Poprawa wskaźnika sukcesu krystalizacji białek poprzez losowe badania przesiewowe matrycy mikronasion

Podsumowanie

Tutaj opisujemy ogólną metodę losowego przesiewania matryc mikronasion. Wykazano, że technika ta znacznie zwiększa wskaźnik sukcesu eksperymentów przesiewowych krystalizacji białek, zmniejsza potrzebę optymalizacji i zapewnia niezawodne dostarczanie kryształów do zbierania danych i eksperymentów z moczeniem ligandów.

Streszczenie

Losowe przesiewanie matryc mikronasion (rMMS) to technika krystalizacji białek, w której kryształy zarodkowe są dodawane do losowych ekranów. Zwiększając prawdopodobieństwo, że kryształy będą rosły w strefie metastabilnej diagramu fazowego białka, często uzyskuje się dodatkowe przewody krystalizacyjne, można zwiększyć jakość wytwarzanych kryształów i zapewnić dobry zapas kryształów do zbierania danych i eksperymentów z moczeniem. W tym miejscu opisujemy ogólną metodę dla rMMS, która może być stosowana do eksperymentów z dyfuzją pary w pozycji siedzącej lub wiszącej, ustalonych ręcznie lub przy użyciu robotyki do obsługi cieczy, w formacie tacki 96-dołkowej lub 24-dołkowej.

Wprowadzenie

Od jej początkowego zastosowania przez Perutza, Kendrew i współpracowników do określania struktur hemoglobiny i mioglobiny, do nowoczesnych, wysokowydajnych zautomatyzowanych potoków konsorcjów genomiki strukturalnej, makromolekularna krystalografia rentgenowska dała nam bezprecedensowy strukturalny wgląd w świat białek. Technika ta pozostaje najszerzej stosowaną metodą eksperymentalną, która pozwala na bezpośrednią wizualizację struktury białka w rozdzielczości atomowej lub bliskiej atomowej (tj. w zakresie 1-3 A). Warunkiem wstępnym zastosowania dyfrakcji rentgenowskiej do białka jest to, że najpierw musi ono zostać skrystalizowane i to właśnie ten etap procesu pozostaje największym pojedynczym krokiem ograniczającym szybkość w określaniu struktury metodami dyfrakcyjnymi ^{1, 2}. Pomimo znacznego postępu w naszym zrozumieniu procesu krystalizacji białek oraz znacznej poprawy jakości i dostępności ekranów krystalizacji, tacek i powiązanych technologii, nadal niemożliwe jest wiarygodne przewidzenie prawdopodobieństwa powodzenia krystalizacji ³. Metody biochemiczne i biofizyczne można zastosować do oceny, czy białko będące przedmiotem zainteresowania wykazuje korzystne cechy dla zarodkowania i wzrostu kryształów, tj. czy jest dobrze pofałdowane, jednorodne, monodyspersyjne itp., jednak te spostrzeżenia w żaden sposób nie zapewniają ostatecznego predyktora skłonności do krystalizacji.

Seeding od dawna uważany jest za realną metodę poprawy liczby, rozmiaru i jakości istniejących kryształów lub materiału krystalicznego ^4-7. Podejście to opiera się na założeniu, że warunek, który wspiera zarodkowanie kryształów, może nie być optymalny dla późniejszego wzrostu kryształów i odwrotnie. Przenosząc materiał jądrzasty z jednego stanu do drugiego, można próbować skutecznie rozdzielić te procesy, dając w ten sposób dostęp do nowej, jeszcze niezbadanej przestrzeni krystalizacji, a w rezultacie zwiększając ogólny wskaźnik sukcesu eksperymentu przesiewowego. Udokumentowano ustalone metody (i) makrorozsiewu, czyli przeniesienia pojedynczego kryształu w całości z jednego stanu do drugiego ⁸, (ii) zasiewu smugowego, czyli przenoszenia materiału jądrzastego, zwykle uzyskiwanego przez zastosowanie ciśnienia kierunkowego przy użyciu na przykład kociego wąsa na powierzchnię istniejącego kryształu, po którym następuje przejście wiskera przez nową kroplę krystalizacji ⁹oraz (iii) "klasyczne" mikrosiewanie, czyli przenoszenie kryształowych "nasion", powstałych w wyniku zbierania pokruszonych kryształów (lub materiału krystalicznego), do warunków podobnych do tych, w których powstały nasiona ¹⁰. Warto zauważyć, że wszystkie te trzy metody są czasochłonne i słabo skalowalne, z pewnością w porównaniu z tym, co można osiągnąć za pomocą nowoczesnej robotyki krystalizacyjnej zajmującej się obsługą cieczy. Czynniki te przyczyniły się, przynajmniej na pewnym poziomie, do przekonania, że wysiew jest metodą, którą należy stosować tylko wtedy, gdy inne podejścia nie przyniosły rezultatów.

Random Matrix Microseeding (rMMS) to najnowsza innowacja metodologiczna, która łączy zalety tradycyjnego mikrosiewu z korzyściami płynącymi z wysokiej przepustowości i skalowalności ^11-13. Podejście to opiera się na wytwarzaniu materiału siewnego, wyprodukowanego z jądrzastego materiału krystalicznego, który może być porcjowany do / na każdym basenie / szkiełku nakrywkowym w standardowym 96-stanowym sicie krystalizacji. Metoda ta ma zastosowanie zarówno do eksperymentów z dyfuzją kropli pary w pozycji siedzącej, jak i wiszącej, przeprowadzanych ręcznie lub przy użyciu robotyki do obsługi cieczy, w formacie tacy 24-dołkowej lub 96-dołkowej. Eksperymentalnie wykazano, że rMMS znacznie zwiększa wskaźnik powodzenia krystalizacji i wytwarza kryształy o większej jakości i ilości ^{dyfrakcyjnej 11, 13, 14} i stanowi innowacyjne narzędzie w arsenale podejść krystalografów w trwających wysiłkach na rzecz sukcesu krystalizacji. W tym miejscu opisujemy ogólną metodę dla rMMS i podajemy przykładowe dane ilustrujące skuteczność tej techniki.

Protokół

1. Rozważania strategiczne

1. Wybór kryształów zarodkowych używanych do eksperymentów z mikrosiewem będzie się różnił w zależności od celu eksperymentu. Na początku projektu pomocne jest znalezienie kilku trafień krystalizacji, które mogą stanowić alternatywne punkty wyjścia do optymalizacji kryształów. rMMS znacznie zmniejsza potrzebę optymalizacji kryształów, ponieważ dobrej jakości kryształy z większym prawdopodobieństwem rosną w strefie metastabilnej diagramu fazowego, tj. w obszarze, w którym po zakłóceniu lub zarodkowaniu system powraca do równowagi. Dlatego sugerujemy rutynowe stosowanie rMMS, gdy tylko uzyskane zostaną pierwsze kryształy (lub, dokładniej, gdy tylko pierwsze kryształy przestaną rosnąć).
2. W początkowej rundzie rMMS materiał siewny powinien być wykonany z jak największej ilości materiału krystalicznego. Jeśli dostępny jest tylko jeden dołek, który zawiera kryształy lub jeśli kryształy są małe, pomocne może być ustawienie wielu powtórzeń oryginalnego uderzenia (bez rozsiewania), aby zwiększyć podaż kryształów. Jeśli jednak uzyska się kilka różnych trafień, kryształy zarodkowe można zebrać z kilku warunków i zmieszać ze sobą.
3. Aby uniknąć separacji faz, kryształy hodowane w warunkach wysokiej zawartości soli powinny być zbierane oddzielnie od kryształów hodowanych w warunkach wysokiego PEG. Jeśli kryształy z kilku studzienek zostaną zmieszane, do zawiesiny nasion należy wybrać roztwór zbiornikowy, w którym jest mniej prawdopodobne, że da kryształy soli. Na przykład należy unikać wysokich stężeń fosforanów, siarczanów, wapnia i magnezu.
4. W dalszej części projektu ważne może być poszukiwanie kryształów z różnymi komórkami elementarnymi w celu poprawy dyfrakcji, uniknięcia bliźniaczych kryształów i uzyskania kryształów, które są odpowiednie do wiązania ligandów. Na tym etapie do produkcji materiału siewnego należy używać tylko najbardziej odpowiednich kryształów (np. tych, które najlepiej ulegają dyfrakcji). Czasami wymagane są powtarzające się rundy mikrosiewu, w których tylko "najlepsze" kryształy są używane do produkcji materiału siewnego na kolejną rundę. Jeśli to możliwe, należy użyć "neutralnego" środka strącającego, takiego jak PEG 3000, do zawieszenia kryształów zarodkowych w celu zachęcenia do nowych kontaktów kryształów i krystalizacji kompleksów, które mogą być niestabilne w roztworach o wysokiej zawartości ^{soli 12}.
5. Klasyczne eksperymenty z mikrosiewem, w których stosuje się warunek pojedynczej krystalizacji, są często pomocne po zidentyfikowaniu obiecującego warunku i podczas późniejszej optymalizacji. Często konieczne jest rozcieńczenie materiału siewnego, aby uzyskać pożądaną liczbę kryształów na kroplę. "Kombinatoryczny" eksperyment z mikrosiewem (w którym do stanu krystalizacji dodaje się serię nasion o rosnącym rozcieńczeniu) jest szybką metodą znalezienia optymalnego rozcieńczenia materiału siewnego. To podejście zostało opisane poniżej.

2. Przygotowanie materiału siewnego

1. Wykonaj zaokrągloną szklaną sondę ze szklanej pipety Pasteura za pomocą płomienia Bunsena.
   1. Podgrzej pipetę w pobliżu środka, aż stanie się miękka, a następnie szybko zdejmij ją z płomienia i wyciągnij, rozsuwając końce. Staraj się ściągnąć szkło do średnicy poniżej 0.25 mm.
   2. Rozbij szklankę w miejscu, w którym znajduje się na około 0,25 mm i na krótko zanurz pęknięty koniec w płomieniu. Powtarzaj to, aż na końcu utworzy się półkula szkła o średnicy ~0,75 mm. Sonda ta jest przydatna do kruszenia materiału krystalicznego, ponieważ jest odpowiednio dobrana do uderzania w ciała stałe w skali 0,01-1,0 mm i nie uszkadza plastikowej powierzchni tacki krystalizacyjnej, sub-studzienki lub szkiełka nakrywkowego. Większe sondy (~1,0 mm) mogą skuteczniej kruszyć małe kryształy, ponieważ kryształy są uwięzione między szkłem a plastikiem.
2. Umieść na lodzie probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającą koralik nasienny.
3. Sprawdzić wstępnie ustaloną tacę krystaliczną za pomocą mikroskopu dwuokularowego lub systemu obrazowania kryształów i wybrać z tacy jeden lub więcej odpowiednich dołków, z których chcesz zebrać materiał krystaliczny do wytworzenia materiału siewnego. Można użyć dowolnego materiału, w tym cienkich igieł, sferulitów, mikrokryształów i nieregularnych, słabo uformowanych kryształów. Materiał siewny powinien być wykonany jak najszybciej po tym, jak kryształy przestaną rosnąć, ponieważ istnieje większe prawdopodobieństwo, że starszy materiał zostanie częściowo usieciowany, co zmniejszy jego przydatność do wykorzystania w doświadczeniach z wysiewem. Jeżeli istnieją jakiekolwiek wątpliwości co do tego, czy materiał krystaliczny, który ma zostać zebrany, jest solą czy białkiem, studzienka może być uwidoczniona za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego UV lub systemu obrazowania przed otwarciem, lub materiał krystaliczny można poddać analizie dyfrakcji rentgenowskiej in situ na tacy. Przy użyciu pierwszego podejścia kryształy białek będą fluoryzować pod wpływem promieniowania UV, kryształy soli będą wydawać się bezbarwne.
4. Otwórz dobrze wybraną tacę krystalizacyjną. W przypadku 96-dołkowych tacek wrzutowych należy przeciąć górny plastikowy arkusz uszczelniający wokół wybranej studzienki za pomocą ostrza skalpela. W przypadku 24-dołkowych wiszących tac wrzutowych usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą pęsety. Odwróć szkiełko nakrywkowe i umieść je na stabilnej, czystej powierzchni. Usunąć 50 μl roztworu zbiornika i przenieść ten płyn do probówki mikrowirówki zawierającej kulkę nasienną, upewniając się, że probówka pozostaje na lodzie przez cały czas.
5. Dokładnie rozdrobnić kryształy w kroplach z dołka (taca 96-dołkowa) lub szkiełka nakrywkowego (taca 24-dołkowa), używając szklanej sondy przygotowanej w sekcji 2.1, oglądając wyniki pod mikroskopem. Dokładne zmiażdżenie małych kryształów może zająć kilka minut. Ten krok pozwala eksperymentatorowi sprawdzić, czy kryształy są łatwe do zgniecenia i dlatego nie są usieciowane, a także, czy nie są kryształami soli. Kryształy soli wytwarzają charakterystyczne kliknięcie, które można usłyszeć i poczuć, gdy są zgniatane. Jeśli kryształy są twarde i trudne do zmiażdżenia, spróbuj uzyskać i użyć świeższego materiału.
6. Usunąć 5 μl roztworu zbiornika z probówki z kulkami nasiennymi i przenieść do równoważnej studzienki cząstkowej (doświadczenie z kroplą siedzącą) lub szkiełka nakrywkowego (doświadczenie z kroplą wiszącą) zawierającego materiał krystaliczny, który ma być zebrany. Odpipetuj ten płyn w górę i w dół 5-6 razy, aby ponownie zawiesić jak najwięcej zawartości sub-studzienki lub szkiełka nakrywkowego. Umieść zawiesinę z powrotem w probówce z kulką nasienną i powtórz ten krok jeszcze dwa razy, upewniając się, że zebrano jak najwięcej materiału krystalicznego.
7. Obracaj kulkę nasienną przez dwie minuty, zatrzymując się co 30 sekund, aby schłodzić rurkę na lodzie.
8. Wykonać serię rozcieńczeń, rozcieńczając materiał siewny w roztworze zbiornikowym przez współczynnik od 4 do 10 na każdym etapie. Zazwyczaj przy użyciu nierozcieńczonego materiału siewnego uzyskuje się zbyt wiele kryształów, więc użyj rozcieńczonych zapasów nasion, aby kontrolować liczbę kryształów w studzience. W pierwszej rundzie rMMS ważne jest, aby nie rozcieńczać roztworu podstawowego nasion, ponieważ im większe stężenie nasion, tym więcej uderzeń krystalizacji zostanie uzyskane.
9. Jeżeli nie ma być natychmiast zużyty, przenieść zawiesinę materiału siewnego i rozcieńczony materiał siewny do zamrażarki w temperaturze -20 °C lub -80 °C w celu przechowywania. Aby zapobiec powtarzającym się cyklom zamrażania i rozmrażania, które mogą zmniejszyć skuteczność materiału siewnego, należy przechowywać ten materiał w porcjach o małej objętości, tj. 10-20 μl. Po zamrożeniu zapasy nasion mogą być przechowywane przez czas nieokreślony, aż będą potrzebne.

3. Założenie tac krystalizacyjnych

1. W zależności od dostępności urządzeń do krystalizacji i preferencji eksperymentatora, badanie przesiewowe krystalizacji rMMS można przeprowadzić przy użyciu 24-dołkowych tac wykorzystujących metodę dyfuzji pary z wiszącą kroplą lub 96-dołkowych tac wykorzystujących metodę dyfuzji pary z siedzącą kroplą. Tace krystalizacyjne dla rMMS można ustawiać ręcznie, za pomocą automatycznego dozownika do obsługi cieczy lub za pomocą kombinacji tych dwóch.
2. Typowy eksperyment rMMS przeprowadzany ręcznie składa się z 1,0 μl roztworu białka, 1,0 μl warunku krystalizacji i 0,5 μl materiału siewnego. Typowy eksperyment przeprowadzany przy użyciu robota krystalizacyjnego składa się z 0,3 μl roztworu białkowego, 0,2 μl warunku krystalizacji i 0,1 μl materiału siewnego.
3. Aby przeprowadzić badanie przesiewowe rMMS w 24-dołkowych wiszących tacach wrzutowych, najpierw, za pomocą pipety ręcznej, przenieś 300 μl każdego warunku z 96-dołkowego sita krystalizacyjnego w formacie 10 ml z pojedynczą probówką do każdej studzienki 4 x 24-dołkowych, wstępnie natłuszczonych tacek krystalizacyjnych.
   1. Przenieść 1 μl każdego warunku krystalizacji z każdego zbiornika o objętości 300 μl na powierzchnię odpowiedniego szkiełka nakrywkowego z tworzywa sztucznego, z którego usunięto zarówno przednie, jak i tylne ochronne paski nośne.
   2. Do 1 μl każdego warunku krystalizacji dodać 1 μl roztworu białkowego, a następnie 0,5 μl krystalicznego materiału siewnego. Odwrócić każde szkiełko nakrywkowe w taki sposób, aby kropla płynu była skierowana w dół i umieścić powyżej odpowiedniego dołka.
   3. Dociśnij szkiełko nakrywkowe w dół, ściskając smar uszczelniający i tworząc bezpieczne uszczelnienie. Po ustaleniu wszystkich 96 kropli tackę należy przenieść do inkubatora lub pomieszczenia o stałej temperaturze, zwykle w zakresie 4-18 °C w celu przechowywania.
4. Aby przeprowadzić badanie przesiewowe rMMS w 96-dołkowych tacach do osadzania, najpierw przenieś 20-50 μl każdego stanu z 96-dołkowego sita krystalizacyjnego w formacie bloku głębokiej studzienki do każdej odpowiedniej studzienki tacy krystalizacyjnej. Ten etap transferu można wykonać za pomocą robota krystalizacyjnego lub ręcznego transferu za pomocą pipety 8-kanałowej.
   1. Przenieść roztwory zbiornikowe, białkowe i wyjściowe nasion do kropli ręcznie lub za pomocą robota, korzystając z objętości wyszczególnionych w ppkt 3.1. Niektóre dostępne na rynku roboty krystalizacyjne nie stykają się z dozownikiem, a przenoszenie nasion za pomocą takiego systemu może spowodować zablokowanie końcówek dozujących lub powiązanych przewodów. Kolejność dozowania jest zmienna: niektóre roboty dozują wszystkie roztwory jednocześnie. Jeśli nie jest to możliwe, najpierw dozuj białko, następnie zbiornik, a następnie materiał siewny.
   2. Jeśli robot dozujący kontaktowy nie jest dostępny, przenieś nasiona za pomocą szklanej strzykawki o małej objętości wyposażonej w igłę. Opłucz igłę, przepuszczając ją przez roztwór zbiornika, a następnie dozuj materiał siewny do każdej kropli.
   3. Uszczelnij tackę za pomocą przezroczystego arkusza uszczelniającego i przenieś do inkubatora lub pomieszczenia o stałej temperaturze w celu przechowywania.

4. Inspekcja tacek krystalizacyjnych

1. Wizualizuj wszystkie eksperymenty krystalizacji za pomocą mikroskopu dwuokularowego lub systemu obrazowania kryształów. Pierwsza z nich zazwyczaj daje użytkownikowi większą kontrolę nad głębią widoku i stopniem powiększenia niż druga, ale jest bardziej czasochłonna.
2. Sprawdzić kolejno każdą studzienkę podwodną/szkiełko nakrywkowe i zarejestrować wszelkie oznaki tworzenia się kryształów. Eksperymenty powinny być kontrolowane raz na 24 godziny przez 5 dni po założeniu, a następnie raz na 7 dni przez okres do 4 tygodni.
3. Często wymagane są wielokrotne cykle rMMS, zanim zostaną wytworzone kryształy o optymalnej jakości dyfrakcyjnej.

Wyniki

(A) Przykład eksperymentu z rMMS

Aby zademonstrować skuteczność badań przesiewowych rMMS, zastosowaliśmy tę metodę do krystalizacji lizozymu białka jaja kurzego (HEWL) i katalazy wątroby bydlęcej (BLC). Oba te enzymy są wybitnie krystalizujące i są strukturalnie dobrze scharakteryzowanymi celami ^{15, 16}. W związku z tym oba stanowią doskonałe obiekty testowe, za pomocą których można zilustrować zwiększony wskaźnik sukcesu krystalizacji osiągalny za pomocą rMMS. Eksperymenty krystalizacj...

Dyskusja

W artykule opisano ogólną metodę przesiewowego badania przesiewowego krystalizacji białek rMMS. Wykazaliśmy przy użyciu dwóch białek testowych znaczną poprawę wskaźnika powodzenia krystalizacji przy użyciu tej metody. Analiza dyfrakcyjna z wykorzystaniem promieniowania synchrotronowego podzbioru kryształów wygenerowanych przy użyciu metod rMMS i innych niż rMMS wykazała niewielkie różnice w jakości dyfrakcji między kryształami wyhodowanymi przy użyciu obu metod, chociaż poprzedni autorzy informowali, że kryształy dobrej ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tace do krystalizacji MRC 96 well	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Niekompatybilne z promieniowaniem UV, do ekranów utworzonych przez robota
Arkusze uszczelniające ClearView	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Lizozym białka jaja kurzego	Sigma-Aldrich	L6876	~95% czystości
Katylaza wątroby bydlęcej	Sigma-Aldrich	C9322>	95% czystości
Ksylanaza	Hampton Research	HR7-104
Taumatyna z Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Termolizyna z Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
Ekran JCSG-plus HT-96	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	Do ekranów utworzonych przez robota
PACT premier HT-96 ekran	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	Dla ekranów utworzonych przez robota
Morpheus HT-96 ekran	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	Dla ekranów utworzonych przez robota
Crystal Ph– System obsługi cieczy nix	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Zestaw koralików nasiennych	Hampton Research	HR2-320
Lornetka stereoskopowa	Leica	M165C
Ostrza skalpela	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0,1-2,5 μ l pipeta	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μ l pipeta	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μ l pipeta	Starlab	S7100-1000
Ekran JCSG-plus	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	Do ekranów tworzonych ręcznie
Ekran PACT premier	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	Do ekranów tworzonych ręcznie
Ekran Morfeusza	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	Do ekranów tworzonych ręcznie
Pęseta	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
Szkiełka nakrywkowe CrystalClene 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml szklane pipety Pasteura	Mieszalnik Vortex Sigma-Aldrich	Z722669
	Fisher Scientific	02-215-360
24-dołkowa taca do krystalizacji XRL	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	Do ekranów tworzonych ręcznie
30% (w/v) PEG 8000, 0,2 M siarczan amonu, 0,1 M kakodylan sodu pH 6,5
20% (w/v) PEG 8000, 0,2 M octan magnezu, 0,1 M kakodylan sodu pH 6,5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM kwas cytrynowy pH 5,0