Artykuł metodologiczny

Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM podczas wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych

20.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50557

⸱

31 marca 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry, University of Bath

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy użycie styrylowych barwników FM do obrazowania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w funkcjonalnych zakończeniach nerwowych. Protokół ten może być stosowany nie tylko do wywołanych, ale także spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych. Protokół rozszerza różnorodność zdarzeń synaptycznych, które można skutecznie ocenić.

Streszczenie

Pęcherzyki synaptyczne w funkcjonalnych zakończeniach nerwowych ulegają egzocytozie i endocytozie. Ten recykling pęcherzyków synaptycznych można skutecznie analizować za pomocą styrylowych barwników FM, które ujawniają obrót błony. Konwencjonalne protokoły stosowania barwników FM zostały zaprojektowane do analizy neuronów po stymulowanej (wywołanej) aktywności synaptycznej. Ostatnio dostępne stały się protokoły do analizy sygnałów FM, które towarzyszą słabszym aktywnościom synaptycznym, takim jak spontaniczne lub miniaturowe zdarzenia synaptyczne. Analiza tych małych zmian w sygnałach FM wymaga, aby system obrazowania był wystarczająco czuły, aby wykryć niewielkie zmiany intensywności, a jednocześnie aby sztuczne zmiany o dużej amplitudzie były tłumione. Tutaj opisujemy protokół, który można zastosować do wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych i używamy hodowanych neuronów hipokampa jako przykładu. Protokół ten obejmuje również sposób oceny szybkości fotowybielania barwników FM, ponieważ jest to znaczące źródło artefaktów podczas obrazowania niewielkich zmian intensywności.

Wprowadzenie

Funkcjonalność pęcherzyków synaptycznych jest ważnym wyznacznikiem transmisji synaptycznej. Pęcherzyki te uwalniają neuroprzekaźniki, gdy łączą się z presynaptyczną błoną plazmatyczną (egzocytoza) i stają się gotowe do kolejnego cyklu uwalniania po zregenerowaniu z błony plazmatycznej (endocytoza) i ponownym załadowaniu neuroprzekaźnikiem. Badania nad dynamiką i mechanizmami leżącymi u podstaw recyklingu pęcherzyków synaptycznych zostały znacznie przyspieszone przez wprowadzenie styrylowych barwników FM1. Te amfipatyczne cząsteczki, które mają dodatnio naładowane hydrofilowe grupy głów i hydrofobowe ogony (wiele barwników na rysunku 1A, stereoview FM1-43 na rysunku 1B), mogą odwracalnie wchodzić i wychodzić z błon lipidowych bez ich przenikania. Grupy barwników FM mają podobne cechy, które wpływają na zakres emitowanego przez nie światła. Na przykład FM2-10, FM1-43 i FM1-84 mają jedno podwójne wiązanie między dwoma cyklicznymi związkami i wykazują zieloną emisję. Różnica między nimi polega na długości ogona hydrofobowego, co decyduje o jego hydrofobowości, a tym samym o szybkości wychodzenia z membrany (departycjonowania). W przypadku FM5-95 i FM4-64 związki cykliczne łączą trzy wiązania podwójne, które wykazują czerwoną emisję. Barwniki te różnią się między sobą pod względem części hydrofilowych. We wszystkich barwnikach FM intensywność fluorescencji wzrasta po wprowadzeniu ich do błon biologicznych, ze względu na wzrost wydajności kwantowej w środowisku hydrofobowym w stosunku do środowiska hydrofilowego. Zatem zmiany intensywności FM reprezentują zmiany w obrocie membrany. Różne kolory (widma emisyjne) i hydrofobowość sprawiają, że barwniki FM są wszechstronnym narzędziem badawczym w recyklingu pęcherzyków synaptycznych.

Bazując na tych cechach, barwniki FM są najczęściej używane zgodnie z następującym schematem podczas analizy recyklingu pęcherzyków synaptycznych (Rysunek 2). Neurony są skąpane w roztworze zewnątrzkomórkowym zawierającym barwnik FM, umożliwiając jego pobieranie do pęcherzyków synaptycznych (SV), gdy tworzą się one poprzez endocytozę (barwienie). Barwnik jest następnie wypłukiwany przez nałożenie bezbarwnikowego roztworu zewnątrzkomórkowego; ujawnia to funkcjonalne zakończenia nerwowe, tj. tylko te aktywnie poddawane endocytozie będą zawierały skupisko pęcherzyków synaptycznych, które są naładowane barwnikiem (ryc. 2 na dole). Późniejsza egzocytoza prowadzi do utraty barwnika FM do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i jednoczesnej utraty fluorescencji (odbarwienia; zarówno z powodu departycji do środowiska hydrofilowego, jak i dyfuzji z dala od miejsca egzocytozy). Dlatego zmiany intensywności fluorescencji FM są wskaźnikami egzo- i endocytozy pęcherzyków synaptycznych.

Barwniki FM były używane do barwienia i odbarwiania pęcherzyków synaptycznych w różnych organizmach i preparatach2,3. Przykłady obejmują hodowle neuronów ssaków4-9, wycinki mózgu ssaków10,11, połączenia nerwowo-mięśniowe12,13, dwubiegunowe neurony siatkówki14,15 i komórki rzęsate ślimaka16.

Zazwyczaj w takich eksperymentach, zarówno barwienie, jak i odbarwienie są wywoływane przez intensywną stymulację neuronów (aktywność wywołana). Ostatnio jednak przeanalizowano również recykling pęcherzyków synaptycznych w odpowiedzi na słabą stymulację, podobnie jak recykling w przypadku braku bodźca zewnętrznego (spontaniczna i miniaturowa aktywność synaptyczna)9,17-19. Spontaniczne i miniaturowe aktywności synaptyczne definiuje się jako te, które zachodzą przy braku bodźców zewnętrznych, przy czym te pierwsze obejmują spontaniczne wystrzeliwanie potencjałów czynnościowych (ryc. 3). Te słabe aktywności synaptyczne są związane z mniejszymi zmianami w sygnałach FM niż te wywołane przez rozległą stymulację. Pomiar wymaga, aby zmiany intensywności fluorescencji FM dokładnie odzwierciedlały egzocytozę pęcherzyków synaptycznych lub endocytozę, ale nie sztuczne zmiany intensywności. Jedną z przyczyn artefaktu jest obecność niespecyficznego zabarwienia błony plazmatycznej przez barwniki FM. Stopniowe wypłukiwanie tego składnika doprowadzi do stopniowej zmiany mierzonej intensywności fluorescencji, która zostanie błędnie przypisana aktywnościom synaptycznym. Współczynnik ten można zmniejszyć za pomocą odpowiednich metod (patrz Protokół). Najbardziej godną uwagi przyczyną artefaktu jest fotowybielanie barwnika FM zatrzymanego w pęcherzykach synaptycznych. Zmiany intensywności FM związane z fotowybielaniem muszą być małe w porównaniu ze zmianami biologicznymi (synaptycznymi), które są mierzone. Niedawny rozwój czułych kamer, np. kamery EMCCD (EMCCD) z urządzeniem do zwielokrotniania ładunku, umożliwia zminimalizowanie fotowybielania poprzez skrócenie czasu naświetlania i osłabienie intensywności światła używanego do wzbudzania fluoroforu. Inną przyczyną artefaktu jest dryf w poziomie skupienia mikroskopu świetlnego. Dryft ostrości podczas sesji obrazowania może być spowodowany efektami mechanicznymi lub termicznymi i błędnie doprowadzi do zmiany zmierzonej intensywności fluorescencji.

Tutaj opisujemy protokoły i sprzęt, które umożliwiają użycie barwników FM do analizy recyklingu pęcherzyków synaptycznych nawet w kontekście słabej stymulacji lub jej braku, w szczególności miniaturowej aktywności synaptycznej. Pokazujemy przykłady barwienia i odbarwiania pęcherzyków podczas wywołanych i spontanicznych zdarzeń synaptycznych, wykorzystując hodowane neurony hipokampa gryzoni i obrazując fazę odbarwiania. Pokazujemy również, jak ocenić stopień fotowybielania barwnikiem FM, przy braku jakiejkolwiek utraty barwnika FM z powodu aktywności synaptycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pierwotna hodowla neuronów z mózgu ssaków

Wszystkie procedury na zwierzętach wykonywane w tym badaniu są zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Iowa.

  1. Przygotować zdysocjowaną hodowlę komórkową regionów CA3-CA1 hipokampa od myszy lub szczurów w dniach po urodzeniu 0-119,20. Umieść komórki hipokampa na 12-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych (grubość numer 0) wstępnie obsianych warstwą karmnika gleju szczurów, w 24-dołkowych szalkach i o gęstości 12 000 komórek / studzienkę.
  2. Hoduj neurony hipokampa przez co najmniej 8 dni, aby rozwinęły się funkcjonalne zakończenia nerwowe21. Używamy neuronów przez 11-14 dni in vitro, kiedy poszczególne zakończenia nerwowe są stosunkowo izolowane bez większego grupowania. Neurony mogą być wykorzystywane do eksperymentów do około 21-28 dni in vitro, np. Willig i wsp.22 oraz Nosyreva i Kavalali23.
  3. W przypadku badań funkcjonalnych należy ocenić szkiełka nakrywkowe (przed barwieniem) pod kątem wskaźników zdrowych neuronów za pomocą mikroskopii światła przechodzącego (np. optyka z kontrastem fazowym przy powiększeniu 10-20X). Wskaźniki dobrego zdrowia obejmują: jednolitą warstwę komórek glejowych, wyraźny margines komórkowy wokół neuronów, wydłużone dendryty bez struktur koralików, brak skupionych somatów i brak wiązek neurytów.

2. Ładowanie pęcherzyków synaptycznych barwnikiem FM (barwienie)

  1. Barwienie spowodowane aktywnością synaptyczną wywołaną stymulacją polem elektrycznym (obejmuje potencjały czynnościowe)
    1. Przygotuj roztwór barwiący 1, dodając barwnik FM do bezbarwnikowego roztworu na bazie HEPES, np. roztworu Tyrode'a (szczegóły w ROZTWORACH). Stężenie barwnika FM wynosi 10 μM FM1-43 i 2,5 μM FM4-64. Typowe zakresy stężeń to: 2-15 μM FM1-43 lub 2,5-20 μM FM4-643,6. Do eksperymentów wymagających zahamowania nawracającej glutaminergicznej aktywności synaptycznej i indukcji plastyczności synaptycznej należy dodać kolejnych antagonistów jonotropowych receptorów glutaminianu: receptory AMPA (np. 10 μM CNQX) i receptory NMDA (np. 50 μM AP5).
    2. Przenieść szkiełko nakrywkowe z komórkami z pożywki hodowlanej do komory obrazowania wstępnie wypełnionej roztworem Tyrode'a. Korzystamy z komory obrazowania z elektrodami stymulacyjnymi przymocowanymi do ścianek bocznych (druty platynowe oddalone od siebie o 6,3 mm, RC-21BRFS). Komora ta jest zaprojektowana jako zamknięta komora obrazowania, ale używamy jej jako komory otwartej (tj. bez górnego szkiełka nakrywkowego), o objętości kąpieli ~200 μl. Podczas przenoszenia nie wystawiaj hodowanych komórek na działanie powietrza i unikaj ściskania hodowanych komórek pęsetą (podnieś szkiełko nakrywkowe z obwodu, a nie blisko środka).
    3. Przeprowadzić perfuzję komory obrazowania zwykłym roztworem Tyrode'a w temperaturze pokojowej (23-25 °C).
    4. Nakładaj roztwór barwiący 1 przez ciągłą perfuzję.
    5. Wywołaj aktywność synaptyczną poprzez zastosowanie impulsów elektrycznych. Aby uzyskać maksymalne zabarwienie całkowitej puli recyklingu pęcherzyków synaptycznych w neuronach hipokampa, stymuluj kultury przy 10 Hz przez 60-120 sekund 24. Dążąc do osiągnięcia maksymalnej efektywności stymulacji polowej, należy pamiętać o kilku cechach. 1) Wysokość roztworu do kąpieli powinna być jak najmniejsza, przy jednoczesnym utrzymaniu neuronów i elektrod stymulujących całkowicie zanurzonych w cienkiej warstwie roztworu Tyrode'a (w celu utrzymania neuronów przy życiu i uzyskania jednorodnego pola elektrycznego). 2) Natężenie i czas trwania prądu powinny być optymalizowane za pomocą wskaźnika pobudliwości neuronalnej, np. obrazowania fluorescencyjnegoCa2+; w naszym przypadku stały prąd o natężeniu 30 mA i czasie trwania 1 ms daje wiarygodne wyniki. 3) Roztwór do kąpieli powinien być stosowany przy stałym przepływie podczas stymulacji; stymulacja elektryczna prowadzi do elektrolizy, powodując gromadzenie się protonów (H+) na dodatnio naładowanej anodzie i gwałtowny spadek pH w pobliżu anody w kąpieli statycznej. Sprawdź zakwaszenie w oddzielnym doświadczeniu, przepuszczając więcej niż kilkaset impulsów przez roztwór zawierający wskaźnik pH (np. zbilansowany roztwór soli Hanksa z czerwienią fenolową).
    6. Pozostaw neurony w roztworze barwiącym 1 na dodatkowe 60 sekund po zakończeniu stymulacji polowej, tak aby endocytoza po bodźcu została zakończona25.
    7. Wypłukać roztwór barwiący z komory obrazowania przez perfuzję roztworu płuczącego 1, bezbarwnikowego roztworu Tyrode'a oraz antagonistów receptorów AMPA i receptorów NMDA (patrz sekcja 2.1.1) oraz blokera kanałów Na+ zależnych od napięcia (np. 0,5-1 μM tetrodotoksyny, TTX). Połączenie blokerów zahamuje utratę barwnika FM poprzez spontaniczną aktywność synaptyczną. Aby zmaksymalizować skuteczność mycia, należy zwiększyć szybkość perfuzji (np. do 5-6 ml/min) przez 1-2 minuty i dodać bolus (np. 1 ml) roztworu płuczącego 1 bezpośrednio do otwartej komory obrazowania ręcznie, za pomocą pipety. Kontroluj siłę i kierunek infuzji manualnej, aby nie zakłócać hodowlanych neuronów.
  2. Barwienie spowodowane aktywnością synaptyczną wywołaną roztworem o wysokiej zawartości K+ (nie obejmuje potencjałów czynnościowych).
    1. Przygotuj roztwór barwiący 2, dodając barwnik FM do roztworu Tyrode o wysokiej zawartości K+. W szczególności należy przygotować zmodyfikowany roztwór Tyrode'a z 45 mM KCl, poprzez równomolowe podstawienie KCl na NaCl. W razie potrzeby dodać antagonistów receptorów AMPA i NMDA. To rozwiązanie o wysokiej zawartości K + będzie w sposób ciągły depolaryzować neurony, umożliwi napływ Ca2 + do zakończeń nerwowych i zainicjuje egzocytozę pęcherzyków synaptycznych w maksymalnym stopniu26. Wyższe stężenia (70-90 mM) stosowano również w innych raportach, np. Klingauf i wsp.27 oraz Richards i wsp.28
    2. Przenieść szkiełko nakrywkowe z wyhodowanymi neuronami z pożywki hodowlanej do komory obrazowania wstępnie wypełnionej roztworem Tyrode'a.
    3. Barwić neurony w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty, nakładając roztwór barwiący 2 przy stałej perfuzji lub używając pipety26,28. W tym ostatnim przypadku końcowe stężenie barwnika powinno być kontrolowane przez dodanie znanej objętości roztworu barwiącego 2 do znanej objętości roztworu bezbarwnego.
    4. Wypłukać roztwór barwiący z komory obrazowania, jak opisano w sekcji 2.1.7.
  3. Barwienie spowodowane spontaniczną i miniaturową aktywnością synaptyczną.
    1. Roztwór na bazie wodorowęglanu (np. pożywka Minimum Essential Medium, MEM) podgrzać do temperatury 37 °C, umieszczając w inkubatorze hodowl na ponad 60 minut.
    2. Do barwienia na podstawie spontanicznej aktywności synaptycznej przygotuj roztwór barwiący 3, dodając barwnik FM do MEM. Do barwienia na podstawie miniaturowej aktywności synaptycznej należy przygotować roztwór barwiący 4, dodając TTX do roztworu barwiącego 3.
    3. Wybarwić neurony, przenosząc szkiełko nakrywkowe z wyhodowanymi neuronami z pożywki hodowlanej do roztworu barwiącego 3 lub 4 i pozostawiając je w tym samym roztworze barwiącym w temperaturze 37 °C na 10 minut.
    4. Krótko wypłukać szkiełko nakrywkowe w roztworze do płukania 1.
    5. Przenieść szkiełko nakrywkowe do roztworu płuczącego 1 w komorze obrazowania. Pamiętaj o następujących kwestiach. 1) Komórki nie powinny być wystawione na działanie powietrza; W razie potrzeby przenieść szkiełko nakrywkowe bezpośrednio do komory obrazowania bez spłukiwania. 2) Neurony można barwić w temperaturze pokojowej, zastępując roztwór barwiący 3 lub 4 roztworem na bazie HEPES. 3) Neurony można barwieć pod kątem wywołanej aktywności synaptycznej w kontekście roztworu o wysokiej zawartości K+ przy użyciu tej metody, zastępując roztwór barwiący 3 lub 4 roztworem barwiącym 2 i przeprowadzając pozostałe etapy w temperaturze pokojowej.
    6. Wypłukać roztwór barwiący z komory obrazowania, jak opisano w sekcji 2.1.7.

3. Wypłukiwanie barwnika FM

  1. Po barwieniu neuronów i wstępnym umyciu którąkolwiek z wyżej opisanych metod (sekcja 2.1.7), należy kontynuować perfuzję komory obrazowania roztworem płuczącym 1 przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej. Spowoduje to usunięcie barwnika FM z błony plazmatycznej i roztworu zewnątrzkomórkowego. W przypadku naszej komory obrazowania szybkość perfuzji w kąpieli wynosi 600-1 200 μl/min. Mycie można również przeprowadzić przy braku zewnątrzkomórkowego Ca2 + w celu zahamowania utraty barwnika FM z powodu aktywności synaptycznej17. Płukanie można wzmocnić poprzez krótkie zastosowanie Advasep-7, zmodyfikowanej cyklodekstryny, która służy jako wymiatacz barwników FM z błony plazmatycznej29-31. Bardzo ważne jest, aby ekspozycja na Advasep-7 była krótka (np. 5 sekund w przypadku hodowli jednowarstwowej), aby uniknąć zarówno zmniejszenia intensywności FM puncta31, jak i pogorszenia zdrowia komórek. Fluorescencja z FM1-43 w błonie komórkowej może być również stłumiona przez zastosowanie wygaszacza sulforodaminy 101 (50-100 μM), która nie dostaje się do pęcherzyków synaptycznych32.

4. Poszukiwanie optymalnego pola obrazu podczas prania

  1. Sprawdź, czy komórki w obszarze, który ma być obrazowany, są zdrowe, używając mikroskopii światła przechodzącego z soczewką obiektywową o dużym powiększeniu i dużej aperturze numerycznej (np. 40X) . Od tej sekcji nadal używamy mikroskopu odwróconego (Eclipse Ti, Nikon) wyposażonego w kontrast fazowy lub kontrastową optykę interferencji różnicowej. Ten mikroskop jest również wyposażony w system Perfect Focus System (PFS), który umożliwia ciągłą korekcję ostrości w czasie rzeczywistym, co pozwala przezwyciężyć dryft ostrości mikroskopu. Ta funkcja jest niezbędna do obrazowania poklatkowego podczas odbarwiania przy użyciu tej samej płaszczyzny ostrości.
  2. Sprawdź, czy barwienie było skuteczne, używając optyki fluorescencyjnej. Unikaj agregatów FM puncta, chyba że są one celem badań, ponieważ poszczególne buliony będą trudne do rozpoznania. Zwróć uwagę na kształty FM puncta: jeśli większość poplamionych bulionów wygląda jak sznury okrągłych koralików, mogą one reprezentować niezdrowe zakończenia nerwowe. Zminimalizuj narażenie neuronów na silne wzbudzenie fluorescencyjne, aby uniknąć fotowybielania.

5. Usuwanie barwnika FM z pęcherzyków synaptycznych (odbarwienie)

  1. Odbarwienie spowodowane aktywnością synaptyczną wywołaną stymulacją polem elektrycznym.
    1. Wypłucz TTX poprzez intensywną perfuzję neuronów roztworem płuczącym 2 (takim samym jak roztwór płuczący 1, ale bez TTX). Potwierdź skuteczność wymywania TTX w oddzielnych eksperymentach, używając tych samych parametrów płukania (szybkość i czas trwania perfuzji), np. poprzez obrazowanie fluorescencyjne Ca2+ cytoplazmatycznych stanów przejściowych Ca2+ indukowanych stymulacją polową lub przez zapis patch-clamp zależnych od napięcia prądów Na+.
    2. Rozpocznij obrazowanie barwników FM. Do obrazowania FM1-43 lub FM4-64 należy użyć odpowiednio długoprzepustowych filtrów emisyjnych 520 nm lub 650 nm oraz filtra wzbudzenia 490 nm. Rejestruj obrazy co 1-2 sekundy, stosując krótki czas naświetlania (np. 10-20 ms), słabą intensywność wzbudzenia (np. 5-10% mocy diody LED) i wysoką czułość (np. ze wzmocnieniem EM). Zminimalizuj fotobielenie barwników FM poprzez skrócenie czasu ekspozycji i intensywności wzbudzenia fluorescencji. Zminimalizuj dryft ostrości mikroskopu, włączając system Perfect Focus.
    3. Stymulować neurony w roztworze płuczącym 2, stosując stymulację polową (np. przy 10 Hz przez 120 sekund)20.
    4. Zastosuj wiele rund stymulacji, z przerwami na 1-2 minuty, aby wyczerpać wszystkie pęcherzyki synaptyczne barwnika FM. Jest to ważne przy ocenie wielkości całkowitej puli recyklingu pęcherzyków synaptycznych, które zostały wybarwione barwnikami FM w poprzednim stanie20,33.
  2. Odbarwienie spowodowane aktywnością synaptyczną wywołaną przy braku potencjałów czynnościowych.
    1. Rozpocznij obrazowanie barwnika FM.
    2. Zastosować odczynniki stymulujące rozpuszczone w roztworze płuczącym 1 lub 2. Do takich odczynników należą: KCl (roztwór o wysokiej zawartości K+, np. 45 mM)26, jonomycyna (jonoforCa2+, który podnosi wewnątrzkomórkowe stężenieCa2+, umożliwiając napływ Ca2+ do komórki z roztworu zewnątrzkomórkowego, stosowanego np. przy 5 μM)20,34 oraz sacharoza (roztwór hipertoniczny stymulujący uwalnianie pęcherzyków synaptycznych z łatwo uwalniającej się puli, stosowane np. przy 500 mM)35,36. Użyj szybkiego, lokalnego systemu perfuzyjnego do niezawodnej kontroli czasowej podczas nakładania odczynników, np. systemu SF-77B firmy Warner Instruments37 lub systemu Y-tube38-40.
  3. Odbarwienie spowodowane spontaniczną i miniaturową aktywnością synaptyczną.
    1. W celu odbarwienia z powodu spontanicznej aktywności synaptycznej należy wypłukać TTX jak powyżej (sekcja 5.1.1), używając roztworu do płukania 2. Rozpocznij obrazowanie barwników FM podczas perfuzji neuronów za pomocą roztworu płuczącego 2. W celu odbarwienia z powodu miniaturowych aktywności synaptycznych rozpocznij obrazowanie barwników FM, kontynuując perfuzję neuronów roztworem płuczącym 1 (z TTX).
    2. Po odbarwieniu na podstawie spontanicznej lub miniaturowej aktywności, zidentyfikuj funkcjonalne zakończenia nerwowe poprzez odbarwienie za pomocą wywołanej aktywności synaptycznej. Aktywność może być wywołana przez dowolną z procedur opisanych powyżej. Ten proces identyfikacji jest konieczny, ponieważ wybarwione struktury mogą być strukturami innymi niż funkcjonalne zakończenia nerwowe (np. wolno przetwarzające się endosomy lub pęcherzyki astrocytowe), a duża ilość odbarwienia przez wywołaną aktywność pomaga w tym procesie.

6. Ocena szybkości fotowybielania barwników FM

  1. Wybarwić zakończenia nerwowe barwnikiem FM utrwalanym aldehydem (np. FM1-43FX, FM4-64FX). Można to zrobić za pomocą opisanej powyżej metody barwienia wywołanego, spontanicznego lub miniaturowego oraz poprzez zastąpienie barwnika FM barwnikiem FM utrwalanym barwnikiem FM.
  2. Wypłukać utrwalany barwnik FM zgodnie z opisem w sekcji 2.1.7.
  3. Chemicznie utrwalić neurony, przenosząc szkiełko nakrywkowe do roztworu utrwalającego: 4% paraformaldehydu i 4% sacharozy w roztworze Tyrode'a przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Intensywność fluorescencji utrwalanego barwnika FM zostanie zachowana po utrwaleniu chemicznym.
  4. Przemywać utrwalacz przez 10 minut w roztworze Tyrode'a, dwukrotnie przenosząc szkiełko nakrywkowe do świeżego roztworu Tyrode
    5. 'a.
  5. Przenieść szkiełko nakrywkowe do świeżego roztworu Tyrode'a w komorze obrazowania.
  6. Rozpocznij obrazowanie utrwalanego barwnika FM przy użyciu tego samego zestawu parametrów obrazowania, co w przypadku żywych neuronów. Ważne jest, aby bardzo dobrze przepłukać komorę obrazowania po użyciu jakiejkolwiek chemicznie utrwalonej próbki, ponieważ pozostały utrwalacz może wpłynąć na kolejne eksperymenty obrazowania żywych komórek przeprowadzone w tej samej komorze. Alternatywnie do utrwalonego obrazowania komórek, barwione żywe komórki mogą być obrazowane w celu oceny szybkości fotowybielania. Warto jednak pamiętać, że trudno jest ostro zablokować miniaturową aktywność synaptyczną; na przykład częstotliwość miniaturowej aktywności można zmniejszyć do ~50% poprzez usunięcie zewnątrzkomórkowego Ca2 + 23, ale nie jest to całkowita blokada.  
  7. Pod koniec każdej sesji obrazowania należy uzyskać obraz tła w celu oceny bezwzględnej wartości intensywności fluorescencji FM. Intensywność FM puncta reprezentuje nie tylko prawdziwy sygnał z barwników FM w zakończeniach nerwowych, ale także szum tła z 1) komórek glejowych, które leżą u podstaw monowarstwowej hodowli neuronów, 2) szkiełka nakrywkowego i elementów optycznych (np. soczewki obiektywu, filtrów i luster) oraz 3) detektora (kamera EMCCD). Szum tła jest oceniany w niezabarwionych obszarach obrazowanego pola. Gdy takie obszary są ograniczone przestrzennie lub niejednorodne pod względem intensywności, należy je zastąpić obrazem z zamkniętą migawką aparatu i uzyskać szum z detektora, choć nie jest to idealna metoda. Wykonaj około 10 zdjęć przy użyciu tych samych parametrów obrazowania.

7. Analiza obrazu

  1. Zaimportuj uzyskane dane do oprogramowania do analizy obrazów jako stos obrazów szeregów czasowych. Używamy ImageJ (W. S. Rasband, NIH) i powiązanych wtyczek, np. wtyczki Image Stabilizer (Kang Li) do korekcji niewielkiego stopnia ruchu wśród FM puncta oraz Time Series Analyzer V2.0 (Balaji Jayaprakash) do analizy szeregów czasowych.
  2. Obliczyć zmiany natężenia FM na początku i na końcu serii (ΔFM). W tym celu należy uśrednić obrazy przed rozpoczęciem odbarwiania i po jego zakończeniu (np. po 5 klatek obrazu) i wygenerować obraz różnicowy, odejmując je.
  3. Zidentyfikuj potencjalnie funkcjonalne zakończenia nerwowe, stosując próg intensywności do obrazu różnicowego, i wykryj piksele, których intensywność jest wyższa niż próg. Jedną z metod ustalania progu jest wybór odchylenia standardowego intensywności tła uzyskanego z nieosłoniętego obszaru szkiełka nakrywkowego.
  4. Zidentyfikuj izolowane, funkcjonalne zakończenia nerwowe jako sąsiadujące ze sobą piksele, które zostały wykryte i które spełniają kryterium rozmiaru (minimalna i maksymalna liczba pikseli w ciągłości). Proces ten eliminuje z analizy szum tła i zagregowane zakończenia nerwowe.
  5. Przypisz obszary zainteresowania (ROI) do wykrytych klastrów pikseli (przy czym poszczególne klastry odpowiadają poszczególnym zakończeniom nerwowym). Całkowita zmiana intensywności podczas odbarwiania (ΔFM) jest typowym parametrem analizy. Reprezentuje to skumulowaną ilość wywołanej, spontanicznej lub miniaturowej aktywności synaptycznej. Wyklucz ROI, jeśli wykazują one którąkolwiek z następujących zmian intensywności w zależności od celów eksperymentów: wzrost podczas nagrywania, nagły spadek przed stymulacją lub długie opóźnienie po stymulacji.
  6. Oceń szybkość fotowybielania, importując pozyskane dane szeregów czasowych do oprogramowania do analizy obrazu. Uśrednij obrazy tła (np. z przymkniętą migawką) i odejmij je od poszczególnych obrazów. Przypisz ROI do punktów FM, które przypuszczalnie odpowiadają zakończeniom nerwowym, i zmierz zmiany intensywności ROI w czasie.

Rozwiązania

  1. Rozwiązanie Tyrode'a
    • Skład (w mM): 125 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 30 glukozy, 25 HEPES, 310 mOsm, pH 7,4.
  2. Roztwór barwiący 1
    • Roztwór Tyrode'a plus barwnik FM.
    • Roztwór ten stosuje się do barwienia, opartego na wywołanej aktywności synaptycznej przez stymulację elektryczną.
    • W razie potrzeby dodać antagonistów receptorów AMPA i receptorów NMDA.
  3. Roztwór barwiący 2
    • Roztwór High-K+ Tyrode plus barwnik FM.
    • Ten zmodyfikowany roztwór Tyrode'a przygotowuje się przez zwiększenie stężenia KCl do 45 mM, przez równomolowe podstawienie KCl na NaCl.
    • Roztwór ten stosuje się do barwienia, opartego na wywołanej aktywności synaptycznej przez ciągłą depolaryzację.
    • W razie potrzeby dodać antagonistów receptorów AMPA i receptorów NMDA.
  4. Roztwór barwiący 3
    • Roztwór MEM plus barwnik FM.
    • Roztwór ten służy do barwienia, w oparciu o spontaniczną aktywność synaptyczną.
  5. Roztwór barwiący 4
    • Roztwór MEM plus barwnik FM i TTX.
    • Roztwór ten służy do barwienia, w oparciu o miniaturową aktywność synaptyczną.
  6. Roztwór płuczący 1
    • Roztwór Tyrode'a plus antagoniści receptorów AMPA i receptorów NMDA oraz TTX.
  7. Roztwór płuczący 2
    • Roztwór Tyrode'a plus antagoniści receptorów AMPA i receptorów NMDA, ale bez TTX.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jako przykład przedstawiamy reprezentatywne wyniki przebiegu czasowego odbarwiania pęcherzyków synaptycznych (Rysunek 4). Hodowlane neurony hipokampa zostały zabarwione barwnikiem FM4-64 przy wykorzystaniu spontanicznej aktywności synaptycznej (krok 2.3) i przemyte roztworem bezbarwnym (roztwór płuczący 2). Obrazowanie przedstawia początkowy przebieg czasowy odbarwiania z wykorzystaniem aktywności spontanicznej (krok 5.3) (początkowy odcinek linii ciągłej, Rysunek 4A). Następnie przedsta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisaliśmy protokoły barwienia i odbarwiania pęcherzyków synaptycznych w odpowiedzi na wywołaną, spontaniczną i miniaturową aktywność synaptyczną oraz obrazowania w fazie odbarwiania. Oprócz istniejących protokołów dołączyliśmy nowy protokół obserwacji odbarwienia FM w oparciu o miniaturową aktywność synaptyczną. Korzystając z tych protokołów, wcześniej zidentyfikowaliśmy nieprawidłowości w hodowanych neuronach z mysiego modelu dystonii zaburzenia ruchowego. W porównaniu z ich odpowiednikami u myszy typu dzikiego, neuron...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują członkom laboratorium Harata za pomocne dyskusje podczas wykonywania tej pracy. Praca ta została sfinansowana z grantów American Heart Association, Dystonia Medical Research Foundation, Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, National Science Foundation i Whitehall Foundation dla NCH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Generator impulsówAMPIMaster-8
Izolacyjny stymulatorfigure-materials-1 DigitimerDS3
Mikroskop odwróconyNikonEclipse TS100Służy do oceny morfologii komórek przy małym powiększeniu.
Mikroskop odwróconyNikonEclipse TiESłuży do wysokorozdzielczego obrazowania fluorescencyjnego i w świetle przechodzącym, z minimalnym dryftem ostrości.
ObiektywNikonZaleca się stosowanie obiektywu imersyjnego wodnego. Obiektyw imersyjny olejowy można stosować, chyba że obrazowana struktura znajduje się głęboko pod powierzchnią szkiełka nakrywkowe (np. >10 μm).
Kostka filtracyjnaNikon77032509ex 490/20-nm, dclp 510-nm, em 520-nm-LP dla FM1-43
Kostka filtracyjnaNikon77032809ex 490/420 nm, dclp 510 nm, em 650 nm LP dla FM4-64. 
Kamera EMCCDAndor TechnologyiXon EM+ DU-860Ta kamera EMCCD służy do detekcji fluorescencji o wysokiej czułości.
Ciekły chiller recyrkulacyjnySolid State Cooling SystemsOasis 160Służy do ciągłego chłodzenia kamery wodą w celu utrzymania temperatury -80°C, co pozwala na redukcję szumów.
LEDCoolLED-Custom Interconnect490 nmTo źródło światła służy do szybkiego sterowania włączaniem/wyłączaniem wzbudzenia fluorescencji.
Oprogramowanie do akwizycji obrazuAndor TechnologySolis
Komora obrazowaniaWarner InstrumentsRC-21BRFS
System szybkiej perfuzjiWarner InstrumentsSF-77B
CNQXTocris Bioscience1045
D,L-AP5Tocris Bioscience0106
TetrodotoksynaTocris Bioscience1069Uwaga: odczynnik toksyczny. Stosować ostrożnie.
FM1-43InvitrogenT35356
FM1-43 utrwalany aldehydem (FM1-43FX)InvitrogenF35355
FM4-64InvitrogenT13320
FM4-64 utrwalany aldehydem (FM4-64FX)InvitrogenF34653
JonomycynaSigma-AldrichI0634
Zrównoważony roztwór soli Hanksa’Sigma-AldrichH2387
Minimalne medium niezbędne (MEM)Invitrogen51200-038Ten roztwór nie zawiera czerwieni fenolowej, która zakłócałaby obrazowanie fluorescencyjne.
ParaformaldehydElectron Microscopy Sciences15710Uwaga: odczynnik toksyczny. Stosować ostrożnie.
SacharozaSigma-AldrichS7903

Bibliografia

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
  2. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
  3. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , Cold Spring Harb Protoc. 77-83 (2012).
  4. Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
  5. Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
  6. Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
  7. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
  8. Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
  9. Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
  10. Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
  11. Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
  12. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
  13. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
  14. Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
  15. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305(2009).
  16. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  17. Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  18. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
  19. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  20. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  23. Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
  24. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
  25. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
  26. Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
  27. Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
  28. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
  29. Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
  30. Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
  31. Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
  32. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
  33. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  34. Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
  35. Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
  36. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
  37. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
  38. Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
  39. Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
  40. Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
  41. Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146(2008).
  42. Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
  43. Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
  44. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
  45. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
  46. Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
  47. Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
  48. Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
  49. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  50. Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34(2011).
  51. Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
  52. Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
  53. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
  54. Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
  55. Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
  56. Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
  57. Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
  58. Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
  59. Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
  60. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
  61. Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
  62. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
  63. Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
  64. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie barwnikami FMwywo ana aktywno synaptycznaspontaniczna aktywno synaptycznaminiaturowe zdarzenia synaptyczneanaliza obrotu b onyocena fotoblakni ciahodowlane neurony hipokampastyrylowe barwniki FMendocytoza p cherzyk w synaptycznych

Powiązane artykuły