Jednominutowa, sub-jednowatowa fototermiczna ablacja guza przy użyciu porfisomów, wewnętrznych wielofunkcyjnych nanopęcherzyków

Podsumowanie

Opracowaliśmy nowe, wielofunkcyjne nanopęcherzyki zwane porfisomami, które mają zależne od struktury samowygaszanie fluorescencji i unikalne właściwości fototermiczne, dzięki czemu działają jako silne środki terapii fototermicznej. Opracowaliśmy porfisomy za pomocą wytłaczania pod wysokim ciśnieniem i zbadaliśmy ich skuteczność terapii fototermicznej w modelu guza ksenoprzeszczepu.

Streszczenie

Niedawno opracowaliśmy porfisomy jako wewnętrznie wielofunkcyjne nanopęcherzyki. Fotouczulacz, pirofeoforbid α, został sprzężony z fosfolipidem, a następnie samoorganizujący się w liposomowe kuliste pęcherzyki. Ze względu na niezwykle wysoką gęstość porfiryny w dwuwarstwie porfirynowo-lipidowej, porfisomy generowały duże współczynniki ekstynkcji, zależne od struktury samowygaszanie fluorescencji i doskonałą skuteczność fototermiczną. W naszym preparacie porfisomy zostały zsyntetyzowane przy użyciu wytłaczania pod wysokim ciśnieniem i wykazały średnią wielkość cząstek około 120 nm. Dwadzieścia cztery godziny po dożylnym wstrzyknięciu porfisomów, lokalna temperatura guza gwałtownie wzrosła z 30 °C do 62 °C po jednej minucie ekspozycji na 750 mW (1,18 W/cm²), 671 nm naświetlanie laserowe. Po całkowitej ablacji termicznej guza utworzyły się strupy i zagoiły się w ciągu 2 tygodni, podczas gdy w grupach kontrolnych guzy nadal rosły i wszystkie osiągnęły określony punkt końcowy w ciągu 3 tygodni. Dane te pokazują, w jaki sposób porfisomy mogą być stosowane jako silne środki terapii fototermicznej (PTT).

Wprowadzenie

Porfisomy to nowe, wielofunkcyjne nanopęcherzyki, które niedawno opracowaliśmy, zdolne do multimodalnego obrazowania i terapii¹. Są one zbudowane z samoorganizujących się dwuwarstw porfiryny i zawierają niezwykle wysoką gęstość porfiryny (ponad 83 000 cząstek porfizonu), co generuje duży współczynnik ekstynkcji i skutkuje unikalnym, zależnym od struktury samowygaszaniem fluorescencji. Porfisomy mają dobre właściwości farmakokinetyczne i biodystrybucyjne in vivo: wykazują okres półtrwania krwi wynoszący 12 godzin po systematycznym podawaniu i biernie kumulują się w guzach ksenoprzeszczepu z 7,5% ID/g po 24 godzinach po wstrzyknięciu².

Ich unikalna struktura i właściwości fizykochemiczne sprawiają, że porfiom jest dobrym kandydatem do obrazowania multimodalnego i terapii sterowanej obrazem. Przede wszystkim, zawierające porfirynę, porfisomy są wewnętrznie odpowiednie do obrazowania fluorescencyjnego guzów po akumulacji guza¹. Ponadto każda porfiryna ma stabilne miejsce chelatacji izotopów promieniotwórczych, dlatego porfisomy można łatwo znakować radioizotopami, takimi jak 64Cu do obrazowania PET³. Co więcej, pochłonięta energia świetlna jest rozpraszana termicznie pod wpływem naświetlania laserowego, gdy struktura porfisomu jest nienaruszona, dzięki czemu porfisomy wykazują również unikalne możliwości obrazowania fotoakustycznego i PTT. Wykazano, że po 24 godzinach od dożylnego wstrzyknięcia porfisomów, naświetlanie laserowe guza nagromadzonego przez porfisom wywołało gwałtowny wzrost temperatury i silną fototermiczną ablację guza. Wykazano w ten sposób, że porfisomy są skutecznymi wzmacniaczami fototermicznymi o współczynniku ekstynkcji tak wysokim, jak nanocząstki złota (AuNPs)¹. Z drugiej strony, w porównaniu z innymi nieorganicznymi środkami fototermicznymi, w tym AuNPs, porfisomy wykazują wyjątkową przewagę w zakresie bezpieczeństwa biologicznego ze względu na swój organiczny charakter. Porfisomy ulegają biodegradacji enzymatycznej i wywołują minimalną ostrą toksyczność u myszy po podaniu dożylnym w dawkach sięgających 1000 mg/^kg1. Ponadto, podobnie jak w przypadku liposomów, duży wodny rdzeń porfisomów może być biernie lub aktywnie obciążony środkami terapeutycznymi lub obrazującymi. Właściwości optyczne i biokompatybilność porfisomów wskazują na multimodalny potencjał nanocząstek organicznych w obrazowaniu i terapii biofotonicznej.

W tym artykule przedstawiamy metodę syntezy koniugatów pirofeoforbidowo-lipidowych, wytwarzanie i charakteryzację porfisomów za pomocą wytłaczania pod wysokim ciśnieniem. In vivo (in vivo) Przeprowadza się również PTT na myszach w celu wykazania skuteczności PTT z wykorzystaniem porfisomu w leczeniu nowotworów przy użyciu podskórnego modelu guza ksenoprzeszczepu.

Protokół

1. Synteza pirofioforbidu-lipidu

1. Połączyć 200 mmol pyropheoforbidu (przygotowanego z alg Spirulina Pacifica zgodnie z wcześniejszym opisem; Zheng et al., Bioconj. Chem., 2002, 13-392)⁴, 98,7 mg 16:0 lizofosfatydylocholiny (1-palmitylo-2-hydroksy-sn-glycero-3-fosfocholina, Avanti Polar Lipids #855675), 76,3 mg EDC oraz 48,7 mg DMAP (4-(dimetylamino)pirydyny) w 5 ml chloroformu stabilizowanego amylenem, aby uzyskać stosunek 1:1:2:2 Pyro:Lipid:EDC:DMPA.
2. Mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej pod osłoną argonu przez 24 hr. Odparować chloroform pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą rotacyjnego odparowacza w temperaturze 40 °C. W wyniku reakcji powstaje mieszanina izomerów pyro-lipidów (pyro przyłączony w pozycji sn-1 lub sn-2).
3. Resuspendować mieszaninę izomerów pyro-lipidów w 1 mM CaCl₂, 50 mM Tris (pH 8), 0,5% Triton X-100 i 10% metanolu do stężenia 5 mg/ml. Dodać fosfolipazę A2 (PLA2) z jadu pszczeli w stężeniu 0,1 mg/ml i inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez 24 hr w celu strawienia pyro-lipidu w pozycji sn-1 i otrzymania czystego izomeru pyro-lipidu w pozycji sn-2.
4. Dodać dodatkowe 2 objętości chloroformu i 1,25 objętości metanolu, przeprowadzić ekstrakcję, a następnie usunąć rozpuszczalnik za pomocą odparowania rotacyjnego pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40 °C. Resuspendować produkt rozszczepienia w 1% MeOH w DCM i oczyścić na małej kolumnie krzemionkowej z diolem, aby otrzymać izomerycznie czysty pyro-lipid.

2. Przygotowanie porfysomów

1. Rozpuść oddzielnie pyropheoforbid-lipid, distearoylo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminę-N-metoksy (glikol polietylenowy) (PEG-2000-PE) oraz cholesterol w chloroformie i zapisz ich odpowiednie stężenia.
2. Przygotuj film lipidowy porfizomów w borokrzemowej probówce 12x75 mm o całkowitej masie lipidów 5 mg/probówkę, łącząc 65% mol porfiryny-lipidowej, 5% mol PEG-2000-PE i 30% mol cholesterolu.
3. Osusz filmy lipidowe strumieniem gazu azotowego, a następnie pozostaw do dalszego wysuszenia w próżni przez 1 hr. Filmy lipidowe przechowuj w temperaturze -20 °C w atmosferze argonu do czasu późniejszej hydratacji i ekstruzji.
4. Do każdej probówki z filmem lipidowym dodaj 1 ml soli fosforanowej w roztworze buforowanym (PBS, 150 mM NaCl, 10 mM fosforanu, pH 7.4). Zamroź probówkę w ciekłym azocie aż do całkowitego zamrożenia, a następnie rozmroź ją w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C, aż próbka całkowicie się rozpuści. Wymieszaj probówkę w wstrząsarku typu vortex przez łącznie 30 sec (3x po 10 sec, z 5-sekundowym ponownym podgrzaniem w kąpieli wodnej 65 °C pomiędzy każdym cyklem mieszania).
5. Powtórz cykle zamrażania i rozmrażania przez 5 lub więcej cykli, jeśli jest to konieczne, aż w uwodnionym roztworze nie będą widoczne duże agregaty. Po zakończeniu pozostaw zawiesinę porfizomów na lodzie.
6. Złóż ekstruder wysokociśnieniowy (10 ml) z zainstalowanymi dwoma ułożonymi jeden na drugim filtrami z poliwęglanu o rozmiarze 100 nm. Podłącz ekstruder z termobarierą do termostatowanego cyrkulatora z kąpielą wodną o temperaturze 65 °C oraz podłącz system ekstruzji do butli z azotem w celu zapewnienia wysokiego ciśnienia.
7. Przenieś zawiesinę porfizomów do komory ekstrudera za pomocą 9-calowej szklanej pipety transferowej. Ustaw ciśnienie, obracając pokrętłem regulatora butli z azotem, aż odczyt początkowego ciśnienia ekstruzji wyniesie od 200 do 300 psig. Stopniowo otwieraj zawór regulatora ciśnienia, aż zostanie osiągnięta wystarczająca szybkość przepływu porfizomów lub maksymalne ciśnienie 800 psig (5,440 kPa).
8. Po zakończeniu pierwszej przebiegu ekstruzji zamknij zawór sterujący ciśnieniem i zwolnij ciśnienie z ekstrudera, otwierając zawór upustowy na górnej części urządzenia. Ponownie napełnij ekstruder świeżo ekstrudowanym roztworem porfizomów i powtórz proces ekstruzji co najmniej 10 razy, aby zapewnić jednorodność końcowego roztworu.
9. Wyznacz stężenie końcowego roztworu porfizomów, mierząc absorbancję rozcieńczonej próbki w metanolu za pomocą spektrometru UV-Vis. Oblicz stężenie, korzystając z następującego równania, przyjmując współczynnik ekstynkcji 97,000 M^-1cm^-1 przy 410 nm dla pyropheoforbidu-lipidowego.

10. Zmierz końcowy rozkład wielkości porfizomów za pomocą urządzenia Malvern Zetasizer ZS90, wykorzystując dynamiczne rozpraszanie światła. Rozcieńcz roztwór porfizomów w PBS i przeprowadź trzy pomiary, po 15 cykli każdy, aby uzyskać wyniki uśrednione.
11. Wyznacz wygaszanie fluorescencji porfizomów, porównując emisję fluorescencyjną wygaszonych porfizomów (1 mM w PBS) i niewygaszonych porfizomów (1 mM w 1% Triton X-100) za pomocą spektrofluorometru. Zbierz widma przed i po dodaniu detergentu (Triton X-100), a następnie znormalizuj odczyt sygnału do maksymalnej fluorescencji. Ustaw długość fali wzbudzenia na 410 nm, a zakres długości fali emisji na 600-800 nm.
12. Przechowuj roztwór porfizomów pod argonem w temperaturze 4 °C do czasu kolejnego użycia, chroniąc go przed światłem za pomocą folii aluminiowej.

3. Przygotowanie modelu ksenoprzeszczepu zwierzęcego

1. Hodować komórki KB w pośrodku RPMI-1640 (z 10% FBS), utrzymując komórki w atmosferze 5% CO₂ i wysokiej wilgotności w temperaturze 37 °C.
2. Zebrać komórki KB, stosując standardową technikę hodowli komórkowych. Zawiesinę komórkową (20 000 cells/ml) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) przechowywać w lodzie do momentu wstrzyknięcia.
3. Przygotować ksenoprzeszczepy KB u myszy nago. Myszy nago nabyto z Charles River Laboratories w momencie osiągnięcia masy 20 g (Category# Crl:NU(NCr)-Foxn1^nu, wiek 6-7 tygodni), stosując standardową dietę i ściółkę (Harlan Laboratories; Diet: Irradiated LM-485, #7912; Bedding: Corncob bedding, ¼”, #7097). Przed eksperymentami wysterylizować wszystkie narzędzia do obsługi zwierząt (strzykawki, pęsety i podkładki dla zwierząt). Myszy znieczulić 2% izofluranem v/v w nośniku w postaci 100% tlenu. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję ds. opieki i użytkowania zwierząt (w tym przypadku University Health Network).
4. Wstrzyknąć podskórnie komórki nowotworowe zawieszone w PBS w prawy bok myszy. Myszy są gotowe do użycia po 10 dniach, gdy guz osiągnie średnicę 4-5 mm i grubość 2-3 mm.

4. Terapia fototermiczna in vivo

1. Wstrzyknąć porfyzomy (zawierające 750 nmol pyro w objętości 200 µl) dożylnie przez żyłę ogonową. Naświetlanie laserem przeprowadzić 24 h po wstrzyknięciu porfyzomów.
2. W tej sekcji wszystkie procedury należy przeprowadzać w zamkniętym pomieszczeniu bezpiecznym dla pracy z laserem. Podczas naświetlania laserowego należy nosić okulary ochronne do laserów.
3. Przygotować sprzęt do naświetlania laserowego. Włókno laserowe oraz dyfuzor zamocować za pomocą zacisku na statywie. Ustawić niską moc lasera i włączyć urządzenie. Dostosować wysokość włókna laserowego, aby uzyskać obszar naświetlania o średnicy 9 mm (DPSS Laser, LaserGlow Technologies, Toronto, Canada), skalibrować moc lasera do 750 mW (1.18 W/cm²) za pomocą miernika mocy, a następnie wyłączyć laser w celu przygotowania zwierząt.
4. Zanestetyzować zwierzęta, podając 2% izofluranu v/v w 100% tlenie jako gazie nośnym przez stożek nosowy (bez systemu odsysania oparów izofluranu, który stanowi zagrożenie dla zdrowia ludzi). Potwierdzić dostateczną głębokość anestezji, wykonując uciśnięcie palców tylnych łap pęsetą lub palcami. Zwierzęta są gotowe do naświetlania laserem, gdy nie wykazują reakcji na tę procedurę.
5. Monitorować temperaturę guza za pomocą podczerwiennej kamery termowizyjnej (Mikroshot, LUMASENSE Technologies). Umieścić kamerę blisko guza, odpowiednio ją ustawić i wykonać obraz przed PTT, a także zwykły obraz w świetle białym przed rozpoczęciem naświetlania PTT.
6. Ponownie włączyć laser i zwiększyć moc światła do 750 mW. Upozycjonować guz w centrum wiązki lasera tak, aby był w pełni pokryty, a następnie rozpocząć odliczanie czasu naświetlania. Wykonywać obrazy temperatury guza co 5 s podczas jednominutowej terapii laserowej. Wyłączyć laser po 1 min. Przerwać podawanie 2% izofluranu, odczekać do wybudzenia się zwierzęcia z anestezji i umieścić je z powrotem w klatce.
7. Przechowywać myszy w pomieszczeniu z normotermią, w cyklu 12:12 h ciemności i światła, zgodnie z protokołami dotyczącymi zwierząt zatwierdzonymi przez University Health Network. Wstrzyknąć buprenorfinię (0.05 mg/kg, podskórnie dwa razy dziennie przez tydzień po naświetlaniu laserowym), aby zmniejszyć ból spowodowany blizną. Co dwa dni mierzyć średnicę guza za pomocą suwmiarki i wykonać zdjęcie. Obliczyć objętość guza, stosując następujący wzór: V=π/6 · a · b², gdzie a to średnica długa, a b to średnica krótka.
8. Uśmiercić zwierzęta, umieszczając je w komorze z CO₂, gdy długa średnica guza osiągnie 10 mm, co stanowi zdefiniowany punkt końcowy w naszym laboratorium. Po zastosowaniu CO2 wykonać zwichnięcie karku. Wykreślić krzywą przeżywalności.

Wyniki

Pyrofioforbida jest sprzężona z fosfolipidem w formie stabilnego monomeru lipidowego (Rysunek 1a), a koniugaty samoorganizują się w porfizomy metodą ekstruzji błonowej przy użyciu ekstrudera wysokociśnieniowego. Zazwyczaj podczas pierwszych trzech cykli ekstruzji trudno jest przeprowadzić zawiesinę porfizomowo-lipidową ze względu na stosunkowo wolną prędkość przepływu. W miarę powtarzania kolejnych ekstruzji prędkość przepływu ekstrudowanego roztworu stopniowo wzrasta, a ciśnienie można w razie potrzeby ...

Dyskusja

W ramach rozwoju technologii dostarczania leków, wielofunkcyjne nanocząstki są obecnie przedmiotem szeroko zakrojonych badań w celu dokładnego śledzenia pojazdu dostarczającego lek przy jednoczesnym utrzymaniu dużej ładowności leku. Liposomy obciążone porfiryną zostały opracowane w celu uzyskania lepszych właściwości farmakokinetycznych i bardziej wydajnego dostarczania niż bezpośrednie podawanie porfiryny, ale istnieją przeszkody, w tym ograniczona ilość porfiryny i szybka redystrybucja porfiryny z liposomów do białek o...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Parownik obrotowy	Thermo-Savant	SPD131DDA
Votex	Scientific Industries	SI-0236	Numer modelu: G560
Wytłaczarka wysokociśnieniowa	LIPEX, Northern Lipids Inc.	T.001	10 ml Wytłaczarka Thermobarrel
Cyrkulatory z podgrzewaną kąpielą (cyrkulator termostatyczny)	Thermo SCIENTIFIC	SC100-S5P
Filtry poliwęglanowe	Avanti Polar Lipids	610005	Wielkość porów 100 nm i średnica membrany 19 mm
Zetasizer	Malvern Instruments	ZS90
Spektrofototmetr UV/widzialny	Varian Australia	Spektrofotometr Cary 50 Bio UV / widzialnym
		LRS-0671_PFN-02000-05	S/N:10097270
Termometr na podczerwień	Mikroshot, LUMASENSE Technologies	9102409
Laserowe gogle ochronne	LaserGlow Technologies	AGF6602XX	Gęstość optyczna: 1,5+ przy 630-700 nm

Spektrofluorometr HORIBA Scientific FluoroMax-4 Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)Hitachi H-7000 Inkubator kultur komórkowych SANYO MCO-18AIC Miernik mocy Thorlabs PM100D z czujnikiem S142C 671nm Laser LaserGlow Technologies