Wieloskalowa modyfikacja implantów metalowych z gradientami porów, polielektrolitami i ich pośrednie monitorowanie in vivo

Summary

W tym filmie zademonstrujemy techniki modyfikacji porowatych metalowych implantów w celu poprawy ich funkcjonalności i kontroli migracji komórek. Techniki obejmują opracowywanie gradientów porów w celu kontrolowania ruchu komórek w 3D oraz wytwarzanie naśladowców błony podstawnej w celu kontrolowania ruchu komórek w 2D. Opisano również opartą na HPLC metodę monitorowania integracji implantów in vivo poprzez analizę białek krwi.

Abstract

Implanty metalowe, szczególnie implanty tytanowe, są szeroko stosowane w zastosowaniach klinicznych. Wrastanie tkanek i integracja z tymi implantami w tkankach są ważnymi parametrami dla pomyślnych wyników klinicznych. W celu poprawy integracji tkanek opracowywane są porowate implanty metalowe. Otwarta porowatość pianek metalicznych jest bardzo korzystna, ponieważ obszary porów można funkcjonalizować bez uszczerbku dla właściwości mechanicznych całej konstrukcji. Tutaj opisujemy takie modyfikacje z wykorzystaniem porowatych implantów tytanowych opartych na mikrogranulkach tytanu. Dzięki wykorzystaniu nieodłącznych właściwości fizycznych, takich jak hydrofobowość tytanu, możliwe jest uzyskanie hydrofobowych gradientów porów w implantach metalowych na bazie mikrokulek, a jednocześnie uzyskanie immiki membrany podstawnej opartej na hydrofilowych, naturalnych polimerach. Gradienty porów 3D są tworzone przez syntetyczne polimery, takie jak kwas poli-L-mlekowy (PLLA), metodą ekstrakcji przez zamrażanie. Powierzchnie nanofibrylarne 2D są formowane przy użyciu kolagenu/alginianu, a następnie etapu sieciowania za pomocą naturalnego środka sieciującego (genipiny). Ten film nanofibrylarny został zbudowany metodą osadzania warstwa po warstwie (LbL) dwóch przeciwnie naładowanych cząsteczek, kolagenu i alginianu. Wreszcie, można uzyskać implant, w którym różne obszary mogą pomieścić różne typy komórek, ponieważ jest to konieczne dla wielu tkanek wielokomórkowych. W ten sposób można kontrolować ruch komórek w różnych kierunkach przez różne typy komórek. Taki system jest opisany dla konkretnego przypadku regeneracji tchawicy, ale może być zmodyfikowany dla innych narządów docelowych. Omówiono analizę migracji komórek i możliwe metody tworzenia różnych gradientów porów. Kolejnym krokiem w analizie takich implantów jest ich charakterystyka po implantacji. Jednak analiza histologiczna implantów metalowych jest długim i kłopotliwym procesem, dlatego do monitorowania reakcji gospodarza na implanty metalowe in vivo opisano również alternatywną metodę opartą na monitorowaniu CGA i różnych białek krwi. Metody te mogą być wykorzystywane do opracowywania niestandardowych testów migracji i kolonizacji in vitro, a także do analizy funkcjonalizowanych implantów metalowych in vivo bez histologii.

Introduction

Obecnie dostępne metalowe implanty nadają się do zastosowań nośnych, ale ich niedegradowalność wymaga konstrukcji, które zapewniają silne połączenie z otaczającą je tkanką ¹. Zapewniając struktury, które ułatwiają rozwój komórkowy i kolonizację in vivo, można przedłużyć żywotność implantów metalowych ². Otwarcie porowate implanty metalowe są obiecującymi materiałami do inżynierii granicy faz tkankowych, a także do zapewnienia dobrej kolonizacji implantów. Są one aktywnie stosowane jako implanty ortopedyczne, a także jako implanty tchawicy ^3-5. Jednak nadal istnieją problemy, które należy rozwiązać, takie jak precyzyjna kontrola ruchu komórek w obszarach porów. Brak kontroli nad tym procesem może prowadzić do niepełnej kolonizacji w jednym końcu i restenozy w drugim. Dalsza funkcjonalizacja tych implantów jest również niezbędna do osiągnięcia wyższych funkcji, takich jak dostarczanie czynników wzrostu, ukierunkowane unaczynienie i jednoczesny ruch różnych typów komórek ^6-8. W przypadku implantów tchawicy ma to kluczowe znaczenie, ponieważ pożądana jest kolonizacja implantu przez unaczynioną tkankę. Jednak niekontrolowane wrastanie tkanek do światła tchawicy jest niepożądane, ponieważ zmniejsza drożność implantu.

Jedną z możliwości kontrolowania ruchu komórek jest wykluczenie rozmiaru. Znając wielkość komórek docelowych i ich zdolność do interakcji z danym polimerem syntetycznym, możliwe jest opracowanie gradientów porów, które mogą skutecznie określić głębokość ruchu komórki. Na przykład poprzez stworzenie architektury porów, która jest wystarczająco duża, aby komórki tkanki łącznej, takie jak fibroblasty, mogły dostać się zewnątrz, ale wystarczająco mała (mniej niż 10 μm), aby zapobiec ich ruchowi w obrębie światła, można osiągnąć skuteczną kontrolę nad kolonizacją implantu rurkowego.

Spośród dostępnych metod tworzenia porów, takich jak liofilizacja, ługowanie cząstek, spienianie gazowe ^9,10; najłatwiejszą do zaadaptowania metodą szybkiego tworzenia gradientów porów przy minimalnej ilości niezbędnych urządzeń jest zamrażanie ¹¹. W tej metodzie roztwór polimeru zamraża się w dwuskładnikowej mieszaninie rozpuszczalnika organicznego i wody. Następnie rozpuszczalnik jest wymieniany poprzez ekstrakcję przez mieszalną, wstępnie schłodzoną ciecz, taką jak etanol. Warunki zamrażania i ekstrakcji określają kształt i wielkość porów, a jeśli ekstrakcja odbywa się w sposób, w którym ruch roztworu ekstrakcyjnego może być kontrolowany, wielkość i kształt porów można modulować kierunkowo.

Drugim krokiem dla tkanek wielokomórkowych jest tworzenie porowatych barier między różnymi typami komórek w celu kontrolowania ich interakcji. Jest to również konieczne ze względu na dostępność różnych mikrośrodowisk dla różnych typów komórek w zależności od ich wymagań ^12,13. Tchawica to narząd rurkowy, który łączy krtań z oskrzeliami. Ma wewnętrzną pseudostratyfikowaną wyściółkę nabłonka rzęsek z rozproszonymi komórkami kubkowymi, które wytwarzają śluz. Struktura 3D i stabilność tchawicy jest utrzymywana przez chrząstkę w kształcie pierścieni C. Tak więc w sztucznej tchawicy powinno być określone połączenie między tkanką łączną a warstwą nabłonka rzęskowego. Podczas gdy struktura 3D jest niezbędna dla części tkanki łącznej, migracja komórek nabłonkowych wymaga powierzchni przypominającej błonę podstawną, aby uzyskać ruch kierunkowy i zamknięcie rany. Wielowarstwowe folie polielektrolitowe (PEM) są jedną z możliwych opcji uzyskania immiki membrany podstawnej. Metoda warstwa po warstwie (LbL) to wszechstronny proces uzyskiwania cienkich i funkcjonalnych powłok powierzchniowych. Opiera się na oddziaływaniach elektrostatycznych dwóch przeciwnie naładowanych polielektrolitów i ich sekwencyjnym gromadzeniu w celu uzyskania powłok powierzchniowych w nanoskali, których właściwości można zmieniać poprzez prostą zmianę zmiennych, takich jak gatunki polielektrolitu, pH, liczba warstw, dodanie warstwy zakrywającej, sieciowanie itp. Jedną z głównych zalet metody LbL jest jej zdolność do dostosowania się do topografii podłoża leżącego pod spodem. Dzięki temu w kontrolowanych warunkach metoda ta może być również stosowana do uzyskiwania pokrycia powierzchniowego porowatych struktur. Jeśli kolagen zostanie użyty jako jeden z polielektrolitów, możliwe jest uzyskanie struktur nanofibrylarnych, które mogą naśladować powierzchnię błony podstawnej. Hydrofobowość tytanu umożliwia rozwój takich struktur, a fibrylarność może być zachowana w grubych powłokach ¹⁴. W ten sposób można również kontrolować przyczepianie i ruch komórki na powierzchni. Dzięki zastosowaniu ekstrakcji przez wymrażanie i sekwencyjnego powlekania folią LbL można uzyskać strukturę, w której ruch komórek może być kontrolowany poprzecznie, wzdłużnie i obwodowo ¹⁵.

Tutaj opisujemy dwie nowatorskie metody modyfikacji implantów tytanowych poprzez wykorzystanie ich hydrofobowego zachowania, które można rozszerzyć na modyfikację różnych porowatych implantów: i) tworzenie gradientów mikroporów w makroporowatych implantach tytanowych za pomocą hydrofobowych, syntetycznych polimerów, ii) tworzenie grubej warstwy polimerowej warstwy na powierzchni implantu, która wspomaga wzrost komórek i tworzenie wyściółki przez wielowarstwowe polielektrolity. Metody te mogą być stosowane sekwencyjnie lub osobno. Zapewniają one struktury, które zapewniają kontrolowaną migrację i organizację przestrzenną różnych typów komórek w tkankach wielokomórkowych ^16,17. W konkretnym przypadku tchawicy pożądanym rezultatem implantu byłaby kolonizacja przez tkankę włóknisto-naczyniową w gradientach mikroporów bez restenozy i tworzenie wewnętrznej wyściółki komórek nabłonka rzęskowego na wielowarstwach polielektrolitu.

Jednym ze sposobów kontrolowania integracji implantów jest wykonywanie małych interwencji chirurgicznych w okresie ich integracji z gospodarzem in situ. Aby móc zdecydować o czasie interwencji, ważne jest, aby mieć informacje na temat ogólnoustrojowych skutków implantu. Białko C-reaktywne (CRP) jest stosowane do monitorowania infekcji i odpowiedzi zapalnej w warunkach klinicznych. Chromogranina A (CGA) może być również stosowana w podobny sposób i może zapewnić dokładniejsze wyniki w celu obserwacji poziomu stanu zapalnego ¹⁸. Jako możliwy sposób obserwacji integracji implantów metalicznych in vivo, przedstawiamy procedurę ciągłego monitorowania efektów ogólnoustrojowych implantów poprzez charakteryzację próbek krwi zwierzęcej za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC), a następnie sekwencjonowanie białek. Opracowanie tej metody może być wykorzystane do uniknięcia regularnej analizy histologicznej punktu końcowego. Histological cutting metalowych implantów jest długim, kłopotliwym i kosztownym procesem i może być wykonywany tylko w określonych punktach czasowych. Z tego powodu dobrze zaprojektowane badania krwi dostarczające rzetelnych informacji na temat stanu implantów mogą być możliwymi sposobami na zmniejszenie liczby doświadczeń na zwierzętach, zgodnie z niedawnymi przepisami UE dotyczącymi doświadczeń na zwierzętach.

Przedstawione tutaj metody mogą być wykorzystane do poprawy wydajności metalowych implantów poprzez funkcjonalizację lub do stworzenia alternatywnego sposobu monitorowania istniejących implantów.

Protocol

1. Przygotowanie gradientów mikroporów w makroporowatych implantach metalicznych

1. Oczyść implanty (takie jak implanty wykonane z kulek tytanowych klasy medycznej o zakresie wielkości 400-500 μm, Neyco SAS, Francja) etanolem, a następnie poddaj sonikacji w acetonie przez 15 minut.
2. Projektuj i produkuj formy teflonowe zgodnie z rozmiarem i kształtem implantu (do standardowych eksperymentów stosuje się formy cylindryczne o średnicy 1,5 cm i wysokości 2 cm). Formy powinny być modułowe, aby niektóre części można było usunąć podczas ekstrakcji. Taka konstrukcja formy zapewnia kontrolę nad procesem ekstrakcji poprzez wymuszenie ruchu płynu ekstrakcyjnego w sposób kierunkowy.
3. W przypadku implantów rurkowych przeznaczonych do zastąpienia tchawicy, struktura powinna składać się z trzech części: i) dolnej części w celu określenia rozmiaru implantu, ii) trzpienia i iii) zewnętrznego rdzenia, który jest wyjmowany. W ten sposób gradient wielkości porów może być formowany od zewnątrz do wewnątrz.
4. Przygotować roztwór polimeru syntetycznego (PLLA): Do zamrażania/ekstrakcji roztwór PLLA należy przygotować w mieszaninie binarnej dioksanu i wody (87:13%, v:v).
5. Podgrzać mieszaninę do temperatury 60 °C w celu uzyskania jednorodnego roztworu. Temperaturę 60 °C wybrano, ponieważ jest to górna granica odporności na temperaturę dla precyzyjnych szklanych strzykawek, która musi być użyta do wprowadzenia roztworu do implantów.
6. W przypadku stosowania roztworów PLLA o wysokim stężeniu (≥6%) o dużej masie cząsteczkowej, roztwór należy wprowadzić do implantu natychmiast po podgrzaniu. W przeciwnym razie żelowanie roztworu następuje bez pełnego zanurzenia.
7. Obliczyć objętość niezbędnego roztworu polimeru w odniesieniu do porowatości implantu, dla dokładności można uwzględnić zmianę objętości zamrożonego roztworu.
8. Wprowadzić roztwór do implantów za pomocą precyzyjnych szklanych strzykawek z dokładnością do 0,1 μl. Dolna granica stężenia polimeru wynosi 3% dla powtarzalnego tworzenia gradientu porów, podczas gdy uzyskanie jednorodnego rozkładu w grubych próbkach powyżej 6% staje się trudne. Jednak do konkretnych zastosowań można stosować inne stężenia.
9. Próbki należy zamrozić bezpośrednio w temperaturze -80 °C lub w okresie inkubacji wynoszącym 30 minut w temperaturze pokojowej. Warunki zamarzania częściowo determinują tworzenie się porów, dzięki czemu warunki zamarzania można dostosować do docelowej porowatości. Próbki należy przechowywać przez noc w temperaturze -80 °C.
10. Ekstrakcja: Zanurz implanty w 80% wstępnie schłodzonym EtOH. Ekstrakcję przeprowadzać w temperaturze -20 °C przez noc. Aby uzyskać gradienty porowatości, należy usunąć wszystkie części formy z wyjątkiem trzpienia w przypadku implantów rurkowych i wszystkich części z wyjątkiem dolnej części w przypadku implantów w kształcie dysku. Użyj wstępnie schłodzonego skalpela, aby ułatwić oddzielenie pleśni.
11. Po ekstrakcji w temperaturze -20 °C przez noc ¹⁹ usuń pozostałe części formy i wysusz implanty na powietrzu. Do scharakteryzowania ogólnej porowatości konstrukcji konieczna jest analiza porozymetryczna rtęci. Pomiary porozymetrem rtęciowym wykazały wyraźne piki, które odpowiadają porom po obu stronach implantu i mniejszym porom międzyrozproszonym. Jednak bardziej istotnymi danymi jest różnica między porowatością powierzchni śródświetlnych i pozaświetlnych, którą można analizować za pomocą obrazu J pod kątem rozkładu wielkości porów za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) ²⁰. W celu sprawdzenia gradientu porów należy przetworzyć próbki metodą zamrażania i szczelinowania i obserwować przekrój za pomocą SEM.
12. Ze względu na otwarty porowaty charakter zastosowanych implantów i zdolność odbijania światła przez tytan, możliwe jest wykonanie z-stosów znakowanych komórek w porowatych implantach. Oznacz komórki za pomocą PKH26 lub Calcein-AM i uwidocznij implanty za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej.

2. Powlekanie powierzchni porowatych implantów metalicznych wielowarstwami kolagenu/alginianu

1. W przypadku tworzenia warstw wielowarstwowych najwyższą powtarzalność uzyskuje się za pomocą robotów zanurzających. Jeśli jednak robot zanurzający nie jest dostępny, czynności te można wykonać ręcznie.
2. Używaj kolagenu klasy medycznej typu I i alginianu sodu. Zoptymalizowane stężenia wynoszą 0,5 g/l na każde 150 mM NaCl w buforze cytrynianowym o pH 3,8.
3. Rozpuść roztwór kolagenu przez noc, aby zapewnić jednorodność roztworu. Kwaśne pH 3,8 jest niezbędne do stabilnego tworzenia warstw, ponieważ struktura jest niestabilna przed usieciowaniem w neutralnym pH.
4. Nakładaj warstwy za pomocą systemu robota zanurzającego, zanurzając implanty naprzemiennie w roztworach kolagenu i alginianu. Czas osadzania wynosi 15 min dla każdej kolejnej warstwy. Przepłukać strukturę pomiędzy etapami osadzania za pomocą 150 mM NaCl o pH 3,8 przez 5 minut.
5. Zaprojektuj specjalny uchwyt do wykorzystania implantów z robotami zanurzeniowymi stosowanymi w produkcji wielowarstwowej polielektrolitu. Warstwy należy osadzić na powierzchni implantów zawierających tylko tytan lub implantów zmodyfikowanych zgodnie z opisem w punkcie 1.
6. Stabilizacja błony podstawnej za pomocą genipiny: Przygotować roztwór sieciujący w buforze dimetylosulfotlenku (DMSO)/cytrynianu (150 mM NaCl, pH 3,8) w stosunku 1:4 v:v. Można stosować szeroki zakres stężeń, a 100 mM jest wystarczające do sieciowania. Najpierw rozpuść genipinę w składniku DMSO, a później dodaj składnik wodny, aby uniknąć zbrylania.
7. Sieciować próbki przez zanurzenie w roztworze sieciującym między 12 a 24 godzinami. Następnie spłukać dużą ilością buforu cytrynianowego (pH 3,8).
8. Po umyciu próbki należy wysterylizować za pomocą promieniowania UV (30 min) lub kąpieli antybiotykowej/przeciwgrzybiczej (penicylina/streptomycyna, fungizone).
9. Głównymi parametrami decydującymi o jakości naśladownictwa membrany podstawnej są jej grubość i średnica włókien. Oblicz średnice włókien za pomocą obrazów mikroskopii sił atomowych (AFM) uzyskanych w trybie kontaktowym. Przed obrazowaniem wysuszyć próbki strumieniem azotu. Określ ilościowo grubość co najmniej 10 włókien na obraz, aby określić średnią grubość włókien za pomocą oprogramowania Image J.
10. Grubość folii można określić za pomocą testów zarysowania za pomocą AFM. Suche (COL/ALG)₂₄ / COL folie wielowarstwowe. Użyj igły strzykawki, aby zarysować folię. Po zlokalizowaniu rysy za pomocą mikroskopu świetlnego należy uzyskać obrazy za pomocą AFM na powierzchniach 10 x 10^μm2 na granicy rysy. Oblicz wysokości z profili uzyskanych za pomocą oprogramowania AFM, które zapewnia grubość warstwy folii.

3. Pośrednie monitorowanie integracji implantów in vivo poprzez analizę osocza krwi

1. W przypadku doświadczeń na zwierzętach należy uzyskać wszystkie niezbędne zgody komitetu, zgodnie z zasadami obowiązującymi w każdym kraju ²¹. W naszym przypadku postępuje się zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania (Krajowa Rada ds. Badań Naukowych, 2010) i uzyskuje się zgodę komisji etycznej Uniwersytetu w Strasburgu.
2. Przeprowadzić implantację w miejscu docelowym. Podany tutaj protokół monitorowania krwi został wykorzystany do wymiany tchawicy u białych królików nowozelandzkich po resekcji tchawicy 15 mm.
3. Po implantacji konieczna jest codzienna obserwacja, taka jak monitorowanie ogólnego samopoczucia zwierząt (gojenie się wokół miejsc operowanych, tempo oddychania) i rejestrowanie ich wagi.
4. Aby zweryfikować badanie krwi, należy użyć dobrze ugruntowanej metody, takiej jak testy ELISA na poziom CRP we krwi. Dostępne są testy CRP dla wielu zwierząt, a konkretny test stosowany u królików jest wymieniony w tabeli 1. Podobnie, użyj western blot do określenia poziomów CGA. W protokole tym zastosowano przeciwciała monoklonalne anty-CGA (anty-CGA_47-68).
5. W celu scharakteryzowania osocza należy pobrać próbki krwi z żył usznych królików. Wirować przy 5 000 obr./min przez 20 min w temperaturze 4 °C. Użyć otrzymanego supernatantu do analizy. W naszej procedurze badania te są wykonywane co tydzień, ale możliwe są również częstsze testy.
6. Oczyszczanie HPLC z odwróconej fazy zawartości białka w osoczu: Ekstrahować osocze królika 0,1% kwasem trifluorooctowym (1:1; v:v). Oczyszczać ekstrakt za pomocą systemu Dionex HPLC (Ultimate 3000; Sunnyvale, CA, USA) na kolumnie jąderka 300-5C18 z odwróconymi fazami (4 x 250 mm; wielkość cząstek 5 μm; porowatość, 300 A).
7. Zanotować absorbancję przy 214 i 280 nm. Zastosowany system rozpuszczalników to i) Rozpuszczalnik A: 0,1% (v/v) kwas trifluorooctowy (TFA) w wodzie i ii) Rozpuszczalnik B: 0,09% (v/v) TFA w 70% (v/v) acetonitrylu w wodzie.
8. Stosować natężenie przepływu 700 μl/min przy użyciu gradientów dla elucji. Zbierz frakcje szczytowe. Zagęścić frakcje przez odparowanie przez aplikację szybko-próżniową. Ważne jest, aby zatrzymać próżnię przed całkowitym wyschnięciem.
9. Skoreluj piki uzyskane w różnych punktach czasowych w trakcie okresu implantacji. Użyj oczyszczonych peptydów, które wykazują stałe tendencje w trakcie implantacji, do identyfikacji za pomocą automatycznego sekwencjonowania Edmana.
10. Automatyczne sekwencjonowanie peptydów metodą Edmana: Określ N-końcową sekwencję oczyszczonych peptydów poprzez automatyczną degradację Edmana przy użyciu mikrosekwenatora Procise. Załadować próbkę do filtrów z włókna szklanego nasączonych polibrenem. Kolejnym krokiem jest identyfikacja aminokwasów fenylotiohydantoiny (Pth-Xaa) za pomocą chromatografii na kolumnie C₁₈ (PTH C-18, 2,1 x 200 mm) ²². Po uzyskaniu sekwencji można ją zidentyfikować za pomocą oprogramowania Blast za pomocą bazy danych SWISS-Prot .

Results

Powstawanie gradientów porów

Zmieniając stężenie roztworu PLLA, można kontrolować wielkość porów po zewnętrznej stronie implantów. Na wielkość i kształt porów istotny wpływ miała obecność implantów tytanowych (ryc. 1a i 1b). Rozmiary porów wahały się od 40 do 100 μm, a zastosowanie niższych stężeń skutkowało zmniejszeniem porów. Natomiast w części śródświetlnej wielkość porów była regulowana przez ograniczoną ekstrakcję i wynosiła około 9 μm ²³, czyli ...

Discussion

Gradienty porów są ważnymi narzędziami w inżynierii tkankowej interfejsu, a opisany tutaj system może być używany samodzielnie lub w połączeniu z metalowymi implantami w celu utworzenia gradientu porów w celu badania migracji komórek. System nie wymaga żadnych dodatkowych ustawień ani dodatkowego wyposażenia, z wyjątkiem dygestorium chemicznego do obsługi rozpuszczalników organicznych, dzięki czemu może być stosowany w laboratoriach biologicznych. Podobne polimery, takie jak kwas poli(glikolowy) (PGA), kwas poli(mlekowo-...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynnik
Dioxane	Sigma-Aldrich	360481	Materiał toksyczny, Ściśle pod kapturem chemicznym
PLLA i. Lepkość własna poli(L-laktydu) ~0,5 dl/g ii. Lepkość własna poli(L-laktydu) ~ 2,0 dl / g	Sigma-Aldrich	94829, 81273	Wybór masy cząsteczkowej i lepkości naturalnej zależy od zastosowania.
PRONOVA UP LVG (alginian sodu)	Novamatrix	4200006	Niska lepkość (20-200 mPa.s)
Kolagen typu I (bydlęcy)	Symaty	CBPE2US100
Pen/Strep, Fungizone	Promocell	C42020
Genipin	Wako	0703021
Sondy z azotku krzemu o stałej sprężystości 0,03 Nm < sup>-1< / sup>.	Bruker	MSCT
Kwas trifluorooctowy do HPLC ,≥ 99,0%	Sigma-Aldrich	302031	Materiał niebezpieczny, należy uważnie przestrzegać MSDS
Acetonitryl, do HPLC ,≥ 99,9%	Sigma-Aldrich	34998
Calcein-AM	Invitrogen	C3100MP
PKH26 Zestaw łącznika komórek czerwonej fluorescencji do ogólnego znakowania błony komórkowej	Zestaw ELISA Sigma-Aldrich	PKH26GL
Rabbit C-Reactive Protein (CRP)	Genway Bio	GWB-9BF960
DMSO, Bioodczynnik, ≥ 99,7%	Sigma-Aldrich	D2650
Equipment
Multimode Nanoscope IV Mikroskop sił atomowych	Bruker
Procise Microsekwencer	Applied Biosystems
Ultima 3000 System HPLC	Dionex
Skaningowy mikroskop elektronowy Hitachi TM 100	Hitachi
Konfokalny skaningowy mikroskop laserowy Zeiss LSM 510	Zeiss
Tabela 1. Lista materiałów i odczynników.