Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z miogennych komórek macierzystych są obiecującymi kandydatami na strategie terapii komórkowej w leczeniu dystrofii mięśniowych. Protokół ten opisuje przeszczep i pomiary funkcjonalne wymagane do oceny wszczepienia i różnicowania mezoangioblastów pochodzących z iPSC (rodzaj komórek progenitorowych mięśni) w mysich modelach ostrej i przewlekłej regeneracji mięśni.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przeszczep indukowanych pluripotencjalnych progenitorów miogennych podobnych do mezoangioblastów pochodzących z mezoangioblastów w mysich modelach regeneracji mięśni
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pochodzące od pacjentów iPSC mogą być nieocenionym źródłem komórek dla przyszłych protokołów autologicznej terapii komórkowej. Miogenne komórki macierzyste/progenitorowe pochodzące z iPSC, podobne do mezoangioblastów pochodzących z pericytów (mezoangioblasty podobne do komórek macierzystych/progenitorowych pochodzących z iPSC, IDEMs) mogą być tworzone z iPSC generowanych od pacjentów dotkniętych różnymi formami dystrofii mięśniowej. Specyficzne dla pacjenta IDEM mogą być korygowane genetycznie za pomocą różnych strategii (np. wektory lentiwirusowe, ludzkie sztuczne chromosomy) i zwiększane pod względem potencjału różnicowania miogennego w przypadku nadekspresji regulatora miogenezy MyoD. Ten potencjał miogenny jest następnie oceniany in vitro za pomocą specyficznych testów różnicowania i analizowany za pomocą immunofluorescencji. Potencjał regeneracyjny IDEM jest dalej oceniany in vivo, po przeszczepieniu domięśniowym i dotętniczym w dwóch reprezentatywnych modelach mysich wykazujących ostrą i przewlekłą regenerację mięśni. Udział IDEM w mięśniach szkieletowych gospodarza jest następnie potwierdzany za pomocą różnych testów funkcjonalnych u przeszczepionych myszy. W szczególności poprawa zdolności motorycznej zwierząt jest badana za pomocą testów na bieżni. Wszczepianie i różnicowanie komórek jest następnie oceniane za pomocą szeregu testów histologicznych i immunofluorescencyjnych na przeszczepionych mięśniach. Ogólnie rzecz biorąc, w niniejszym artykule opisano testy i narzędzia stosowane obecnie do oceny zdolności różnicowania IDEM, koncentrując się na metodach przeszczepiania i późniejszych pomiarach wyników w celu analizy skuteczności przeszczepu komórek.
Wprowadzenie
Mezoangioblasty (MAB) są związanymi z naczyniami progenitorami mięśniowymi pochodzącymi z podzbioru perycytów1-3. Główna przewaga MAB nad kanonicznymi progenitorami mięśni, takimi jak komórki satelitarne4, polega na ich zdolności do przekraczania ściany naczynia po dostarczeniu dotętniczym, a tym samym przyczyniania się do regeneracji mięśni szkieletowych w protokołach terapii komórkowej. Ta cecha została oceniona i potwierdzona zarówno w mysich, jak i psich modelach dystrofii mięśniowej1,5,6. Te badania przedkliniczne zbudowały podstawy do pierwszego badania klinicznego fazy I/II z udziałem ludzi, opartego na dotętniczym przeszczepieniu MAB identycznych z HLA dawcy u dzieci z dystrofią mięśniową Duchenne'a (EudraCT nr 2011-000176-33; obecnie w trakcie realizacji w szpitalu San Raffaele w Mediolanie, Włochy). Jedną z głównych przeszkód w terapii komórkowej, w której do leczenia mięśni całego ciała potrzebne są miliardy komórek, jest ograniczony potencjał proliferacyjny "produktu leczniczego" (komórek). Ponadto wykazano niedawno, że nie jest możliwe uzyskanie MAB od pacjentów dotkniętych niektórymi postaciami dystrofii mięśniowej, ponieważ występuje to w dystrofii mięśniowej obręczowo-kończynowej 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, niedawno ustanowiono protokół do pozyskiwania komórek macierzystych/progenitorowych podobnych do MAB z ludzkich i mysich iPSC7. Procedura ta generuje łatwo rozszerzalne populacje komórek o sygnaturze genów naczyniowych i immunofenotypie bardzo podobnym do MAB pochodzących z dorosłych mięśni. Po ekspresji miogennego czynnika regulacyjnego MyoD, zarówno mysie, jak i ludzkie IDEM (odpowiednio MIDEM i HIDEM) ulegają terminalnemu różnicowaniu mięśni szkieletowych. Aby osiągnąć ten cel, IDEM-y mogą być transdukowane za pomocą wektorów zdolnych do kierowania ekspresją MyoD, zarówno konstytutywnie, jak i w sposób indukowalny8-10. Stosuje się wektor lentiwirusowy zawierający cDNA MyoD połączone z receptorem estrogenowym (MyoD-ER), umożliwiając w ten sposób jego translokację jądrową po podaniu tamoksyfenu (analogu estrogenu)11. Strategia ta prowadzi do powstawania przerostowych wielojądrowych miotub o wysokiej skuteczności7. Warto zauważyć, że IDEM nie są rakotwórcze, mogą wszczepiać się i różnicować w mięśniach gospodarza po przeszczepie i mogą być genetycznie korygowane przy użyciu różnych wektorów (np. lentiwirusów lub ludzkich sztucznych chromosomów), torując drogę dla przyszłych autologicznych strategii terapeutycznych. Pozyskiwanie, charakterystyka i transplantacja IDEM zostały opisane w powyższej publikacji7. Ten dokument protokolarny szczegółowo opisuje testy przeprowadzone w celu oceny miogennego różnicowania IDEM in vitro oraz późniejsze pomiary wyników w celu przetestowania skuteczności ich przeszczepu w mysich modelach regeneracji mięśni.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Ocena potencjału miogennego i wszczepienia
- In vitro: różnicowanie wywołane przez MyoD
- Wygenerować stabilną linię komórkową IDEM transdukowaną za pomocą indukowanego tamoksyfenem wektora lentiwirusowego MyoD-ER, miareczkując wielość infekcji (MOI; np. 1, 5 i 50) przy użyciu barwienia opisanego w ppkt 1.1.9 (MyHC) jako wynik skuteczności procedury.
- Posmarować 3,5 cm naczynie 1 ml 1% Matrigel i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Umyć płytkę dwukrotnie pożywką, wysiać 1 x 105 IDEM transdukowane przez MyoD-ER w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 3,5 cm i inkubować w temperaturze 37 °C w pożywce wzrostowej.
- Spodziewaj się, że komórki osiągną zbieg w ciągu jednego lub dwóch dni, a następnie dodaj 1 μM 4OH-tamoksyfen do pożywki wzrostowej (1 dawka).
- Po 24 godzinach zastąpić pożywkę wzrostową pożywką różnicującą uzupełnioną 1 μM 4OH-tamoksyfenem (2. i ostatnia dawka).
- Co drugi dzień zastępować połowę pożywki świeżą pożywką różnicującą.
- Codziennie badaj kultury pod kątem tworzenia się miotube.
- Po tygodniu (5 dni w pożywce różnicującej) delikatnie umyć płytki PBS i utrwalić 4 % paraformaldehydem przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne przeciwciałami przeciwko łańcuchowi ciężkiemu miozyny (MyHC), aby potwierdzić obecność miotubek. Przeciwbarwić barwnikiem jądrowym (np. Hoechst).
Efektywność różnicowania jest oceniana jako procent jąder wewnątrz komórek MyHC-dodatnich: przejdź do następnego kroku, jeśli wydajność wynosi >50%.
- In vivo: wszczepienie w model ostrej regeneracji mięśni
Aby ocenić wkład in vivo IDEM MyoD-ER w regenerację mięśni, komórki są wcześniej znakowane wektorem kodującym białko zielonej fluorescencji (GFP), które umożliwi śledzenie ich wewnątrz tkanki. IDEM MyoD-ER GFP są następnie wstrzykiwane do dorosłych mięśni mysich, wcześniej uszkodzonych miotoksyną (np. kardiotoksyną). Aby uniknąć odrzucenia immunologicznego przeciwko komórkom ksenogenicznym (takim jak HIDEMs) lub genetycznie zmodyfikowanym/skorygowanym, wymagane jest użycie myszy z niedoborem odporności lub immunosupresją.- Na 24 godziny przed przeszczepieniem należy wstępnie potraktować zwierzęta wstrzyknięciem dootrzewnowym 3,5 μl/g 10 mg/ml tamoksyfenu (forma rozpuszczalna w tłuszczu) i wstępnie potraktować komórki, dodając 1 μM 4OH-tamoksyfen (postać wodna) do pożywki wzrostowej na noc przed dniem przeszczepienia.
- Podaj znieczulenie i znieczulenie myszy zgodnie ze szczegółowymi wytycznymi, które regulują zabiegi chirurgiczne w obiekcie dla zwierząt.
- Wstrzyknąć 25 μl 100 μM kardiotoksyny (CTX; z Naja mossambica mossambica; UWAGA: potencjalnie szkodliwa substancja) w mięśniach piszczelowych przednich (TA).
- 24 godziny po podaniu zwierzętom tamoksyfenu i CTX, odłączyć komórki przez trypsynizację i policzyć.
- Odwirować komórki przy 232 x g przez 5 minut.
- Przemyć osad komórkowy w PBS wolnym od Ca2+ i Mg2+, odwirować, a następnie delikatnie zawiesić osad komórkowy w PBS bez Ca2+ i Mg2+ do końcowego stężenia 106 komórek/30 μl, które będzie końcową objętością każdego wstrzyknięcia.
- Wstrzyknąć 30 μl zawiesiny komórkowej do wcześniej uszkodzonych mięśni za pomocą strzykawki z igłą 29 lub 30 G. Zwróć szczególną uwagę podczas wyjmowania igły z mięśnia. Rób to powoli, unikając rozlania zawiesiny komórek przez tor igły. Nie przeszczepiaj przeciwległego TA i używaj go jako kontroli, wstrzykując 30 μl PBS wolnego od Ca2 + i Mg2 +, aby odtworzyć warunki przeszczepionego TA .
- Leczyć zwierzęta tamoksyfenem przez dodatkowe sześć dni i podawać środek przeciwbólowy (np. karprofen) przez dodatkowe dwa dni.
- Mięśnie należy eksplantować od 14 dni po przeszczepie. Przetwarzaj i analizuj próbki zgodnie z opisem w protokołach 4 i 5.
2. Transplantacja w mysich modelach dystrofii mięśniowej
Ten test transplantacyjny pozwala ocenić stopień wszczepienia IDEM w mysich modelach dystrofii mięśniowej. Zwierzęta, traktowane w następujący sposób, mogą być również oceniane pod kątem funkcjonalnej poprawy fenotypu choroby. Testy funkcjonalne można wykonywać już od dwóch tygodni po przeszczepie. W celu zwiększenia wszczepienia należy rozważyć wykonanie ćwiczeń na bieżni przed przeszczepem (zgodnie z opisem w Protokole 3) i/lub seryjnych iniekcji komórek co trzy tygodnie przez 3 razy (tj. w sumie 3 wstrzyknięcia/mięsień).
- Przeszczep domięśniowy
- Na 24 godziny przed przeszczepieniem należy wstępnie potraktować zwierzęta wstrzyknięciem dootrzewnowym 3,5 μl/g 10 mg/ml tamoksyfenu (preparat rozpuszczalny w tłuszczu) i wstępnie potraktować komórki, dodając 1 μM 4OH-tamoksyfen (preparat wodny) do podłoża wzrostowego na noc przed dniem przeszczepienia.
- Odłączyć przez trypsynizację, policzyć i odwirować komórki przy 232 x g przez 5 minut.
- Przemyć osad komórkowy w PBS wolnym od Ca2+ i Mg2+, odwirować, a następnie ponownie zawiesić osad w PBS wolnym od Ca2+ i Mg2+ do stężenia 106 komórek/30 μl.
- Zastosować środek przeciwbólowy i zdezynfekować skórę zwierzęcia (opcjonalnie) środkiem dezynfekującym na bazie jodu lub chloreksydyny powidonu. Pomoże to również zlokalizować mięśnie piszczelowe przednie (TA), brzuchaty łydki (GC) i mięsień czworogłowy uda (QC; w szczególności mięsień obszerny pośredni).
- Wstrzyknąć 30 μl zawiesiny komórkowej do mięśni za pomocą strzykawki z igłą o sile 29 lub 30 G. W przypadku TA należy wprowadzić igłę 5 mm poniżej wkłucia ścięgna bliższego (kierunek czaszkowo-ogonowy) z nachyleniem 15° w stosunku do kości piszczelowej i powoli wstrzykiwać zawiesinę komórkową, jednocześnie chowając igłę (opróżnić strzykawkę, gdy 2 mm igły nadal znajduje się wewnątrz mięśnia). W przypadku GC i QC powtórzyć tę samą procedurę, jak opisano dla TA, przy czym główną różnicą jest wkłucie ogonowo-czaszkowe igły 2 mm powyżej połączenia mięśniowo-ścięgnistego ścięgna Achillesa w przypadku GC i 2 mm powyżej ścięgna dystalnego w przypadku QC (nachylenie 15° w stosunku do kości udowej). Zwróć uwagę podczas wyjmowania igły z mięśnia, aby uniknąć rozlania zawiesiny komórek przez tor igły.
ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW: W przypadku niskiego wszczepienia należy rozważyć wstrzyknięcie młodym (1-2 tygodniowym) myszom7 3 x 105 komórek/10 μl (należy pamiętać, że w tym przypadku tamoksyfen musi być podawany podskórnie).
- Przeszczep dotętniczy
Ta część protokołu pozwala na ocenę zdolności MIDEM i HIDEM do dostarczania do krążenia tętniczego, przekraczania ściany naczynia i przyczyniania się do regeneracji mięśni szkieletowych w mięśniach znajdujących się poniżej miejsca wstrzyknięcia.- Wstępnie poddać leczenie zwierząt i komórek w sposób opisany powyżej w kroku 2.1.1.
- Odłączyć przez trypsynizację i przefiltrować za pomocą sitka komórkowego o wielkości 40 μm (w celu usunięcia skupisk z zawiesiny komórkowej w mało prawdopodobnym przypadku, gdy nocne narażenie na tamoksyfen mogłoby spowodować fuzję i tworzenie miotub z sąsiednich komórek), policzyć i odwirować komórki przy 232 x g przez 5 minut
- Umyć osad komórkowy w PBS wolnym od Ca2+ i Mg2+, odwirować, a następnie ponownie zawiesić osad w PBS wolnym od Ca2+ i Mg2+ za pomocą 0,2 International
Jednostki heparyny sodowej (opcjonalnie) do końcowego stężenia komórek 10-6 komórek/50 μl. Dodać 10% niebieskiego barwnika patentowego (końcowe stężenie: 1,25 mg/ml w soli fizjologicznej lub PBS bez Ca2+ i Mg2+) do roztworu w celu uwidocznienia rozkładu zawiesiny komórek. - Podać myszowi znieczulenie i środek przeciwbólowy zgodnie z wytycznymi regulującymi procedury chirurgiczne w określonej placówce dla zwierząt.
- Ogol okolicę pachwinową (znaną również jako trójkąt kości udowej lub skarpy) i zdezynfekuj skórę środkiem dezynfekującym na bazie jodu lub chlorheksydyny powidonu.
- Wykonaj nacięcie 5-7 mm i zlokalizuj pęczek kości udowej: żyłę, tętnicę i nerw (nerw leży bocznie do tętnicy, a żyła przyśrodkowo).
- Delikatnie usuń powięź łączącą, która zakrywa wiązkę za pomocą kleszczy.
- Oddziel żyłę udową i nerw od tętnicy, delikatnie wprowadzając końcówkę kleszczyka (lub igły 30 G) między nie i stopniowo powiększając otwór.
ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW: Żyła udowa jest delikatna: należy zwrócić uwagę, aby nie ściskać jej kleszczami podczas jej odłączania od tętnicy udowej. W przypadku krwotoku spuść krew sterylną gazą i użyj mikrokauteryzatora, aby ułatwić hemostazę. - Podnieś tętnicę jedną końcówką kleszczy i zaciśnij tętnicę drugą końcówką.
- Nakłuć tętnicę strzykawką wyposażoną w igłę 30 G. Wstrzyknąć 50 μl zawiesiny komórkowej za zaciśniętym obszarem, z prędkością infuzji około 5 μl/sek.
ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW: Przed wstrzyknięciem należy ostrożnie zawiesić komórki w strzykawce: ważne jest, aby uniknąć wytrącania się komórek i tworzenia się pęcherzyków powietrza wewnątrz strzykawki. Średnica tętnicy udowej jest nieco mniejsza niż igły 30 G: należy uważać, aby nie obciąć tętnicy podczas wprowadzania igły. Opatentowany niebieski barwnik pozwala rozpoznać skuteczność iniekcji: jeśli zostanie prawidłowo wstrzyknięta, cała kończyna szybko zmieni kolor na jasnoniebieski. - Powoli wyjmij igłę i kleszcze z tętnicy, aby przywrócić przepływ krwi w kończynie.
- Uciskaj sterylną gazą, aby uniknąć krwawienia i/lub kauteryzuj w razie potrzeby.
- Zszyj ranę i monitoruj zwierzęta aż do wyzdrowienia ze znieczulenia.
- Podawaj środek przeciwbólowy przez 3 dni i codziennie sprawdzaj ranę (w przypadku zakażenia rany omów to z personelem obiektu dla zwierząt i w razie potrzeby podaj antybiotyki).
3. Miary wyników na przeszczepionych zwierzętach dystroficznych: Test na bieżni
Począwszy od dwóch tygodni po przeszczepie komórek, możliwe jest ocena funkcjonalnej poprawy zdolności motorycznej leczonych myszy za pomocą testów na bieżni. Test ten pozwala na ocenę tolerancji/wytrzymałości wysiłkowej leczonych myszy. Mysz jest uważana za zmęczoną, gdy leży w obszarze spoczynku przez ponad 5 sekund, bez próby ponownego włączenia bieżni po serii 3 kolejnych bodźców mechanicznych (jeden co 5 sekund). Pomiary wyjściowe rozpoczynają się około miesiąc przed leczeniem i służą do oceny poprawy u każdego badanego zwierzęcia. Po tym teście można wykonać dodatkowe testy w celu monitorowania kruchości włókien, poprawy siły, wszczepienia, różnicowania przeszczepionych komórek i poprawy morfologicznej przeszczepionych mięśni (patrz Dyskusja).
- Zaaklimatyzuj zwierzęta (zwykle trzy grupy: leczone, nieleczone i kontrole typu dzikiego/niedystroficznego) do ćwiczeń przed pierwszym pomiarem: ustaw bieżnię na prędkość 6 m/min na 10 minut. Powtarzaj procedurę co drugi dzień przez tydzień.
ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW: Rejestruj wszystkie pomiary o tej samej porze dnia, aby uniknąć błędów spowodowanych cyklami okołodobowymi. - Umieść zwierzęta w bieżni, która została wcześniej ustawiona z nachyleniem 10°.
- Włącz bieżnię o prędkości początkowej 6 m/min (zapewnij delikatny bodziec mechaniczny w przypadku, gdy zwierzęta nie chcą rozpocząć ćwiczenia).
- Uruchom timer i zwiększaj prędkość 2 m/min co 2 min.
- Gdy tylko zwierzę położy się w miejscu odpoczynku na dłużej niż 5 sekund bez próby ponownego włączenia bieżni, delikatnie dotknij go patykiem, aby stymulować wznowienie ćwiczenia (patrz wyżej).
- Rejestruj wydajność (czas i/lub odległość) każdego zwierzęcia.
- Powtarzaj pomiary co tydzień lub co 10 dni co najmniej 3 razy.
- Powtórz tę samą procedurę po przeszczepie.
- Analizuj dane dotyczące wydajności, porównując pomiary każdego zwierzęcia z jego wydajnością wyjściową. Sugerujemy wykreślenie wartości na wykresie jako procentu średniej zdolności motorycznej w stosunku do wartości wyjściowej i przeanalizowanie ich za pomocą jedno- lub dwuczynnikowego testu ANOVA, a następnie odpowiedniego testu końcowego w celu porównania grup.
ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW: użyj minimum 5 zwierząt/grup dopasowanych pod względem wieku, genotypu i płci i powtórz pomiary co najmniej 3 razy po przeszczepie.
4. Ocena wszczepienia i różnicowania komórek w przeszczepionych mięśniach
Przeszczepione i kontrolne mięśnie są pobierane w odpowiednim momencie (<2 dni na krótkoterminową analizę przeszczepu, 2-3 tygodnie na średnią i >1 miesiąc na długoterminową analizę). Jeśli przeszczepione komórki są znakowane GFP, wszczepienie w świeżo wyizolowane mięśnie można ocenić za pomocą bezpośredniej fluorescencji pod stereomikroskopem wyposażonym w promieniowanie UV.
- Ułóż i zorientuj wzdłuż osi pionowej świeżo izolowane mięśnie w gumie tragaczantowej (6% w/v)
- Odwodnić próbki w schłodzonym izopentanie przez jedną minutę, zamrozić je w ciekłym azocie przez co najmniej 2 minuty i natychmiast umieścić w temperaturze -80 °C w celu przechowywania.
- Próbki należy przetworzyć za pomocą kriostatu, aby uzyskać skrawki o grubości 7 μm na spolaryzowanych szkiełkach. Pobranie próbki większości mięśni na szkiełkach, zbierając około 8-10 szkiełek z 30-40 sekcjami na slajd. Zaleca się zebranie serii skrawków do probówki o pojemności 1,5 ml w celu przeprowadzenia testów biologii molekularnej/biochemii.
- Oceń wszczepienie komórek za pomocą różnych barwień immunofluorescencyjnych, w zależności od konfiguracji eksperymentalnej. Na przykład w przypadku przeszczepu HIDEM u myszy Sgca-null/scid/bg, wybarwić skrawki za pomocą: a) przeciwciała przeciwko Laminie A/C w celu wykrycia przeszczepionych jąder komórek ludzkich; b) przeciwciało przeciwko Lamininie w celu uwidocznienia ogólnej struktury mięśnia; oraz c) przeciwciało przeciwko Sgca w celu wykrycia pochodzącej od dawcy odbudowy białka nieobecnego u zwierzęcia dystroficznego.
- Określić ilościowo, za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, liczbę jąder dawcy na sekcję mięśniową wewnątrz i na zewnątrz włókien mięśniowych oraz liczbę włókien mięśniowych szkieletu pochodzących od dawcy na sekcję.
5. Histopatologia mięśni
Analizy histopatologiczne pozwalają na ocenę struktury morfologicznej przeszczepionego mięśnia. Oczekuje się, że poprawa architektury struktury tkanki będzie wynikiem podejścia opartego na terapii komórkowej.
- Utrwalić świeżo odizolowane mięśnie za pomocą 4% paraformaldehydu przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
- Odwodnić próbki za pomocą rosnącego gradientu sacharozy (np. 7,5-15-30% w/v).
- Pozostaw mięśnie na noc w roztworze najwyższej zawartości sacharozy.
- Zanurzyć próbki w Tissue Tek OCT, umieścić je we wstępnie schłodzonym izopentanie do momentu, aż OCT stanie się twardy (unikając całkowitego zanurzenia próbek), zamrozić je w ciekłym azocie przez co najmniej 2 minuty i natychmiast umieścić w temperaturze -80 °C w celu przechowywania.
- Próbki należy przetworzyć za pomocą kriostatu w celu uzyskania skrawków o grubości 7 μm, jak opisano powyżej.
- Wybarwić skrawki hematoksyliną i eozyną lub trichromem Massona zgodnie ze standardowymi protokołami producenta.
Barwienie hematoksyliną i eozyną umożliwia obliczanie cech regenerujących mięśni, takich jak: a) liczba włókien mięśniowych; b) pole przekroju poprzecznego; c) liczba włókien mięśniowych zawierających jądro centralne. Trichrom Massona służy do obliczania wskaźnika zwłóknienia, wykonywanego przez odjęcie całkowitej powierzchni zajmowanej przez włókna mięśniowe szkieletu od całkowitej powierzchni obrazu: uzyskany obszar odzwierciedla głównie naciek łączny i tłuszczowy mięśnia. Wszystkie analizy na obrazach można wykonać za pomocą oprogramowania ImageJ (NIH) z narzędziem pomiarowym i wtyczką licznika komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawione reprezentatywne wyniki następują po głównych analizach in vitro/in vivo przedstawionych w schemacie w rycinie 1. 48 h po podaniu 4OH-tamoksyfenu w hodowanych IDEMs przetransdukowanych MyoD-ER można zidentyfikować jądra dodatnie pod kątem MyoD (rycina 2A). Następnie komórki te ulegają fuzji i różnicują się w wielojądrowe miotuby (rycina 2B). Po przeszczepieniu domięśniowo do mysiego modelu ostrego uszkodzenia mięśni, IDEMs przyczyniają się do regene...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Komórki iPS mogą być namnażane w nieskończoność, zachowując przy tym ich potencjał samoodnawiania, a tym samym ukierunkowane na różnicowanie się w szeroki zakres linii komórkowych12. Z tego i innych powodów komórki macierzyste/progenitorowe pochodzące z iPSC są uważane za obiecujące źródło autologicznych metod terapii genowej i komórkowej13. Wcześniej opublikowana praca Autorzy opisywali generowanie mysich i ludzkich miogennych komórek progenitorowych z iPSC o fenotypie podobnym do MAB pochodzących ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
F.S.T. złożyła międzynarodowy wniosek patentowy (nr PCT/GB2013/050112), w tym część strategii opisanej w tym artykule. Na swoje badania otrzymał dofinansowanie od Promimetic i DWC ltd.
Podziękowania
Autorzy dziękują Giulio Cossu, Martinie Ragazzi i całemu laboratorium za pomocną dyskusję i wsparcie, a także Jeffowi Chamberlainowi za uprzejme dostarczenie wektora MyoD-ER. Wszystkie eksperymenty na żywych zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi agencjami regulacyjnymi i instytucjonalnymi, przepisami i wytycznymi. Prace w laboratorium autorów są wspierane przez Brytyjską Radę ds. Badań Medycznych, projekty Wspólnoty Europejskiej 7th Framework Optistem i Biodesign oraz włoski Duchenne Parent Project.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODCZYNNIKI | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Surowica | końska Euroclone | ECS0090L | |
| Surowica bydlęca płodowa | Lonza | DE14801F | |
| PBS Bez wapnia/magnezu | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamina | Sigma | G7513 | |
| Penicylina/Streptomycyna | Sigma | P0781 | |
| 2-merkaptoetanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulina-Transferyna-Selen) | Gibco | 51500-056 | |
| Nieistotny roztwór aminokwasów | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Kwas oleinowy | Sigma | 01257-10 mg | |
| Kwas linolowy | Sigma | L5900-10 mg | |
| Ludzki bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Czynniki wzrostu o obniżonej wartości Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsyna | Sigma | T3924 | |
| Heparyna sodowa | Mayne Pharma | ||
| Błękit trypanowy roztwór | Sigma | T8154 | SZKODLIWY |
| Niebieski barwnik patentowy | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyd | TAAB | P001 | SZKODLIWY |
| Tamoksyfen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoksyfen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Kardiotoksyna | Sigma | C9759 | SZKODLIWY |
| jod | powidonu | ||
| Guma tragiczna | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopentan | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sacharoza | VWR | 27,480,294 | |
| Prowadnice ze szkła polaryzacyjnego | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Maskon trichromowy | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mysie przeciwciało anty miozyny o ciężkim łańcuchu | DSHB | MF20 | |
| Mysie przeciwciało anty Lamin A/C | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Królicze przeciwciało anty Laminin | Sigma | L9393 | |
| MATERIAŁY I SPRZĘT | |||
| Adsorbowalny szew antybakteryjny 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Strzykawka igłowa | BD | 324826 | |
| Bieżnia | Columbus instrument | ||
| Mikroskop steroskopowy | Nikon | SMZ800 | |
| Mikroskop odwrócony | Leica | DMIL LED& | nbsp; |
| Jednostka izofluranu | Aparat | Harvada | |
| Światłowody | Euromecs (Holandia) | EK1 | |
| Poduszka grzewcza | Vet Tech | C17A1 | |
| Skalpele | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Kleszcze chirurgiczne | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| Kauteryzator wysokotemperaturowy | Bovie Medical | AA01 | |
| SKŁAD POŻYWKI | |||
| Skład podłoża jest szczegółowo opisany poniżej. Pożywka wzrostowa HIDEMs:
| |||
Tabela 1. Wykaz odczynników, materiałów, sprzętu i pożywki. |
Bibliografia
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
