Test obrazowania na żywo do oceny roliCa2+ i sfingomielinazy w naprawie ran toksyn tworzących pory

Podsumowanie

Obrazowanie na żywo komórek narażonych na działanie barwnika lipofilowego FM1-43 pozwala na precyzyjne określenie kinetyki, za pomocą której toksyny tworzące pory są usuwane z błony plazmatycznej. Jest to czuły test, który można wykorzystać do oceny wymagań dotyczących Ca²⁺, sfingomielinazy i innych czynników dotyczących naprawy błony komórkowej.

Streszczenie

Uszkodzenie błony plazmatycznej jest częstym zjawiskiem, a rany muszą być szybko naprawiane, aby zapewnić przetrwanie komórki. Napływ Ca²⁺ jest kluczowym zdarzeniem sygnalizacyjnym, które uruchamia naprawę ran mechanicznych na błonie plazmatycznej w ciągu ~30 sekund. Ostatnie badania wykazały, że komórki ssaków również ponownie uszczelniają swoją błonę plazmatyczną po przesiąknięciu toksynami tworzącymi pory w procesie zależnym od Ca^{2 +}, który obejmuje egzocytozę enzymu lizosomalnego sfingomielinazy kwasowej, po której następuje endocytoza porów. W tym miejscu opisujemy metodologię zastosowaną do wykazania, że ponowne uszczelnienie komórek przepuszczalnych przez toksynę streptolizynę O jest również szybkie i zależne od napływu Ca²⁺. Konstrukcja testu umożliwia synchronizację zdarzenia urazu i precyzyjny pomiar kinetyczny zdolności komórek do przywrócenia integralności błony plazmatycznej poprzez obrazowanie i ilościowe określenie zakresu, w jakim lifofilowy barwnik FM1-43 dociera do błon wewnątrzkomórkowych. Ten żywy test pozwala również na czułą ocenę zdolności egzogennie dodanych czynników rozpuszczalnych, takich jak sfingomielinaza, do hamowania napływu FM1-43, odzwierciedlając zdolność komórek do naprawy błony komórkowej. Ten test pozwolił nam po raz pierwszy wykazać, że sfingomielinaza działa poniżej egzocytozy zależnej od Ca^{2 +}, ponieważ zewnątrzkomórkowe dodanie enzymu sprzyja ponownemu uszczelnianiu komórek przepuszczalnych pod nieobecność Ca²⁺.

Wprowadzenie

Od kilkudziesięciu lat wiadomo, że naprawa błony plazmatycznej po urazie mechanicznym jest procesem zależnym od Ca^{2+ 1,2}. Późniejsze badania wykazały, że napływ Ca²⁺ przez ranę uruchamia energiczny proces egzocytozy pęcherzyków wewnątrzkomórkowych w miejscu urazu, który jest wymagany do ponownego uszczelnienia^3,4. Szybkość utraty barwnika fluorescencyjnego załadowanego do cytoplazmy komórek wykorzystano do oceny szybkości naprawy i stwierdzono, że ponowne uszczelnienie zostało zakończone w ciągu <30 sekundy po urazie⁵. Początkowo zaproponowano dwa modele, aby wyjaśnić wymóg egzocytozy w naprawie błony komórkowej: 1) model "łaty", który sugerował, że napływ Ca²⁺ przez zmianę wyzwala początkowo homotypową fuzję pęcherzyków wewnątrzkomórkowych, tworząc dużą "plamę", która następnie zostałaby nałożona na błonę plazmatyczną w celu ponownego uszczelnienia rany⁶ oraz 2) model redukcji napięcia, w którym zaproponowano, że błona dodana przez egzocytozę zależną od Ca²⁺ w pobliżu rany zmniejszy napięcie błony plazmatycznej, ułatwiając ponowne uszczelnienie dwuwarstwy⁷. Rola egzocytozy wyzwalanej przez^Ca2+ w naprawie błony plazmatycznej została dodatkowo wzmocniona przez badania wykazujące, że lizosomy zawierają cząsteczkę czujnika Ca²⁺, synaptotagminę VII, która ułatwia ich egzocytozę i naprawę błony plazmatycznej w uszkodzonych komórkach^8,9,10,11.

Jednak dodatkowe dowody wskazują, że sama egzocytoza nie była wystarczająca do wspomagania naprawy błony komórkowej. Oprócz mechanicznych rozdarć błony komórkowej, częstą formą uszkodzenia komórek jest przenikanie przez toksyny tworzące pory wytwarzane przez bakterie^12,13 lub komórki odpornościowe^14,15. W przeciwieństwie do rozdarć mechanicznych, białka tworzące pory wprowadzają się do błony plazmatycznej, tworząc stabilny, wyłożony białkiem por, którego nie można ponownie uszczelnić po prostu przez nałożenie "łaty" błony lub zmniejszenie napięcia błony. Co ciekawe, badania wykazały, że komórki ssaków mają skuteczny mechanizm naprawy błony plazmatycznej po przepuszczalności z białkami tworzącymi pory, a proces ten wymaga również obecności zewnątrzkomórkowego Ca^{2 + 12}. Odkrycie to zrodziło pytanie, czy transbłonowe usuwanie porów z powierzchni komórki było również szybkim procesem, jak zaobserwowano w przypadku ran mechanicznych⁵. Co zaskakujące, nasze ostatnie badania wykazały, że ponowne uszczelnianie komórek przesiąkniętych toksynami tworzącymi pory ma bardzo podobne właściwości do naprawy ran mechanicznych: proces ten wymaga zewnątrzkomórkowego Ca²⁺ i jest zakończony w ciągu ~30 sekund. Badając ten proces bardziej szczegółowo, dowiedzieliśmy się niedawno, że oprócz regulowanej przez Ca²⁺ egzocytozy lizosomów, naprawa błony plazmatycznej obejmuje szybką formę endocytozy, która jest wywoływana przez uwalnianie lizosomalnej enzymu kwasu sfingomielinazy (ASM) i jest niezbędna nie tylko do usuwania porów transbłonowych, ale także do naprawy ran mechanicznych¹⁶.

Aby określić kinetykę ponownego uszczelniania komórek po przesiąknięciu białkami tworzącymi pory, w naszym laboratorium dostosowaliśmy metodologię obrazowania na żywo, która była wcześniej używana do oceny ponownego uszczelnienia uszkodzonych laserowo izolowanych włókien mięśniowych¹⁷. Test ten opiera się na właściwościach lipofilowego barwnika FM1-43, który stabilnie interkaluje się w zewnętrzny płatek dwuwarstw lipidowych o zwiększonej intensywności fluorescencji. Kiedy dwuwarstwa błony plazmatycznej zostaje przerwana, barwnik zewnątrzkomórkowy uzyskuje dostęp do błon wewnątrzkomórkowych, zapewniając czuły test do wykrywania uszkodzenia błony plazmatycznej i naprawy^18,16,19,20. Aby dostosować ten test do oceny ponownego uszczelniania komórek po przepuszczalności z białkami tworzącymi pory, wstępnie inkubowaliśmy komórki w temperaturze 4 °C z toksyną bakteryjną streptolizyną O (SLO), która wiąże się z cholesterolem błonowym²¹. Synchroniczną przepuszczalność komórek można następnie łatwo osiągnąć, przenosząc komórki z lodu do ciepłego podłoża w podgrzewanym mikroskopie, co aktywuje oligomeryzację i zmianę konformacji, która prowadzi do tworzenia się porów transbłonowych. Przewagą tego podejścia, w porównaniu z wcześniej publikowanymi testami wykorzystującymi ranienie laserowe, jest to, że większa liczba komórek może być analizowana jednocześnie w mikroskopijnym polu, co zapewnia lepsze pobieranie próbek populacji komórek. Biorąc pod uwagę mechanistyczne podobieństwa między procesem ponownego uszczelniania komórek obserwowanym po urazie mechanicznym a przenikaniem toksyn tworzących pory, opisywany przez nas test zapewnia bardzo wszechstronną i potężną metodę analizy czynników zaangażowanych w podstawowy proces naprawy błony komórkowej. Jako przykład pokazujemy, że możliwe jest użycie tego testu do identyfikacji zależnych i niezależnych etapów procesu naprawy^Ca2+.

Protokół

1. Wyciszenie transkrypcji ASM

1. Wysiewać 1,5 x 10⁵ komórek HeLa w 2 ml pożywki wzrostowej DMEM (DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 1% Penn-Strep) na 35-milimetrowych szklanych szalkach z dnem (MatTek) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
2. Następnego dnia odessać pożywkę wzrostową i zastąpić ją 2 ml pożywki DMEM o zmniejszonej surowicy (DMEM z 4% FBS), co najmniej 1 godzinę przed dodaniem mieszaniny transfekcji siRNA.
3. Przygotuj 4 probówki do mieszaniny oligo transfekcji siRNA. Do probówek A i C dodać 250 μl zredukowanej surowicy Optimem i 4 μl Lipofectamine RNAiMax na szalkę o średnicy 35 mm, która ma być poddana transfekcji. Do probówki B dodać 250 μl surowicy zredukowanej Optimem i 8 μl (160 pmol) pożywki kontrolnej o zawartości GC oligo (Control siRNA), na 35-milimetrową szalkę, która ma być transfekowana. Do probówki D dodać 250 μl surowicy zredukowanej Optimem i 8 μl (160 pmol) oligo SMPD1 (siASM) na szalkę o średnicy 35 mm, która ma być poddana transfekcji. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
4. Połącz probówki A i B, aby utworzyć kompleks transfekcyjny dla siRNA kontrolnego oraz probówki C i D dla siRNA ASM. Inkubować reakcje w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
5. Powoli, kroplami, dodawać mieszaniny reakcyjne transfekcji siRNA i ASM do odpowiednich naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO₂ . Po 24 godzinach od transfekcji delikatnie odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką wzrostową DMEM. W celu skutecznego knockdown ASM, szalki powinny być dalej inkubowane w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez około 31 godzin (łącznie 55 godzin) przed obrazowaniem na żywo.

2. Przygotowanie odczynników do mikroskopii na żywo

1. Przygotować roztwór rekombinowanej toksyny porotwórczej Streptolizyny O (SLO) o stężeniu 100 ng / μl w zimnym 1x PBS bez Ca²⁺ i Mg²⁺. SLO stosowany w tych testach jest konstytutywnie aktywnym mutantem cysteiny, który nie wymaga środków redukujących do działania, dzięki uprzejmości dostarczonej przez dr Roda Twten z University of Oklahoma. Toksyna została wyrażona w E. coli BL21 DE3 i oczyszczona w warunkach natywnych, jak opisano wcześniej¹⁶.
2. Przygotuj roztwór podstawowy FM1-43: Ponownie zawiesić liofilizowany proszek FM1-43 w DMSO, aby uzyskać roztwór o stężeniu 25 mM.
3. Przygotuj roztwór A: Rozcieńczyć roztwór podstawowy FM1-43 w zimnym DMEM z Ca²⁺ do końcowego stężenia 4 μM (potrzebne jest 1,5 ml na szalkę MatTek) i przechowywać na lodzie do momentu, gdy będzie potrzebny.
4. Przygotuj roztwór B: Rozcieńczyć roztwór podstawowy FM1-43 w zimnym DMEM bez Ca²⁺ i 10 mM EGTA (Ca²⁺-free DMEM) do końcowego stężenia 4 μM (1,5 ml potrzebne na szalkę MatTek) i przechowywać na lodzie do momentu, gdy będzie potrzebny.
5. Wstępnie podgrzać (37 °C) 1 ml porcji roztworu A i roztworu B w probówkach Eppendorfa.
6. Przechowywać na lodowych roztworach DMEM z Ca²⁺ i DMEM bez Ca²⁺.

3. Obrazowanie żywych komórek napływu FM1-43 do komórek leczonych i nieleczonych SLO

1. Napełnij średniej wielkości płytki metalowy pojemnik pokruszonym lodem, odwróć go do dużego szklanego pojemnika z lodem i dodaj dodatkowy lód, pozostawiając odsłoniętą tylko dolną powierzchnię metalowego pojemnika. Połóż mokry ręcznik papierowy na odsłoniętym metalowym dnie, aby umożliwić równomierny transfer ciepła.
2. Weź jedno naczynie MatTek nasączone kontrolnym siRNA (próbka 1) i umieść je na zimnym, mokrym ręczniku papierowym. Delikatnie odessać wszystkie media i przemyć 3x zimnym DMEM wolnym od Ca²⁺. Po ostatnim umyciu odessaj wszystkie media z naczynia.
3. Aby zobrazować FM1-43 związany z komórkami w komórkach bez zranień SLO (próbka 1) w obecności Ca²⁺, dodaj 180 μl zimnego roztworu B do środkowego szklanego szkiełka nakrywkowego naczynia o szklanym dnie o średnicy 35 mm i inkubuj przez 5 minut na lodzie (Tabela 1).
4. Umieść naczynie MatTek na stoliku mikroskopu konfokalnego podgrzanego do 37 °C i wyposażonego w komorę środowiskową (która utrzymuje temperaturę, wilgotność i poziom_CO2). Znajdź pole komórek, które zostaną zobrazowane patrząc przez obiektyw 40X NA 1.3 (Nikon). Jeśli to możliwe, włącz PerfectFocus lub podobne urządzenie, aby skorygować dryft termiczny.
5. Delikatnie dodać 1 ml podgrzanego roztworu A na bok naczynia o średnicy 35 mm i założyć pokrywę komory środowiskowej (Tabela 1).
6. Rejestruj obrazy przez 4 minuty w 1 klatce co 3 sekundy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do obrazowania (Volocity w systemie mikroskopii konfokalnej UltraView Vox Perkin Elmer z wirującym dyskiem). Wzbudzenie FM1-43 odbywa się za pomocą linii laserowej 488 nm przy użyciu filtra dichroicznego z pasmem 488 nm, a dyskryminacja emisji odbywa się za pomocą filtra emisyjnego 527(W55). Poziomy mocy lasera i czułość kamery są ustawione tak, aby osiągnąć ekspozycję obrazu 100 ms.
7. Powtórz kroki od 3.2 do 3.6, aby wykryć FM1-43 w komórkach kontrolnych traktowanych siRNA bez zranienia SLO (próbka 2) pod nieobecność Ca²⁺, z wyjątkiem tego, że w kroku 3.5 należy dodać roztwór B (Tabela 1).
8. Aby zmierzyć napływ FM1-43 do kontrolnych komórek traktowanych siRNA zranionych SLO w obecności (próbka 3) lub bez Ca²⁺ (próbka 4), dodaj 180 μl zimnego roztworu B zawierającego SLO do środkowego szklanego szkiełka nakrywkowego naczynia o średnicy 35 mm ze szklanym dnem i inkubuj przez 5 minut na lodzie, jak w kroku 3.3. Powtórz kroki od 3.2 do 3.6; dostosuj, dodając roztwór A lub roztwór B w kroku 3.5 (Tabela 1).
9. Aby określić rolę ASM w naprawie błony plazmatycznej, powtórz kroki 3.2-3.6 przy użyciu komórek traktowanych siRNA ASM we wszystkich warunkach (próbki 5-8) (Tabela 1).
10. Aby określić rolę zewnątrzkomórkowej rekombinowanej sfingomielinazy (SM) na kinetykę naprawy błony plazmatycznej (odzwierciedlonej przez hamowanie napływu FM1-43) (próbki 9-10), SM dodaje się (0-50 μU) do roztworu A lub roztworu B w kroku 3.5, a następnie dodaje do komórek podczas obrazowania żywych komórek w całkowitej objętości 1 ml (Tabela 1).

4. Kwantyfikacja napływu FM1-43 do komórek

1. Po pozyskaniu filmów zmierz intensywność fluorescencji wewnątrzkomórkowej FM1-43 za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (Volocity Suite, PerkinElmer). Narysuj obszar zainteresowania w obszarze cytozolowym każdej komórki w polu i zastosuj narzędzia programowe, aby określić średnią intensywność fluorescencji FM1-43 we wszystkich klatkach wideo.
2. Aby dostosować się do zmian w początkowym barwieniu FM1-43, dane dla każdego filmu są wyrażane jako krotny wzrost intensywności fluorescencji w czasie i wykreślane dla każdego innego warunku. Krotny wzrost fluorescencji każdego pojedynczego punktu czasowego na komórkę oblicza się jako F_T/F₀, gdzie F_T jest średnią fluorescencją w określonym punkcie czasowym, a F₀ jest średnią fluorescencją w t = 0 (rysunki 1-2).

Wyniki

Niskie stężenia bakteryjnej sfingomielinazy (SM) przywracają naprawę błony plazmatycznej w komórkach pozbawionych lizosomalnej kwasowej sfingomielinazy.

Wykorzystując test obrazowania z użyciem FM1-43, wykazaliśmy wcześniej, że defekt błony komórkowej w komórkach z niedoborem lizosomalnego enzymu ASM, poddanych uszkodzeniu SLO w obecności Ca²⁺, zostaje cofnięty poprzez pozakomórkowe dodanie rekombinowanego ludzkiego enzymu¹⁹. Ponieważ ludzka lizosomalna ASM ma niskie pH opty...

Dyskusja

Wcześniejsze badania nad urazami mechanicznymi i naprawą błony komórkowej opierały się na różnych mechanizmach uszkadzania komórek, począwszy od upuszczania szklanych kulek, mikropipetowania, ścinania, drapania lub skrobania. Odczyt wszystkich tych testów był raczej jakościowy niż ilościowy i nie dawał precyzyjnych informacji na temat kinetyki mechanizmu naprawczego. Zdolność komórek do ponownego uszczelnienia błony plazmatycznej po tych formach uszkodzenia mierzono obecnością lub brakiem znaczników dodanych do płynu z...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reagent
HeLa 229 linia komórkowa	ATCC	CCL2-1
DMEM Wysoka zawartość glukozy		11965
DMEM Wysoka zawartość glukozy bez wapnia	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Obniżona surowica	Invitrogen	31985
Lipofectamina RNAiMax	Invitrogen	13778
Pożywka kontrolna Zawartość GC Zawartość RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Płodowa surowica bydlęca Inaktywowane termicznie	Gemini-Bioproducts	100-106
Sfingomielinaza z Bacillus cereus	Sigma	S7651
Naczynia dolne ze szkła 35 mm	MatTek	P35G-0-14
Materiał
Mikroskop odwrócony	Nikon	Eclipse Ti
Aparat	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem	PerkinElmer	UltraViewVoX
Analiza oprogramowania oprogramowanie	PerkinElmer	Volocity Suite
Komora środowiskowa	Urządzenia patologiczne	Komora

systemu LiveCell