Synteza, dostarczanie komórkowe i zastosowanie in vivo czujników pH na bazie dendrymerów

Podsumowanie

Czujniki fluorescencji są potężnymi narzędziami w naukach przyrodniczych. W tym miejscu opisujemy metodologię syntezy i wykorzystania czujników fluorescencyjnych na bazie dendrymerów do pomiaru pH w żywych komórkach i in vivo. Rusztowanie dendrytyczne wzmacnia właściwości sprzężonych barwników fluorescencyjnych, co prowadzi do poprawy właściwości wykrywania.

Streszczenie

Rozwój wskaźników fluorescencyjnych stanowił rewolucję w naukach przyrodniczych. Genetycznie kodowane i syntetyczne fluorofory ze zdolnościami detekcji pozwoliły na wizualizację biologicznie istotnych gatunków z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Barwniki syntetyczne cieszą się szczególnym zainteresowaniem ze względu na ich wysoką przestrajalność i szeroką gamę mierzalnych analitów. Cząsteczki te mają jednak kilka ograniczeń związanych z zachowaniem małych cząsteczek (słaba rozpuszczalność, trudności w celowaniu, często brak możliwości obrazowania ratiometrycznego). W niniejszej pracy przedstawiamy rozwój czujników opartych na dendrymerach oraz procedurę pomiaru pH in vitro, w żywych komórkach i in vivo. Wybieramy dendrymery jako idealną platformę dla naszych czujników ze względu na ich wiele pożądanych właściwości (monodyspersyjność, właściwości przestrajalne, wielowartościowość), które sprawiły, że stały się one szeroko stosowanym rusztowaniem dla wielu urządzeń biomedycznych. Sprzężenie fluorescencyjnych wskaźników pH z rusztowaniem dendrymerowym doprowadziło do poprawy ich wydajności wykrywania. W szczególności dendrymery wykazują zmniejszony przeciek komórkowy, lepsze celowanie wewnątrzkomórkowe i umożliwiają pomiary ratiometryczne. Te nowatorskie czujniki zostały z powodzeniem wykorzystane do pomiaru pH w żywych komórkach HeLa oraz in vivo w mózgu myszy.

Wprowadzenie

Użycie cząsteczek fluorescencyjnych do oznaczania specyficznych biologicznie istotnych cząsteczek całkowicie zmieniło sposób, w jaki badamy systemy biologiczne. Mikroskopia szerokopolowa i konfokalna pozwoliły na wizualizację procesów biologicznych w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości i obecnie są jednymi z najpopularniejszych technik badania zdarzeń biologicznych in vitro, w komórkach i in vivo. ¹ Istotną poprawę stanowiło opracowanie wskaźników fluorescencji, czyli barwników, których fluorescencja jest zależna od stężenia określonej jednostki molekularnej. W szczególności wskaźniki pH i wapnia miały ogromny wpływ na badania nad fizjologią komórki ze względu na ogromne znaczenie jonów H⁺ i^Ca2+ w biologii. ^2,3

Jednak większość barwników detekcyjnych ma kilka wewnętrznych ograniczeń związanych z ich zachowaniem małych cząsteczek, takich jak: i) trudności w celowaniu subkomórkowym; ii) słaba rozpuszczalność w wodzie, a w konsekwencji słaba biokompatybilność; oraz iii) nieszczelność komórek, a tym samym brak możliwości obrazowania poklatkowego. ⁴ Co więcej, sygnał wielu sond nie może być skorygowany o zależność od stężenia barwnika (obrazowanie nieratiometryczne), a zatem pomiar bezwzględny w komórkach lub in vivo nie jest możliwy

.

Niedawno opisaliśmy prostą i skuteczną metodologię przezwyciężania tych ograniczeń, opartą na koniugacji barwników wykrywających na rusztowaniu dendrymerowym. ⁵ Dendrymery to monodyspersyjne, hiperrozgałęzione polimery o bardzo atrakcyjnych właściwościach do zastosowań biologicznych. ⁶ W szczególności opracowano kilka architektur dendrytycznych i wykorzystano je do dostarczania leku⁷ i genów. ⁸ Dopiero niedawno kilka grup zaczęło badać potencjał tych cząsteczek jako rusztowania dla urządzeń czujnikowych. ^9,10,11

Poprzednio opisaliśmy łatwą drogę syntezy do funkcjonalizacji różnych rusztowań poliamidoaminowych (PAMAM) opartych na estrach aktywowanych przez NHS. ¹² Koniugaty można otrzymać w jednym etapie za pomocą dializy tylko jako oczyszczanie. Co ciekawe, podejście to można z łatwością zastosować do różnych rusztowań dendrytycznych lub polimerowych. ^{Pytania z kategorii 13,14}

Aby osiągnąć obrazowanie ratiometryczne, dendrymery zostały podwójnie znakowane dwoma zestawami barwników: i) wskaźnikiem pH (tj. fluoresceiną) i ii) niezależnym od pH ugrupowaniem fluorescencyjnym (np. rodaminą). Pozwoliło nam to na dokładne obrazowanie pH, ponieważ stosunek między fluoresceiną a rodaminą zależy tylko od pH, a nie od stężenia sondy. Innym ciekawym podejściem do tego zagadnienia jest zastosowanie sond opartych na żywotności. ¹⁵ Ponieważ czas życia nie zależy od stężenia sondy, pomiary te nie wymagają korekty ratiometrycznej. Jednak pomiary czasu życia wymagają bardziej skomplikowanej konfiguracji instrumentalnej, a ich rozdzielczość czasowa nie jest optymalna dla szybkich procesów fizjologicznych, co ogranicza ich potencjalne zastosowania.

Aby wykonać obrazowanie wewnątrzkomórkowe, sonda musi zostać dostarczona przez błonę plazmatyczną do cytozolu. Ponieważ dendrymery nie są przepuszczalne dla błony ze względu na ich rozmiar i hydrofilowość, dostarczanie wewnątrzkomórkowe można osiągnąć poprzez elektroporację. Dzięki tej technice, szeroko stosowanej w biologii do transfekcji, znakowane makrocząsteczki mogą być skutecznie dostarczane do komórek w celu wykonania wysokiej jakości obrazowania. Co więcej, dzięki elektroporacji można uniknąć powikłań związanych z endocytozą dendrymerów, ponieważ makrocząsteczki są bezpośrednio dostarczane do cytoplazmy. Co ciekawe, po elektroporacji różne dendrymery wykazują wyraźne lokalizacje wewnątrz komórek, nawet przy braku określonej sekwencji docelowej. ⁵ To pasywne ukierunkowanie, tylko ze względu na właściwości fizykochemiczne dendrymeru, może być wykorzystane do uzyskania obrazowania pH specyficznego dla organelli.

Obrazowanie ratiometryczne można wykonać za pomocą mikroskopii konfokalnej. Fluoresceina i rodamina, kowalencyjnie sprzężone z rusztowaniem dendrytycznym, zostały oddzielnie zobrazowane i stworzono mapę proporcji piksel po pikselu. Opisano kilka procedur kontroli wewnątrzkomórkowego pH w żywych komórkach za pomocą jonoforów. Jonowory to małe hydrofobowe cząsteczki zdolne do transportu jonów przez błonę plazmatyczną; Dostępne są jonofory jonów H⁺, takie jak nigerycyna, które mogą być używane do kalibracji czujników opartych na dendrymerach. ¹⁶ Pomiary te wykazały liniową reakcję na pH podobną do tej, którą zaobserwowano in vitro. Na podstawie kalibracji można było dokładnie zmierzyć wewnątrzkomórkowe pH. Pomiary te wykazały, że czujnik oparty na dendrymerach może być cennym narzędziem w badaniu homeostazy H⁺ w żywych komórkach i procesach patologicznych, które obejmują nieprawidłowe działanie regulacji pH.

Niedawno pokazaliśmy, że czujniki pH oparte na dendrymerach mogą być również stosowane in vivo, wykonując obrazowanie pH w mózgu znieczulonych myszy. ¹⁷ Ze względu na złożone środowisko, w którym żyją tkanki, wysoka jakość wykrywania in vivo jest wyzwaniem technicznym. Poniżej przedstawiamy szczegółowy opis procedury eksperymentalnej do obrazowania pH in vivo z naciskiem na kluczowe kwestie, które należy rozwiązać, aby wykonać dokładne obrazowanie pH w mózgu. Mikroskopia dwufotonowa została zastosowana z dwóch głównych powodów: i) zastosowanie światła podczerwonego pozwala przezwyciężyć brak penetracji tkanek w standardowej mikroskopii konfokalnej; ii) szeroka absorpcja dwufotonowa fluoresceiny i rodaminy pozwala na ich jednoczesne wzbudzenie, unikając komplikacji związanych z użyciem dwóch długości fal do wzbudzenia. Pomyślnie przeprowadzono pomiary pH w mózgu myszy; Czujniki łatwo reagują na niedotlenienie, indukując zmianę pH w przestrzeni pozakomórkowej mózgu. Pomiary te pokazują, że wskaźniki oparte na dendrymerach mogą być z powodzeniem wykorzystywane do podkreślania fizjologicznych i patologicznych zmian pH in vivo w modelu zwierzęcym.

Protokół

1. Synteza czujników

1. W poniższej sekcji przedstawiamy procedurę koniugacji wskaźników pH z dendrymerami PAMAM. Ten sam protokół można zastosować przy minimalnej modyfikacji do alternatywnych dendrymerów zawierających aminy. ^5,17,13,14 Dostępne w handlu dendrymery i barwniki mogą być używane bez dalszego oczyszczania.
2. Rozpuścić dendrymer w bezwodnym DMSO (stężenie końcowe 50 μM). Przygotować 10 mM roztwory podstawowe fluoresceiny-NHS i tetrametylo-rodaminy-NHS (TMR) w bezwodnym DMSO.
3. Dodać do roztworu dendrymera żądaną ilość fluoresceiny i TMR. Stosunek molowy w mieszaninie będzie odzwierciedlał ilość barwników załadowanych na dendrymer. Zazwyczaj 1 ml roztworu dendrymeru G4 PAMAM w probówce do mikrowirówki poddaje się reakcji z 8 eq (40 μl) fluoresceiny i 8 eq (40 μl) TMR. Mieszaj roztwór w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.
4. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 wodą dejonizowaną i załadować mieszaninę reakcyjną do worka do dializy (MWCO = 10 kDa). Dializuj przez 24 godziny przed wodą dejonizowaną, często wymieniając wodę w zbiorniku.
5. Przenieść roztwór do fiolki i liofilizować przez 24 godziny. Należy uzyskać fioletowy proszek. Odważyć otrzymaną substancję stałą i rozpuścić ją w wodzie miliQ o końcowym stężeniu 10 μM. Podwielokrotność roztworu i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Pomiary pH in vitro

1. Do kalibracji in vitro przygotować roztwór 500 nM dendrymeru w PBS (2 mM fosforan) w kuwecie kwarcowej. Zaleca się stosowanie bardzo rozcieńczonego buforu PBS (2 mM) w celu uniknięcia nagłych zmian pH podczas miareczkowania.
2. Zmierz widma emisyjne fluoresceiny (exc 488 nm) i TMR (exc 550 nm) i zoptymalizuj ustawienia optyczne fluorymetru, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu.
3. Przeprowadzić miareczkowanie pH, dodając małe objętości NaOH 0,1 N i HCl 0,1 N. Po każdym dodaniu wstrząsnąć kuwetą w celu wymieszania, odczekać 1 minutę do wyrównania i zmierzyć pH za pomocą mikroelektrody pH. Widma emisyjne fluoresceiny i TMR powinny być rejestrowane dla każdego kroku bez żadnych zmian w ustawieniach optycznych.
4. Wykreślić intensywność fluorescencji w funkcji pH dla miareczkowania. pH (<10%) nie powinno mieć wpływu na sygnał rodaminy. Sygnał fluoresceiny powinien być krzywą sigmoidalną i powinien być wyposażony w model pojedynczego wiązania o pK = 6,4.

3. Hodowla komórkowa i elektroporacja

1. Hoduj komórki HeLa w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 100 U/ml penicyliny oraz 100 mg/ml streptomycyny (Invitrogen). Hodowlę komórkową należy utrzymywać w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5%_CO2
.
2. W przypadku elektroporacji dendrymerów, gdy komórki są zlewane, usuń pożywkę i umyj komórki za pomocą DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline). Usuń DPBS i dodaj trypsynę-EDTA. Zneutralizuj trypsynę, dodając pożywkę zawierającą surowicę, ale nie antybiotyki. Wirować przy 900-1 200 obr./min przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Usuń pożywkę i opłucz granulki za pomocą DPBS.
3. Policz komórki i weź 4 * 10⁶ komórek. Wirować z prędkością 1 200-1 500 obr./min przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
4. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu do mikroporacji (dostarczonego przez producenta mikroporatora) i przenieść komórki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
5. Dodać wodny roztwór dendrymeru do zawieszonych komórek. Wymagana ilość dendrymeru na próbkę zależy od typu PAMAM (zwykle 250 nM dla dendrymerów kationowych i 2 μM dla dendrymerów obojętnych).
6. Dodaj bufor do elektroporacji (dostarczony przez producenta mikroporatora) do probówki do mikroporacji. Odpipetować mieszaniny komórek i dendrymerów końcówką do elektroporacji o objętości 100 μl. Włóż pipetę mikroporatora do stacji pipetowej. Ustaw warunek impulsu dla mikroporacji: napięcie impulsu = 1,005 V; szerokość impulsu = 35 ms; liczba impulsów = 2.
7. Po impulsie przenieś komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwiruj komórki przez 5 minut przy 1 200 obr./min, aby usunąć nadmiar dendrymeru z pożywki. Płytka 10 μl elektroporowanych ogniw na 35-milimetrowe szalki ze szklanym dnem (WillCo-dish GWSt-3522) ze świeżą pożywką bez antybiotyków.

4. Pomiar pH w żywych komórkach HeLa

1. Obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego 12 godzin po elektroporacji.
2. Można zastosować standardowy zestaw filtrów do fluoresceiny i rodaminy. Jeśli dostępne są filtry przestrajalne, ustaw kanał zielony od 500 do 550 nm i kanał czerwony od 580 nm do 650 nm. Wzbudzenie przy 488 nm jest optymalne dla fluoresceiny, podczas gdy rodamina może być obrazowana za pomocą linii laserowej 543 nm lub 561.
3. Skoncentruj się na próbce i dostosuj moc lasera oraz wzmocnienie detektorów, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu. Jeśli elektroporacja się powiodła, ogniwa powinny być jasno fluorescencyjne w obu kanałach. Lokalizacja zależy od wielkości i ładunku użytego dendrymeru. Często występuje pewna lokalizacja lizosomalna (małe pęcherzyki okołojądrowe) z powodu endocytozy lub kompartmentalizacji. Jeśli lokalizacja lizosomalna jest dominująca, tj. większość fluorescencji jest zlokalizowana wewnątrz pęcherzyków, a w cytozolu obserwuje się słaby sygnał, oznacza to toksyczność i pomiar należy odrzucić. Rejestruj kolejno dwa kanały, w razie potrzeby ubierz kilka obrazów i uśredniaj obrazy, aby poprawić jakość obrazu.
4. Do kalibracji clamp pH komórki za pomocą z jonoforami o różnym pH i uzyskać co najmniej 20 komórek na pH, jak opisano powyżej. Szczegółowy opis procedury i składu można znaleźć na stronie Bizzarri and Coworkers. ¹⁶ Sugerujemy zmierzenie co najmniej 5 punktów od pH = 5,5 do pH = 7,5. pH poniżej 6 są toksyczne dla komórek, ale tolerowane przez krótki czas, sugerujemy jak najszybsze uzyskanie obrazów. Jeśli komórki wykazują oznaki apoptozy, wyrzuć komórki i uruchom ponownie.
5. Użyj ImageJ lub analogicznego oprogramowania do analizy danych. Zaimportuj obrazy kanału zielonego i czerwonego, odejmij tło i utwórz obrazowanie proporcji piksel po pikselu za pomocą narzędzia "Kalkulator obrazu".
6. Narysuj obszar zainteresowania (ROI), wybierając żądaną komórkę i zmierz wewnątrzkomórkowy stosunek zieleni do czerwieni. Przeanalizuj wszystkie uzyskane obrazy, a następnie wykreśl stosunek w stosunku do pH. W przedziale od 5,5 do 7,5 trend powinien być liniowy. Dopasowanie liniowe uzyskanych punktów da krzywą kalibracyjną, która zostanie użyta do przeliczenia stosunku zieleni do czerwieni na pH.
7. W ramach dalszej kontroli należy pobrać kilka nieleczonych komórek (bez jonoforów) i spróbować obliczyć pH z uzyskaną krzywą kalibracyjną. Należy uzyskać wartość z przedziału od 7,2 do 7,4.

5. Przygotowanie próbki in vivo

1. Eksperymenty przeprowadzono na C57Bl/6J (mężczyźni i kobiety) między 28. a 70. dniem po urodzeniu. Znieczulenie myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia uretanu (tj. karbaminianu etylu) (20% w/v w soli fizjologicznej, 20 mg/kg uretanu). Zwierzęta zostały uśmiercone po eksperymencie z przedawkowaniem uretanu, a następnie wstrzyknięciem dosercowym tego samego środka znieczulającego.
2. Wykonać domięśniowe wstrzyknięcie deksametazonu fosforanu sodu (2 mg/kg masy ciała) w celu zmniejszenia reakcji kory mózgowej na stres i obrzęku mózgu podczas operacji.
3. Ogol głowę zwierzęcia i nałóż 2,5% żelu lidokainowego na skórę głowy.
4. Użyj nożyczek, aby przeciąć płat skóry pokrywający czaszkę obu półkul
5. Umyj odsłoniętą kość solą fizjologiczną i delikatnie usuń okostną za pomocą kleszczy. Zapewni to lepszą bazę dla kleju i cementu dentystycznego, z którymi będzie można przylegać.
6. Nałożyć wykonany na zamówienie stalowy słupek głowy z centralną komorą obrazowania i przykleić go cyjanoakrylanem w płaszczyźnie mniej więcej równoległej do czaszki nad obszarem kory mózgowej będącym przedmiotem zainteresowania i przymocować go na miejscu za pomocą białego cementu dentystycznego (Paladur).
7. Zamocuj głowę myszy, aby wykonać kraniotomię o średnicy 2-3 mm nawierconą w obszarze zainteresowania.
8. Staraj się zminimalizować nagrzewanie się kory podczas operacji, rozdarcia opony twardej lub krwawienia.
9. Utrzymuj korę mózgową w stanie przekrwionym sterylnym ACSF (126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,3 mM MgSO₄, 26 mM NaHCO₃, 2,4 mM CaCl₂, 15 mM glukozy, 1,2 mM HEPES w destylowanym_H2O, pH = 7,4).

6. Obrazowanie pH w mózgu myszy

1. Podczas eksperymentu wspomaganie oddychania zwierząt zapewnia powietrze wzbogacone w_O2. Tlen jest wzbogacony do 80%. O₂ ciśnienie parcjalne i przepływ są często regulowane w celu uzyskania odpowiedniego wspomagania oddychania. Utrzymuj stałą temperaturę ciała na poziomie 37 °C za pomocą koca grzewczego sterowanego sprzężeniem zwrotnym.
2. Zamocuj zwierzę przez stalowy słupek pod obiektywem zestawu do obrazowania dwufotonowego.
3. W celu wstrzyknięcia czujnika do kory mózgowej należy załadować szklaną pipetę zawierającą elektrodę AgCl (średnica końcówki 4 mm) roztworem dendrymeru (1 μM). Elektroda pozwoli na rejestrację potencjałów pola zewnątrzkomórkowego.
4. W przypadku zestawu do mikroiniekcji należy wprowadzić pipetę do kory mózgowej na głębokości około 150 μm. Wstrzykiwać przez 1-2 minuty pod ciśnieniem 0,5 psi.
5. Zoptymalizuj konfigurację optyczną pod kątem obrazowania. Moc lasera należy dostosować, aby zminimalizować fotowybielanie i fotouszkodzenia. Zazwyczaj moc lasera wynosi około 20 mW, a wzmocnienie PMT było utrzymywane na stałym poziomie 667 V, ponieważ poprzednie kalibracje wykazały, że napięcie to daje najlepszy stosunek sygnału do szumu.
6. W celu obrazowania wzbudzić czujnik przy długości fali 820 nm i jednocześnie wykryć fluoresceinę i fluorescencję rodaminy przez standardowe filtry FITC i TRITC.
7. Dla pomiarów czasowo-rozdzielczych należy uzyskać serie poklatkowe przy 2 Hz.
8. Do korekcji tła zaopatrz się w ciemną ramkę z zamkniętą migawką laserową, aby zmierzyć średni szum termiczny powstający w PMT i cokole zwykle dodawanym przez elektronikę.
9. W przypadku analizy danych należy postępować zgodnie z tą samą procedurą, co opisano w sekcji 4.

Wyniki

Rysunek 1 pokazuje schematyczne przedstawienie koniugacji barwników wykrywających z różnymi rusztowaniami dendrytycznymi. Uzyskane wskaźniki można uzyskać w jednym łatwym kroku syntezy z dostępnych na rynku produktów. Dendrymery zawierające aminy są poddawane reakcji z barwnikami aktywowanymi przez NHS w DMSO i oczyszczane przez dializę. Ta ogólna procedura została już z powodzeniem zastosowana do etykietowania kilku dendrymerów: i) dendrymerów PAMAM generacji 2, 4 i 6; ¹² pegylowanych dendrym...

Dyskusja

Kluczowymi etapami udanego obrazowania pH za pomocą czujników opartych na dendrymerach są: i) wybór właściwego rusztowania dendrytycznego i liczby wskaźników do niego sprzężonych oraz ii) optymalizacja protokołu dostarczania czujników w komórkach lub in vivo.

Procedura syntezy jest dość łatwa i może być stosowana praktycznie do każdego hiperrozgałęzionego polimeru zawierającego aminy. Czujniki można uzyskać z dostępnych na rynku dendrymerów i barwników aktywowanych przez NHS w jednym ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Karboksyfluoresceina NHS ester	Technologie życia	C-1311
TMR NHS ester	Technologie życia	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Worki Dyalsis	Spectrum Labs	132117
WillCo Naczynia	WillCo Wells	GWSt-3512
Uretanowy	Sigma-Aldrich	U2500