek 1). W tych warunkach S. viridis A10.1 potrzebuje około 21-22 dni od wysiewu nasion do wykwitania.
2. Wypełnij mieszkania (4 x 9 komórek) Metro Mix 360 i wyjmij jedną komórkę do podlewania.
3. Lekko spryskaj wodą powierzchnię gleby.
4. Wysiewaj nasiona na powierzchni gleby, po jednym nasionie na komórkę.
5. Przykryj nasiona warstwą ziemi (około 0,5 cm)
6. Zamgładź powierzchnię gleby i wody od dołu. Podlewaj od dołu po wysianiu nasion.
7. Dla każdej krzyżówki, która zostanie wykonana, co najmniej trzy rośliny zostaną użyte jako rodzice płci żeńskiej, a dziewięć roślin zostanie użytych jako rodzice płci męskiej. Wysiew nasion należy rozłożyć w czasie, ponieważ nie wszystkie rośliny zakwitną tego samego dnia. Zaleca się wysiew nasion codziennie przez trzy dni.
8. Podlewaj rośliny 1-2 razy dziennie, co zależy od wielkości roślin i stanu gleby. Nadmiar wody w glebie nie sprzyja optymalnemu wzrostowi roślin i może prowadzić do rozwoju grzybów w glebie i uszkodzenia tkanki liści.
9. Rośliny nawozić dwa razy w tygodniu, używając Jack's 15-16-17 w stężeniu 100 ppm.

2. Przycinanie i opisywanie wiechy przed kastracją - Dzień 1

1. Po południu lub wieczorem przed zapyleniem przenieś rośliny z komory wzrostowej do laboratorium (temperatura (T): 24,06 °C± 0,13 °C, wilgotność względna (RH) 21,79% ± 1,15%).
2. Wybierz główne wiechy, które mają od 1 kwiatu do 1/3 kwiatów na wiechy, które już zakwitły.
3. W tym badaniu cztery domeny w wiechy są zdefiniowane w następujący sposób (ryc. 2A; wierzchołek, dystalny środek, bliższy środek i podstawa).
4. Najlepiej wybrać wiechę z 1-5 kwitnącymi kwiatami, odciąć czubek wiechy (dystalny koniec) i usunąć wszystkie kwiaty w bliższej części środkowej i podstawowej za pomocą wiosennych nożyczek lub cienkich kleszczy.
5. Jeśli wiecha ma około 1/10 do 1/5 kwitnących kwiatów, odetnij końcówkę i przytnij kwiaty od podstawy wiechy, zachowaj tylko dolną część dystalnej środkowej części i górną część bliższego środka do dalszego przycinania.
6. Jeśli wiecha ma około 1/4 do 1/2 kwitnących kwiatów, odetnij dystalną środkową część i zachowaj tylko bliższą środkową część do dalszego przycinania.
7. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby lekko przyciąć włosie.
8. Usuń wszystkie kwiaty, które zakwitły i wszystkie niedojrzałe kwiaty, pozostawiając około 20-30 kwiatów/wiechy, które są równomiernie rozmieszczone w regionie (ryc. 3). Zachowaj ostrożność, aby zachować włosie w regionie, który będzie zapylany, aby chronić różyczki przed możliwymi uszkodzeniami cieplnymi. Dla każdego kłoska zachowaj górną, najbardziej dojrzałą różyczkę. Najwyżej położona różyczka będzie miała większe prawdopodobieństwo wystąpienia anozy w momencie zapylenia (ryc. 2B).
9. Zaznacz jedną stronę każdego kwiatu czerwonym markerem permanentnym i zapisz liczbę różyczek na wiechy (ryc. 2B).
10. Oznacz wiechę następującymi informacjami: datą kastracji, czasem trwania i temperaturą, w której przeprowadza się kastrację.
11. Po przycięciu wiechy usuń wszystkie krzewy z każdej rośliny, aby zapewnić realokację większej ilości zasobów na rozwój głównej wiechy.

3. Kastracja z zanurzeniem w ciepłej wodzie - Dzień 1

1. Ustawić łaźnię wodną na 48 °C ± 0,1 °C do obróbki cieplnej.
2. Delikatnie zegnij przycięte wiechy i zanurz je w ciepłej wodzie o temperaturze 48 °C na 3-6 minut. Zachowaj ostrożność, aby nie złamać łodygi wiechy.
3. Jednorazowo można zanurzyć w sobie około 3-4 wiech, zachowując wystarczającą przestrzeń między wiechami dla równomiernego rozprowadzenia ciepła. Podczas obróbki cieplnej konieczne jest zanurzenie całej wiechy w ciepłej wodzie. Liść flagowy (liść podchodzący do wiechy, który dostarcza składniki odżywcze do wiechy) nie powinien mieć kontaktu z ciepłą wodą, aby zapobiec uszkodzeniom cieplnym tkanki liścia.
4. Gdy kastracja zostanie wykonana przez żądany czas, usuń wiechy z łaźni wodnej i delikatnie strząśnij wodę z wiechy.
5. Umieść spersonalizowaną torbę na chleb z mikroperforacją, aby całkowicie zakryć wykastrowaną wiechę i zabezpiecz ją opaską zaciskową. Torebki na chleb z mikroperforacją można dostosować do wielkości wiechy (dołącz do wideo).
6. Umieść rośliny z powrotem w komorze wzrostowej do następnego dnia.

4. Krzyżowanie/zapylanie po kastracji - Dzień 2 i Dzień 3

1. O godzinie 9:00 w dniu 2 i 3 przenieś rodziców płci żeńskiej (wykastrowanej) i męskiej z komory wzrostowej do laboratorium (T: 24,06 °C ± 0,13 °C, wilgotność względna: 21,79% ± 1,15%) w celu wykonania krzyżówek.
2. Obserwuj i dodaj kolejną czerwoną kropkę do kwiatów, które zakwitły lub kwitną, za pomocą czerwonego markera permanentnego. Zapisz całkowitą liczbę kwitnących kwiatów na wiechę.
3. Zapisz datę zapylenia i imię męskiego rodzica na etykiecie, aby śledzić, jakie krzyżówki są wykonywane.
4. Obserwuj szczytowy czas antynezy u rodziców płci męskiej. W warunkach panujących w naszej komorze (ryc. 1) kwiaty na wiechach samca rodzica zaczynają się synchronicznie otwierać około godziny 10:10. Od momentu otwarcia kwiatów całkowite wyciśnięcie pylników i uwolnienie pyłku nastąpi po 20 minutach.
5. Idealnym etapem zapylania jest etap, w którym uwalniany jest pyłek męskiego rodzica. Kwiaty zamykają się po 20 minutach od uwolnienia pyłku. Stąd czas trwania antezy wynosi około 40 minut od momentu otwarcia kwiatów. Kolor pyłku zmienia się z żółtawo-białego na brązowy w ciągu około 30 minut po zamknięciu kwiatu.
6. Rozpocznij zapylanie natychmiast po wyświetleniu żółtawo-białych pylników na kwiatach męskiego rodzica. Zapylanie przeprowadza się w dniu 2 i dniu 3 przy użyciu jednej z trzech technik:
   1. Zapylanie wiechy do wiechy: używając jednej oderwanej wiechy jako samca, delikatnie pocieraj wiechę razem z wykastrowaną wiechą, aby ułatwić zapylanie i wyrzuć wiechę męską, aby uniknąć zanieczyszczenia. Powtarzaj proces zapylania, aż każda wykastrowana wiecha zostanie zapylona przez 2-3 wiechy.
   2. Zapylanie od pylnika do stygmatu: za pomocą kleszczy wybierz kwiat, który kwitnie żółtawo-białymi pylnikami lub wybierz pylniki i fizycznie dotknij znamienia kwiatu na żeńskim rodzicu. Użyj jednego kwiatu od męskiego rodzica, aby zapylić jeden kwiat na wykastrowanej wiechy. Powtarzaj proces zapylania, aż każde znamię na wykastrowanej wiechy zostanie zapylone przez kilka (około 2-3) kwiatów/pylników. Noszenie przyłbicy powiększającej zapewni lepszą widoczność podczas zapylania.
   3. Pomiędzy zapyleniami różnych męskich rodziców, zanurz kleszcze w 95% etanolu, a następnie przetrzyj chusteczkami Kimwipes, aby uniknąć zanieczyszczenia z powodu przenoszenia pyłku między różnymi krzyżówkami.
   4. Wiązanie wiechy: Po wykastrowaniu wybierz 3-4 wiechy na męskim rodzicu, które zakwitną następnego dnia. Zwiąż je razem z wykastrowaną wiechą rodzica za pomocą opaski zaciskowej. Umieść wykastrowaną wiechę nieco poniżej wiechy męskiego rodzica. Umieść worek szklany na wiechach i zabezpiecz worek u podstawy spinaczem do papieru. Można to zakończyć w 2 dniu, gdy wiechy samca rodzica zaczną się budzić.
   5. W okresie kwitnienia, rano dnia 2 i dnia 3, strzepnąć lub potrząsnąć torebką szklaną, aby ułatwić zapylenie. Kontynuuj trzepanie lub potrząsanie wiechami co 15 minut przez cały czas trwania antezy rano (między 9:00 a 11:00). Usuń wiechy męskiego rodzica po zapyleniu i oznacz przeciwną stronę kwitnących kwiatów na wykastrowanej wiechy. Zapisz liczbę kwitnących kwiatów na wiechy każdej płci żeńskiej rodzica.
7. Po wykonaniu zapylenia umieść dostosowaną torbę na chleb z mikroperforacją, aby przykryć wiechę rodzica płci żeńskiej i zabezpieczyć u podstawy za pomocą opaski zaciskowej po zapyleniu do zbioru nasion.

5. Zbiór nasion

1. Nasiona zbierać po 2 tygodniach (14-16 dniach) od dnia zapylenia. Umieść przywieszkę w tej samej torbie z nasionami. Nasiona, które mają czerwone oznaczenia po obu stronach, reprezentują nasiona, które powstały w wyniku kontrolowanej krzyżówki genetycznej. Oczekuje się, że będzie to potomstwo krzyżowe.
2. Wyrzuć wszystkie nasiona bez czerwonych oznaczeń, ponieważ reprezentują one nasiona, które powstają z nowo rozwiniętych kwiatów po wykastrowaniu. Nasiona z czerwonymi znaczeniami tylko po jednej stronie będą prawdopodobnie reprezentować nasiona powstałe w wyniku samozapylenia, ponieważ nie kwitły w czasie, gdy przeprowadzano kontrolowane krzyżówki.
3. Suszyć nasiona w temperaturze 30 °C przez 2 dni w suszarce do nasion. Suszone nasiona należy przechowywać w laboratorium (T: 24,06 °C ± 0,13 °C, wilgotność względna: 21,79% ± 1,15%) lub w komorze nasiennej (T: 4,0 °C ± 1,0 °C, wilgotność względna: 20% ± 1%).

Wyniki

W tym badaniu użyliśmy zsekwencjonowanego akcesu S. viridis A10.1 jako żeńskiego rodzica oraz transgenicznej linii S. viridis (również A10.1) zawierającej gen reporterowy ^{GUS 4} jako męskiego rodzica dla wszystkich zapyleń. Do synchronizacji kwitnienia zastosowano zoptymalizowany reżim wzrostu, jak pokazano na rysunku 1. Przetestowaliśmy kilka kombinacji temperatury i czasu obróbki cieplnej pod kątem kastracji i zaobserwowaliśmy, że około 40-80% kwiatów zatrzymanych na wykastrowanej wiechy zakwitło^{2 dnia,} podczas gdy reszta zakwitła^{3 dnia (}ryc. 2). Jeśli jednak obróbka cieplna była zbyt surowa, na przykład 49 °C przez 4 minuty,^{2 dnia} kwitło bardzo niewiele kwiatów lub nie kwitło ich wcale. Zapylenie krzyżowe przeprowadzono w 2^lub 3 dobie po kastracji, która była zależna od szczytowego czasu wykwitu rodziców płci męskiej.

Zaobserwowano, że młode kwiaty nadal się rozwijały po wykastrowaniu, dojrzewały i samozapylały się 3-6 dni po kontrolowanym zapyleniu. Po 7-10 dniach od zapylenia na wiechy widoczne są kwiaty koloru białego. Te białe kwiaty są niezapłodnione z powodu uszkodzeń cieplnych lub słabego zapylenia. W tym samym czasie kwiaty, które zostały pomyślnie zapylone, zaczynają rodzić ciemne nasiona i zaczynają pękać po 14 dniach. Ciemne nasiona z czerwonymi znaczeniami zebrane 14^{dnia po} zapyleniu można było wyraźnie odróżnić od nasion bez czerwonych znaczeń, które były nadal zielone i nie pękały. Jeśli zbiór jest opóźniony, antechium nasion z czerwonymi znaczeniami i bez nich ciemnieje, co utrudnia szybkie odróżnienie nasion z czerwonymi znaczeniami w zebranych basenach.

Aby zoptymalizować protokół krzyżowania, przeprowadzono kilka eksperymentów z obróbką cieplną, jak podsumowano w Tabeli 1. Średnio 0-10 nasion/wiechę odzyskano z różnych eksperymentów z obróbką cieplną. Po zbiorach nasiona suszono w temperaturze 30 °C przez 2 dni w suszarni do nasion, a następnie usuwano antechium za pomocą środka do usuwania antechu. Po usunięciu anecium, przypuszczalne nasiona F1 zabarwiono roztworem barwiącym GUS, a potomstwo wymieszane zabarwiono na niebiesko w ciągu 1-2 godzin (ryc. 2F). Na podstawie tych wyników zalecamy obróbkę cieplną w temperaturze 48 °C przez 3-6 minut. Ponadto zalecamy, aby krzyżowanie było wykonywane zarówno w 2, jak i w 3 dniu po kastracji.

Aby zbadać skuteczność tej techniki w przeprowadzaniu krzyżówek z innymi akcesjami lub gatunkami Setaria, przeprowadzono krzyżówki między S. viridis A10.1 a ośmioma różnymi akcesjami S. viridis i jednym akcesją S. pumila. Chociaż dni do kwitnienia różniły się w zależności od akcesji, odkryliśmy, że kwiaty wszystkich ośmiu akcesji S. viridis i jednego akcesji S. pumila zaczynają się otwierać między 10:00-11:00, a szczyt otwarcia przypada na 10:20-11:00 po zabiegu zimna przed świtem. Wskazuje to, że leczenie zimnem przed świtem może być stosowane do różnych akcesji Setarii. Obróbka cieplna w temperaturze 48 °C przez 5-6 minut została użyta do wykastrowania S. viridis A10.1, który był używany jako żeński rodzic dla wszystkich wykonanych krzyżówek. Odzyskaliśmy od jednego do 12 nasion z krzyżówek między A10.1 i trzema różnymi akcesjami S. viridis oraz sześć nasion z pojedynczej krzyżówki między S. viridis A10.1 a pojedynczym akcesją S. pumila. Jednak w tej chwili nie ustaliliśmy, czy te nasiona powstały w wyniku udanego krzyżowania testowego, czy też były wynikiem samoskażenia. Niezależnie od tego, te wstępne wyniki sugerują, że warunki wzrostu zastosowane dla S. viridis A10.1 mogą być wykorzystane do generowania krzyżówek z różnymi akcesjami S. viridis i być może innymi gatunkami Setaria.

Obróbka cieplna w temperaturze (°C) Czas obróbki cieplnej (min) # krzyżyki Średnia # kwiatów po przycięciu Dzień zapylenia (dzień po wymazywaniu) Śr. # nasiona (czerwone)/ wiecha (średnia) Śr. % Gus (+)/ nasiona (czerwone) Śr. # nasiona hyb (Gus+) Min # nasiona hyb Max# nasiona hyb Rozdział 47 10 cyfra arabska 27 Rozdział 27 2 dzień 0 0 0 0 0 Rozdział 48 3 3 36 2 dzień 5 60 Rozdział 3 1 5   4 3 25 3 dzień 10 50 Rozdział 5 3 7   5 8 25 2 dzień 5 60 Rozdział 3 1 6   6 3 25 2 dzień 4 75 Rozdział 3 0 4   7 4 24 2 dzień 3 33 Rozdział 33 1 0 4   7 1 25 3 dzień 4 75 Rozdział 3 N/a N/a Rozdział 49 1 3 23 2 dzień 5 25 1 0 cyfra arabska   cyfra arabska 7 26 2 dzień 8 25 cyfra arabska 0 4   3 5 22 Rozdział 22 2 dzień 0 0 0 0 1   4 4 25 2 dzień 0 0 0 0 0

Tabela 1. Optymalizacja obróbki cieplnej w celu kastracji. Wyniki zmiany zarówno temperatury, jak i czasu obróbki cieplnej. Zapylanie przeprowadzono jednego (2 dzień) lub dwa dni (3 dzień) po wykastrowaniu i udanych krzyżowaniach z barwieniem GUS

Rysunek 1. Zoptymalizowane warunki w komorze wzrostowej z obróbką zimnem przed świtem. Pokazano temperaturę i okresy optymalnego wzrostu i synchronizacji produkcji kwiatów. Zielone i czerwone strzałki pokazują optymalne okno do wykonywania odpowiednio krzyży i kastracji.

Rysunek 2. Przygotowanie wiechy do krzyżowania i barwienia GUS potomstwa krzyżówkowego. (A) Wiecha Setaria viridis A10.1 przed przycinaniem, pokazująca około 1/10 otwartych kwiatów. Pokazano cztery odcinki i kierunkowość w progresji antezy wzdłuż wiechy. (B) Przycięta wiecha przed kastracją z zachowanym włosiem. (C) Wykastrowana wiecha po usunięciu szczeciny. (D) Wykastrowana wiecha w 2 dniu po kastracji, pokazująca kwitnące kwiaty (zdjęcie zrobione o 10:30). (E) Wiecha samca (transgeniczna linia Setaria viridis A10.1 niosąca gen reporterowy β-glukuronidazy (GUS)), która kwitnie po zabiegu przed świtem (zdjęcie zrobione o 10:30). Od A do E, podziałka = 1 mm. (F) Przypuszczalne potomstwo krzyżowe po barwieniu GUS przez 2 godziny, a następnie odcięciu w 70% (v/v) etanolu. Dwa nasiona od prawej to odpowiednio kontrole negatywne i pozytywne.

Rysunek 3. Schemat blokowy protokołu Schematyczne przedstawienie głównych kroków związanych z wykonywaniem krzyżówek z S. viridis.

Dyskusja

Znaczenie leczenia przed świtem

Aby uzyskać wysoką częstotliwość krzyżowania potomstwa, konieczne jest posiadanie wysoce synchronicznej antezy rodziców płci męskiej i żeńskiej. Początkowo zmienialiśmy reżimy temperatury i oświetlenia (31 °C/22 °C, dzień/noc) i używaliśmy akcesu S. viridis A10.1 do wszystkich zapyleń. W tych warunkach większość kwiatów otwiera się wcześnie rano, zanim temperatura wzrośnie do 31 °C, chociaż niektóre kwiaty otwierają się losowo między 8:00 a 20:00. Wcześniejsze badania nad S. italica wskazują, że pora dnia, miejsce i pora roku przyczyniają się do zmienności antezy ^7,15,16. Siles i wsp.⁶ zauważyło, że antyka była związana z szybkimi zmianami temperatury i wilgotności, ale nie z niską temperaturą i wysoką wilgotnością, per se, jak stwierdzono w poprzednich badaniach ^7,15. W związku z tym zastosowaliśmy leczenie zimnem przed świtem w temperaturze 15 °C przez 30 minut (od 8:30 do 9:00), aby naśladować naturalne warunki przed świtem. To leczenie zimnem przed świtem pomogło w synchronizacji antydezy u rodziców. Zaobserwowaliśmy, że pomimo ustawienia wilgotności względnej na poziomie 50%, wilgotność względna wewnątrz komory wzrosła do poziomu powyżej 70%, gdy temperatura spadła z 22 °C do 15 °C i utrzymywała się powyżej 70%, aż temperatura stopniowo wzrosła do 31 °C po godzinie 9:30. O godzinie 9:00 do laboratorium przynoszone są wykastrowane samice i rośliny męskiego rodzica (T: 24,06 °C ± 0,13 °C, wilgotność względna: 21,79% ± 1,15%). Kwiaty męskich rodziców zaczynają się otwierać około godziny 10:10, a zapylanie można przeprowadzić w godzinach 10:30-11:00. Szczegółowy wykaz wszystkich odczynników i sprzętu znajduje się w tabeli 2.

Znaczenie przygotowania wiechy do kastracji

W warunkach komorowych w tym badaniu (ryc. 1) czas trwania pierwotnego kwitnienia wiechy wynosił od 2 do 3 dni. Zazwyczaj kwiaty znajdujące się na dystalnym środku kwiatostanu (ryc. 2A) otwierają się jako pierwsze, a otwarcie poprzedza proksymalnie i dystalnie. Idealna liczba kwiatów, które należy zatrzymać na wiechy, to 20-30. Należy zachować ostrożność podczas usuwania niedojrzałych kwiatów, aby zachować tylko dobrze rozwinięte kwiaty (najwyższy kwiat lub największy na kłosie ¹⁷). Etykietowanie czerwonym markerem po obu stronach kwiatów pomaga skutecznie odróżnić domniemane potomstwo krzyżowe od nasion z nowo powstałych kwiatów po wykastrowaniu. Ponadto ważne jest, aby przed wykastrowaniem pozostawić włosie na wiechach, aby chronić różyczki przed rozległymi uszkodzeniami cieplnymi; jednak opcjonalnie można je usunąć po wykastrowaniu za pomocą nożyczek sprężynowych, aby ułatwić zapylanie, zwłaszcza gdy stosowana jest technika wiązania wiechy (ryc. 2C i 2D).

Zoptymalizowana temperatura i czas trwania zabiegu do uzdatniania ciepłej wody

Podstawą kastracji poprzez zanurzanie w ciepłej wodzie jest to, że pyłek jest bardziej wrażliwy na ciepło niż powierzchnia stygmatyczna. Jednak czas trwania i temperatura obróbki cieplnej mogą się różnić w zależności od gatunku Setaria i akcesji. Ogólnie rzecz biorąc, wyższa temperatura przy krótszym czasie leczenia lub niższa temperatura przy dłuższym czasie leczenia będzie miała taki sam wpływ na kastrację. Doniesiono, że obróbka cieplna w temperaturze 42 °C przez 20 min ¹⁰ lub 47 °C przez 10 min ¹⁴ spowodowała, że pyłek S. italica stał się niezdolny do życia, ale skuteczność tych zabiegów nie została określona. Opracowaliśmy nasz protokół, opierając się na hipotezie, że w zoptymalizowanej temperaturze i czasie trwania zabiegu pyłek wszystkich kwiatów zatrzymanych na rodzicu płci żeńskiej będzie nieżywotny, podczas gdy znamiona pozostaną podatne. Jednak po porównaniu i przeanalizowaniu wpływu kilku temperatur i okresów zapylania (tabela 1) stwierdziliśmy, że wrażliwość na obróbkę cieplną różni się wśród kwiatów zatrzymanych na każdej wiechy, dlatego trudno jest całkowicie wyeliminować nasiona powstałe w wyniku samozapylenia. Wnioskujemy, że efektywność produkcji potomstwa krzyżowego jest największa, gdy zabiegi wykonuje się w temperaturze 48 °C przez 3-6 minut w akcesji S. viridis A10.1.

Szczytowy czas antezy i zapylenia krzyżowego

Kiedy kwiaty osiągają dojrzałość i mają się otworzyć, pylniki są żółtawobiałe, a pyłek jest zrzucany, gdy tylko pylniki wydostaną się z kwiatów ⁸. Pylniki stopniowo brązowieją po zrzuceniu pyłku, gdy kwiaty zaczynają się zamykać. Po uwolnieniu żywotność pyłku jest nieznana. Dlatego tak ważne jest, aby jak najszybciej użyć pyłku z otwierających się lub świeżo otwartych kwiatów na męskim rodzicu. W naszych warunkach komorowych (ryc. 1) większość kwiatów męskich rodziców zaczyna się otwierać o godz. 10:10, a otwarte kwiaty wyrzucają pyłek o godz. 10:30. Tak więc pożądane okno do wykonania zapylenia to okres od 10:30 do 11:00. Znamiona pozostają na zewnątrz łusek po zamknięciu kwiatów i mogą być podatne na pyłek. Zostało to wcześniej zaobserwowane i potwierdzone u S. italica , że znamiona są otwarte przez około 48 godzin po otwarciu przez Siles i wsp.⁶, dlatego ważne jest, aby workować wiechy po obróbce cieplnej i po wykonaniu kontrolowanych krzyżówek. Jak wspomniano powyżej, zalecamy wykonywanie zapylania zarówno w dniu 2, jak i w dniu 3 po kastracji.

Metody zapylania

Porównaliśmy skuteczność trzech technik zapylania. Jeśli kwitnące kwiaty nie są ograniczające, zapylanie wiechy jest najbardziej efektywną techniką i daje większą liczbę potomstwa krzyżowego. Jeśli kwitnące wiechy są ograniczone, wyższa częstotliwość krzyżowania potomstwa będzie wytwarzana, gdy stosowana jest metoda pylnika do znamienia. Udało nam się uzyskać potomstwo krzyżowe z obu metod. Metoda "wiązania wiech" została użyta przy krzyżowaniu S. italica ⁶ , ale stwierdziliśmy, że ta metoda jest najmniej wydajna, ponieważ okno czasowe na wydalanie pyłku przez męskiego rodzica jest krótkie. Co więcej, kontrola nad zapylaniem jest mniejsza, a włosie wiech S. viridis może również utrudniać przemieszczanie się pyłku na powierzchnię stygmatyczną.

Zbiór, suszenie i przechowywanie nasion

Po zbiorach nasiona należy suszyć w temperaturze 30-33 °C przez 2 dni. W razie potrzeby anecium należy usunąć w celu barwienia GUS. Nasiona powinny być przechowywane w suchym, chłodnym miejscu (T: 24,06 °C ± 0,13 °C, wilgotność względna: 21,79% ± 1,15%) do krótkotrwałego przechowywania (mniej niż dwa lata) lub w komorze nasiennej (T: 4,0-10 °C ± 1,0 °C, wilgotność względna: 20% ± 1%) do długotrwałego przechowywania. Złe warunki przechowywania mogą skutkować niskimi wskaźnikami żywotności ⁸. Zaobserwowaliśmy, że zdolność kiełkowania S. viridis A10.1 wynosi około 5% po wysiewie 4 dni po zbiorach, ale może zostać zwiększona do 90-96% po przechowywaniu w laboratorium (T: 24,06 °C ± 0,13 °C, wilgotność względna: 21,79% ± 1,15%) przez 110 dni po zbiorach, a następnie trzydniowa stratyfikacja w temperaturze -80 °C w celu przerwania spoczynku nasion. W celu rozwarstwienia w temperaturze -80 °C suche nasiona można umieścić w hermetycznym pojemniku (np. probówce do mikrowirówki lub kopercie na monety w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie) i przechowywać w temperaturze -80 °C przez 3 dni przed sadzeniem. Po 16 miesiącach przechowywania w laboratorium (T: 24,06 °C ± 0,13 °C, wilgotność względna: 21,79% ± 1,15%) nadal można uzyskać procent kiełkowania 90-95%. Ponadto, aby przerwać spoczynek, nasiona można suszyć w temperaturze 30-33 °C przez 2 dni po zbiorach, a następnie poddać trzydniowej stratyfikacji w temperaturze -80 °C, a następnie usunąć antechium przed sadzeniem. Po tych zabiegach można osiągnąć zdolność kiełkowania nasion do 33%.

Zalety, ograniczenia i możliwe modyfikacje

Tutaj przedstawiamy pierwszy standardowy protokół wykonywania krzyżówek w S. viridis A10.1 przy użyciu obróbki cieplnej w celu kastracji. W przeciwieństwie do kastracji fizycznej, protokół ten jest mniej inwazyjny i stosunkowo łatwy do ustalenia w laboratorium. Zwykle przycinanie jednej wiechy zajmuje około 15 minut, a około 15 wiech można przyciąć i skrzyżować na osobę/dzień. Zakładając, że w zoptymalizowanych warunkach można odzyskać średnio 3-5 potomstwa/wiechy krzyżowej, jedna osoba może wyprodukować łącznie 45-75 potomstwa krzyżówkowego w ciągu jednego dnia. Co więcej, technika ta może być stosowana do krzyżówek z innymi gatunkami Setaria , choć prawdopodobne będą dodatkowe optymalizacje. Jeśli przestrzeń komory wzrostu jest ograniczona, rośliny można uprawiać w szklarniach lub komorach wzrostowych bez zabiegu przed świtem, aż do pojawienia się wiechy, zanim zostaną przeniesione do zoptymalizowanych warunków komory.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nożyczki, sprężyna	World Precision Instruments, Inc	14126
Kleszcze, Dumostar Biology Polerowane	SPI Materiały	TD5BP-XD
	FST (Fine Science Tools)	14005-12
Europack Przezroczyste polipropylenowe mikroperforowane chrupiące torby na chleb 6 "x28"	http://www.pjpmarketplace.com	361001
Flats	T.O. Plastics	715401C
metro mix 360	Hommert International	10-0356-1
Jack's 15-16-17	Hommert International	07-5925-1
Kimwipes	VWR International	34120
Markery permanentne Sharpie Ultra Fine Point, czerwone	zszywki	37002
Lupa pałąkowa Donegan DA-10 OptiVisor, powiększenie 3,5x, ogniskowa 4"	Amazon	DA-10, B0015IP380
12 "24/7 Opakowanie Ręczna zgrzewarka impulsowa Zgrzewarka Poly Sealing Free Element Grip	Amazon	N/A
wodna	naukowy VWR	: 1166
Komora do uprawy roślin	Conviron	BDW 40