Działanie bioreaktora laboratoryjnego

Podsumowanie

Fermentory są używane do zwiększania wydajności hodowli i produktywności komórek bioinżynieryjnych. Po przesiewie wielu kandydatów na hodowle mikrobiologiczne lub komórki zwierzęce w kolbach wstrząsowych, następnym logicznym krokiem jest zwiększenie biomasy wybranej kultury za pomocą fermentora. Ten film pokazuje konfigurację i działanie typowego systemu bioreaktora laboratoryjnego.

Streszczenie

Systemy fermentacji są używane do zapewnienia optymalnego środowiska wzrostu dla wielu różnych typów kultur komórkowych. Zdolność fermentorów do dokładnej kontroli temperatury, pH, a w szczególności stężenia rozpuszczonego tlenu, sprawia, że są one niezbędne do wydajnego wzrostu i ekspresji produktów fermentacji na dużą skalę. W tym filmie pokrótce opisano zalety fermentora w porównaniu z kolbą do wytrząsania. Zidentyfikuje również kluczowe elementy typowego stołowego systemu fermentacji i udzieli podstawowych instrukcji dotyczących konfiguracji naczynia i kalibracji jego sond. Widz zostanie zapoznany z procesem sterylizacji i pokazany, jak zaszczepić pożywkę wzrostową w naczyniu kulturą. Zademonstrowane zostaną również podstawowe koncepcje działania, pobierania próbek i zbioru. Omówiona zostanie również prosta analiza danych i czyszczenie systemu.

Wprowadzenie

Podstawowa technologia fermentacji jest rozszerzeniem prostej techniki wytrząsania kolby do uprawy kultur. Wyrósł z pragnienia kontrolowania środowisk wzrostu żywych kultur w bardziej kompletny i ilościowy sposób. Kolby do wytrząsania z kultur wsadowych są zwykle ograniczone przez nieprecyzyjną kontrolę temperatury. Równomierność temperatury w inkubowanym wytrząsarce lub ciepłym pomieszczeniu jest bardzo zmienna, czasami odchyla się o 5 °C lub więcej od zamierzonej wartości zadanej. Ponieważ kolba wstrząsająca jest zwykle mieszana ze stałą prędkością, pobór tlenu i wymiana gazowa są ograniczone. Gdy dostępny tlen w otoczeniu zostanie wyczerpany, większość kultur nie będzie się rozwijać. W kolbach do wytrząsania nie ma kontroli pH. W wielu przypadkach, jeśli kultura nie jest ograniczona przez materiał paszowy, staje się kwaśna do tego stopnia, że szkodzi kulturze, a oddychanie dramatycznie zwalnia. Większość kultur w kolbach wstrząsowych jest również prowadzona jako "partia", co oznacza, że są one podawane tylko raz na początku inokulacji kultur lub w ich pobliżu. Po zużyciu tego początkowego źródła węgla kultura przestaje rosnąć. W niektórych przypadkach jego metabolizm może się przesunąć i zacząć zużywać inne metabolity w bulionie hodowlanym, czasami zmieniając charakterystykę powstałej biomasy lub białka. Kolby do wytrząsania są również zwykle narażone na utratę parowania pożywki w cieplejszych środowiskach hodowlanych, zwykle 10% objętości na 24 godziny w temperaturze 37 °C. Utrata ta zmienia gęstość kultury i uniemożliwia długotrwałą eksploatację systemu. Wreszcie, użytkownik może napotkać pienienie się z mediów po wymieszaniu. Pojawienie się piany w przestrzeni nad głową nad kulturą ograniczy wymianę gazową i dodatkowo zahamuje wzrost.

Podstawowy system fermentacji został zaprojektowany tak, aby rozwiązać wszystkie te ograniczenia. Staranną kontrolę temperatury w naczyniach fermentacyjnych uzyskuje się dzięki zastosowaniu mieszania wirnika i płaszcza grzewczego. Czujnik umieszczony w naczyniu i sprzężenie zwrotne sterowania ogrzewaniem i chłodzeniem tego płaszcza zwykle skutkuje kontrolą temperatury ±0,1 °C wokół wartości zadanej. Fermentory stołowe zazwyczaj zapewniają kontrolę pH poprzez dodawanie płynnego odczynnika przez pompę. Wartość pH jest stale monitorowana w celu utrzymania środowiska optymalnego dla wzrostu komórek. Prawidłowe napowietrzenie jest utrzymywane przez wspomniany wirnik mieszający lub przez wlew powietrza lub gazu uzupełnionego tlenem bezpośrednio do kultury. W przypadku kultur wrażliwych na ścinanie, gaz uzupełniony tlenem jest podstawowym mechanizmem utrzymania poziomu tlenu w hodowli. Pomiar tlenu w roztworze jest zwykle wykonywany za pomocą sondy polarograficznej, która zwykle nie jest dostępna do użytku w kolbach wstrząsowych. Możliwe jest również ciągłe lub okresowe dodawanie paszy do naczynia w celu utrzymania wzrostu w sposób liniowy lub wykładniczy. Skraplacz gazu wyjściowego zapewnia zimną powierzchnię do skraplania się pary w strumieniu spalin, zachowując w ten sposób objętość i gęstość kultury. Okresowe dodawanie przeciwpieniącego środka powierzchniowo czynnego jest uruchamiane przez sondę przewodności w hodowli, redukując pianę na powierzchni i umożliwiając wymianę gazową.

Naczynie, ze wszystkimi sondami, armaturą, wirnikami, rurami do zbierania i rurkami, jest montowane i sterylizowane w standardowym autoklawie. Po końcowej kalibracji sondy i ustabilizowaniu w środowisku operacyjnym, kultura jest dodawana do naczynia. System może być następnie wykorzystany do scharakteryzowania kultury w sposób, który jest bardziej ilościowy i precyzyjny niż w przypadku metody wstrząsania. Ścisła kontrola temperatury, pH, zawartości tlenu, zużycia paszy, parowania cieczy i poziomu piany przyczynia się do znacznie wyższej biomasy i lepszej wydajności białka.

Protokół

1. Rozpocznij pracę od ustawienia statku. Konwencjonalny fermentor składa się z następujących elementów, które należy zainstalować (rysunek 1):
   1. Sonda pH - do pomiaru pH w żywej kulturze. Skalibruj sondę przed instalacją i wysterylizuj ją w naczyniu. Zamontuj sondę w płycie czołowej.
   2. Sonda pO₂ - do pomiaru zawartości tlenu rozpuszczonego wewnątrz naczynia podczas fermentacji. Zamontuj w płycie czołowej.
   3. Rura żniwna do pobierania próbek kultury. Zamontuj ten element o regulowanej wysokości w płycie czołowej.
   4. Rozpylacz gazowy - znajduje się na dnie naczynia i zapewnia napar gazowy do kultury. Podłącz iskrownik do źródła gazu na fermentorze i zamontuj w płycie głównej.
   5. Wał wirnika i wirnik - wirnik miesza kulturę i ma kluczowe znaczenie dla utrzymania jednorodności kultury w zbiorniku.
   6. Skraplacz spalin - do ograniczania strat parowania w zbiorniku poprzez chłodzenie ścieżki spalin.
   7. Przewody pomp odczynników do kontroli pH lub dodawania paszy.
2. Wyczyść naczynie i główkę wodą z mydłem. Do szorowania naczynia i płyty głowicy zalecana jest miękka szczotka. Do czyszczenia naczynia nie można używać wybielaczy ani środków czyszczących z chlorem.
3. Jeśli podłoże nie jest labilne termicznie, dodaj je do czystego naczynia. Dodawaj tylko do momentu osiągnięcia maksymalnej objętości roboczej. W tym przypadku maksymalna objętość robocza wynosi 3,3 l dla zbiornika o całkowitej pojemności 5 l.
4. Zamontuj płytę czołową zbiornika, upewniając się, że uszczelka o-ring jest prawidłowo osadzona.
5. Zamontować skraplacz spalin.
6. Zainstaluj sondę przeciwpieniącą w porcie 10 mm.
7. Zamontuj rurę zbierającą w jej porcie 10 mm. Połóż kawałek rurki na wierzchu i zaciśnij go.
8. Zamontuj rurkę i filtr 0,20 μm na wlocie iskrowym, a następnie zaciśnij je.
9. Skalibruj sondę pH:
   1. Zebrać 2 referencyjne w małych zlewkach, butelce do mycia i zapasowej zlewce do mycia.
   2. Podłącz sondę pH do fermentora i włącz fermentor.
   3. Przewiń do parametru pH i za pomocą przycisku menu przewiń do opcji "Cal" i naciśnij "Enter".
   4. Wybierz "2" dla kalibracji 2-punktowej.
   5. Zmyj końcówkę sondy i zanurz ją w buforze o niskim poziomie odniesienia. Wartość na fermentorze ustabilizuje się. Za pomocą + i - dostosuj wyświetlaną wartość, aby odpowiadała wartości buforu referencyjnego pH. Gdy przestanie migać, naciśnij "Enter".
   6. Zmyj sondę i włóż ją do drugiego bufora referencyjnego. Poczekaj, aż wartość się ustabilizuje, a następnie użyj klawiatury, aby wyświetlić wartość dopasowaną do górnej wartości bufora odniesienia. Naciśnij "Enter", aby potwierdzić.
   7. Umyj końcówkę sondy i odłącz ją od fermentora. Załóż nasadkę ochronną na złącze i zamontuj ją w płycie czołowej.
10. Otwórz końcówkę sondy pO₂ i sprawdź, czy jest wystarczająca ilość elektrolitu do pokrycia końcówki. Jeśli nie, dodaj trochę do zbiornika i zamknij go z powrotem.
11. Zamontuj sondę pO₂ w płycie głowicy i upewnij się, że nasadka autoklawu jest założona, aby chronić jego połączenia elektryczne. Zostanie skalibrowany po sterylizacji.
12. Zaopatrz się w butelkę do podawania odczynnika z rurką zanurzeniową i filtrem powietrza. Dodaj rurkę pompy do portu rurki zanurzeniowej i podłącz drugi koniec do portu wlotowego w fermentorze.
13. Umieść rurki na wszystkich nieużywanych portach, a następnie zaciśnij rurkę.
14. Zamontuj filtr 0,45 μm na skraplaczu spalin. Filtr ten zapewnia, że naczynie nie ma ciśnienia w autoklawie.
15. Sprawdź, czy wszystkie rurki, które znajdują się poniżej poziomu nośnika, są zaciśnięte, aby zapobiec wydostawaniu się nośnika.
16. Umieścić naczynie w autoklawie na 25 - 30 minut w temperaturze 121 °C, cykl płynny. Uwaga: Kiedy wyjdzie, będzie bardzo gorąco.
17. Zamontuj naczynie na podstawie fermentora.
18. Podłącz sondy pH.
19. Podłącz sondy pO₂
.
20. Podłącz rozpylacz do rotametru dodawania gazu.
21. Sterylnie dodać 1 M odczynnik NaOH do butelki z rurką zanurzeniową i zamontować głowicę pompy na trzpieniu głowicy pompy podstawy.
22. Umieść czujnik temperatury w osłonie termometrycznej na płycie głównej. Upewnij się, że sięga aż do dna osłony termometrycznej.
23. Opuść ramię mieszające na sprzęg wirnika zbiornika.
24. Upewnij się, że fermentor jest włączony.
25. Sprawdź, czy woda jest dostępna dla fermentora.
26. Włącz dopływ powietrza do fermentora.
27. Przewiń do parametru temperatury i ustaw temperaturę na 37 °C. Naciśnij przycisk "Enter", aby rozpocząć regulację temperatury. Naczynie nagrzeje się w ciągu 15 minut lub krócej.
28. Ustaw przepływ gazu na 1 objętość naczynia mediów na minutę lub mniej. W tej konfiguracji przepływ gazu wynosi 3 l/min. Na dole powinny pojawić się bąbelki.
29. Przewiń do parametru mieszania i ustaw na 300 obr./min. Naciśnij "Enter", aby włączyć mieszanie.
30. Gdy temperatura osiągnie 37 °C, przewiń do parametru pH i ustaw go na 6,8. Włącz kontrolę pH, naciskając przycisk "Enter".
31. Ustaw mieszanie na maksymalną prędkość 1 000 obr./min dla biegu.
32. Upewnij się, że sonda pO₂ jest prawidłowo spolaryzowana, aby wyświetlać prawidłowe wartości. Po 2 godzinach przewiń do parametru pO₂ i użyj przycisku "Menu", aby wybrać "Funkcję kalibracji" i wybierz kalibrację 1-punktową.
33. Po 15 minutach użyj kursorów, aby ustawić wartość na 100 i naciśnij "Enter". Spowoduje to kalibrację pO₂.
34. Przewiń do pozycji mieszania i ustaw na 300 obr./min.
35. Za pomocą przycisku "Menu" ustaw "Kaskadę" na "włączone" w menu mieszania. Zwiększy to szybkość mieszania w celu rozdrobnienia pęcherzyków powietrza i wtłoczenia większej ilości tlenu do roztworu wraz ze wzrostem zapotrzebowania na wzrost.
36. Przewiń do parametru pO₂ i ustaw wartość na 30. Naciśnij przycisk "Enter", aby uruchomić pO₂.
37. Uruchom pakiet oprogramowania sterującego na komputerze.
38. Po skalibrowaniu sond mieszanie jest stabilne przy 300 obr./min, temperatura wynosi 37 °C, a pH jest bliskie 6,8, nadszedł czas na inokulację. Za pomocą alkoholu wysterylizuj port, który będzie używany do inokulacji.
39. Pobrać inokulum do strzykawki i dodać je do wysterylizowanego portu. Zamknij port.
40. Oznacz czas szczepienia w dzienniku pokładowym.
41. Ważne jest również, aby pobrać próbkę w czasie sterylizacji. Wysterylizuj koniec rurki rury do zbioru alkoholem.
42. Otwórz zacisk zakrywający port poboru i użyj strzykawki, aby pobrać próbkę. Ta pierwsza próbka jest zwykle odrzucana, ponieważ znajdowała się w rurze.
43. Użyj innej strzykawki, aby pobrać kolejną próbkę.
44. Za pomocą trzeciej strzykawki wepchnij powietrze z powrotem przez rurkę, aby usunąć jak najwięcej martwej objętości z linii i zacisnąć linię.
45. Określ gęstość komórek i pH i zapisz wartości. W przypadku kultur drobnoustrojów przydatne jest rejestrowanie wartości co godzinę. Interwał jest zależny od kultury.
46. Metodologia zbioru zależy od intencji uprawy po zakończeniu wzrostu. W takim przypadku należy pobrać próbkę z hodowli po raz ostatni, aby otrzymać wartości końcowe dotyczące gęstości komórek i możliwego pH lub pomiaru masy mokrych komórek. Otwórz płytę główną, pozostawiając zawartość wyrzuconą w wyznaczonym "zbiorniku do zabijania" z wybielaczem lub innymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi.

Wyniki

Bioreaktorem można sterować z użyciem oprogramowania IRIS lub bez niego. Jednakże w celu rejestracji danych najlepiej jest korzystać z oprogramowania. Przed dodaniem bakterii należy skalibrować czujniki pH i tlenu, ustawić prędkość mieszadła oraz temperaturę. Na Rysunku 2 przedstawiono dane wyjściowe z pracy bioreaktora. Temperatura została ustawiona na 30 °C, a prędkość mieszadła na 200 rpm. Parametry mogą być różne dla każdego eksperymentu, ale przed dodaniem bakterii system powinien znajdować się w stanie stacjonarnym. Na Rysunku 3 pokazano zmianę stężenia tlenu po dodaniu kultury bakteryjnej. Wartości zadane dla tego eksperymentu to 37 °C, mieszadło 200 rpm, O₂ na poziomie 70%. W czasie 19:20 pompa zasilająca podaje kulturę startową bakterii o OD 0,1, co powoduje natychmiastowy spadek poziomu O₂. Bioreaktor reaguje na zmieniający się poziom O₂ poprzez zwiększenie przepływu powietrza i prędkości mieszadła. Wartości zadane dla tych zwiększeń są skonfigurowane w kaskadzie (krok 35). pH w reaktorze było monitorowane w czasie rzeczywistym; wartość pH najpierw spadła, a następnie wzrosła, co obrazują wahania linii pH w czasie (Rysunek 4). Cały przebieg procesu może zostać przeanalizowany, a parametry dostosowane do kolejnych eksperymentów.

Rysunek 1. Bioreaktor laboratoryjny z opisanymi i połączonymi wszystkimi elementami. Na tym rysunku przedstawiono reaktor z mieszadłem na początku procesu. Elementy reaktora są opisane i obejmują czujniki, mieszadło, termometr, butelki do podawania pożywki i pobierania próbek, port wylotowy, manometr ciśnienia powietrza, płaszcz grzewczy, wieżę kondensacyjną oraz panel sterowania.

Rysunek 2. Zrzut ekranu oprogramowania bioreaktora na początku procesu. Na początku procesu w bioreaktorze z mieszadłem ustawiono temperaturę na 30 °C (linia żółta), prędkość obrotową mieszadła na 200 rpm (linia czerwona), pH na 6,5 (linia zielona) oraz pO₂ na 57,2% (linia niebieska). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rysunek 3. Zrzut ekranu z oprogramowania bioreaktora podczas procesu w momencie spadku poziomu tlenu. Gdy hodowla znajduje się w fazie aktywnego wzrostu, zużywa tlen, co prowadzi do zmniejszenia jego ilości w reaktorze (linia niebieska). Poprzez zwiększenie prędkości mieszadła do hodowli można dostarczyć więcej tlenu (linia czerwona). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rysunek 4. Zrzut ekranu oprogramowania bioreaktora pokazujący zmianę pH w czasie. Wartość pH hodowli jest monitorowana w sposób ciągły i w czasie maleje w miarę produkcji kwasu mlekowego, a następnie rośnie po dodaniu zasady do bioreaktora (niebieska linia). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dyskusja

Bioreaktory zbiornikowe z mieszadłem są standardem w branży biotechnologicznej i są stosowane od ponad 40 lat ¹. Mały zbiornik z mieszadłem był ważny dla zwiększania i zmniejszania skali, optymalizacji szczepów, charakterystyki i rozwoju procesów. Może również odgrywać ważną rolę w rozwoju medycyny zindywidualizowanej ². Bioreaktor na małą skalę jest najbardziej zbliżony do warunków wzrostu komórek in situ , ponieważ może być monitorowany i optymalizowany przez cały przebieg. Najczęściej początkowe eksperymenty przeprowadza się przy użyciu kolb wytrząsających, ale warunki panujące w bioreaktorze na małą skalę znacznie różnią się od warunków panujących w kolbie wstrząsającej. W jednym eksperymencie stwierdziliśmy, że warunki optymalnego wzrostu E. coli i produkcji białka zielonej fluorescencji (GFP) w kolbie do wstrząsania nie przekładały się na mieszany zbiornik (dane niepublikowane).

Inne metody hodowli komórek na dużą skalę obejmują butelki rolkowe, jednorazowe bioreaktory z platformą bujaną ³ oraz większe bioreaktory jednorazowego użytku o objętości roboczej od 50 do 5 000 l. Każda metoda wiąże się z wyzwaniami związanymi ze zwiększaniem skali, ale znalazła swoje miejsce w produkcji. Bioreaktor z jednorazową platformą kołyszącą jest podobny do zbiornika z mieszadłem i zapewnia regulowane środowisko. Różni się od zbiornika z mieszadłem tym, że mieszanie następuje w wyniku ruchu kołyszącego w celu wytworzenia fal, aby zapobiec osiadaniu komórek i zapewnić natlenienie. Hydrodynamika dla tej metody różni się od zbiornika z mieszadłem, a maksymalna objętość jest ograniczona do 1 000 l. Różnice mogą wpływać na wzrost komórek i produkcję produktu. Inne systemy jednorazowego użytku łączą zbiornik z mieszadłem z reaktorem jednorazowego użytku, aby zapewnić platformę z minimalną infrastrukturą i powiązanymi kosztami ogólnymi oraz zdolnością do wysokowydajnego bioprzetwarzania ⁴.

Nowi użytkownicy bioreaktorów stacjonarnych mogą mieć problemy z określeniem początkowych wartości zadanych pH,_pO2 i temperatury; Jednak w celu uzyskania tych informacji można odnieść się do opublikowanych badań ^{5, 6, 7, 8, 9}. W szczególności w przypadku kultur bakteryjnych zaleca się rozpoczęcie mieszania z tą samą prędkością co kolba wytrząsarska i temperaturą przy tej samej wartości zadanej. Jako punkt wyjścia można również wykorzystać pH kultury z poprzednich cykli wytrząsania. Ustalenie wartości pO₂ jest trudniejsze i zwykle jest określane empirycznie. Jednak rozpoczęcie od 50% pO₂ jest zalecanym punktem wyjścia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rosół LB	Sigma	L3022
ampicylina	Sigma	A1593-25G
Rosół LB	Sigma	L3022
przeciwpieniący 204	Sigma	A8311
1 M Wodorotlenek sodu	Sigma	38215-1EA-R
Bufor referencyjny, pH 4,00	Sigma	B5020
Odniesienie Bufor o pH 7,00	Sigma	B4770
Elektrolit sondy pO2	Broadley James	AS-3140-C30-0025
Filtr 0,45 mikrona	Cole Parmer	EW-02915-22
Filtr 0,22 mikrona	Cole Parmer	EW-29950-40
Strzykawka Luer Lock, 10 ml	Cole Parmer	EW-07940-12
Bioreaktor Minifors	Infors HT	B-Pack 5.0
Pompa powietrza Air Admiral	Cole Parmer	EW-79202-00
1175 PD Cyrkulator chłodzący	VWR	13721-204