Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbki proteomicznej z tkanki utrwalonej formaliną i zatopionej w parafinie

28.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50589

⸱

2 września 2013

1Department of Proteomics and Signal Transduction, Max Planck Institute of Biochemistry

W tym artykule

Podsumowanie

Archiwalne próbki kliniczne z utrwalonego formaliny i zatopionej w parafinie (FFPE) są cennym materiałem do badania chorób. W tym miejscu demonstrujemy proces przygotowania próbki, który pozwala na dogłębną analizę proteomiczną mikrowypreparowanej tkanki FFPE.

Streszczenie

Zachowany materiał kliniczny jest unikalnym źródłem do badań proteomicznych ludzkich zaburzeń. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół umożliwiający analizę ilościową na dużą skalę tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE). Procedura składa się z czterech odrębnych etapów. Pierwszym z nich jest przygotowanie skrawków z materiału FFPE i mikrodysekcja interesujących nas komórek. W drugim etapie wyizolowane komórki są poddawane lizie i przetwarzane przy użyciu techniki "przygotowania próbki wspomaganej filtrem" (FASP). Na tym etapie białka są usuwane z odczynników używanych do lizy próbki i są trawione w dwóch etapach przy użyciu endoproteinazy LysC i trypsyny.

Po każdym trawieniu, peptydy są zbierane w oddzielnych frakcjach, a ich zawartość jest określana za pomocą bardzo czułego pomiaru fluorescencji. Na koniec peptydy są frakcjonowane na mikrokolumnach typu "końcówka pipety". Peptydy LysC są rozdzielane na 4 frakcje, podczas gdy peptydy tryptyczne są rozdzielane na 2 frakcje. W ten sposób przygotowane próbki pozwalają na analizę proteomów od niewielkich ilości materiału do głębokości 10 000 białek. W związku z tym opisany przepływ pracy jest potężną techniką badania chorób w sposób ogólnosystemowy, a także identyfikacji potencjalnych biomarkerów i celów leków.

Wprowadzenie

Utrwalanie za pomocą paraformaldehydu i zatapianie w parafinie (FFPE) jest standardową metodą konserwacji i badań patomorfologicznych materiału tkankowego. Mikroskopia zachowanej tkanki pozwala na identyfikację zmian morfologicznych związanych z chorobą oraz wykrycie i ocenę występowania antygenów związanych z chorobą. Ponieważ zazwyczaj tylko niewielka część próbki FFPE jest wykorzystywana w tych analizach, duże ilości materiału klinicznego pozostają zarchiwizowane i mogą być wykorzystane w innych typach badań.

W ciągu ostatniej dekady badania w dziedzinie nauk przyrodniczych zostały wzmocnione przez potężną technologię proteomiczną. Technologia ta umożliwia identyfikację i ilościowe określenie tysięcy białek w złożonych mieszaninach białkowych. Ważną cechą tej technologii jest to, że do analiz na dużą skalę potrzebne są tylko niewielkie ilości materiału. Ostatnie badania proteomiczne wykazały, że białka można badać w skali prawie kompletnych proteomów 1, 2. Tego typu badania umożliwiają ogólnosystemowy wgląd w skład komórek i identyfikację grup białek występujących na nieprawidłowych poziomach w chorobach. Podczas gdy badania te wymagały dużych zdolności w zakresie spektrometrii mas, ostatnie prace wykazały, że podobny zakres identyfikacji można osiągnąć w ciągu jednego dnia od pomiaru 3.

Wymóg stosunkowo niskiej ilości próbek i szeroka dostępność zachowanych próbek klinicznych skusiły nas i innych do opracowania metod umożliwiających proteomiczną eksplorację materiału FFPE (przegląd patrz 4). Wykorzystując odwracalność utrwalania formaliny pod wpływem obróbki cieplnej, opracowaliśmy protokół umożliwiający ilościową ekstrakcję białek z utrwalonej tkanki 5. Wykazaliśmy, że procedura utrwalania zachowuje nie tylko białka, ale także przynajmniej niektóre modyfikacje potranslacyjne. Fosforylację i N-glikozylację można badać przy użyciu próbek FFPE 5, jednak warunkiem wstępnym jest dokładnie kontrolowane warunki pobierania, przechowywania i utrwalania tkanek. Następnie zoptymalizowaliśmy metodę mikrodysekcji utrwalonej tkanki wychwytu laserowego oraz przetwarzania próbek w oparciu o reaktor proteomiczny 6, 7. Zakrojone na szeroką skalę badania nad rakiem jelita grubego pozwoliły na analizę ilościową 7500 białek pochodzących z mikrowypreparowanego materiału klinicznego 8. Wreszcie, ulepszyliśmy sposób eksploracji mikropreparowanego materiału, stosując sekwencyjny dwuetapowy protokół trawienia białek 9. W porównaniu z powszechnymi strategiami trawienia wykorzystującymi pojedynczy enzym, procedura ta umożliwia wytwarzanie peptydów o większej liczbie unikalnych sekwencji, a w konsekwencji skutkuje większą głębokością identyfikacji białek. Analiza mikrowypreparowanego ludzkiego gruczolaka jelita grubego pozwoliła na analizę proteomiczną do głębokości 9500 białek na próbkę 3. W tym badaniu zmapowaliśmy 55 000 peptydów na próbkę, co pozwoliło na identyfikację 88-89% białek z co najmniej 2 peptydami. W niniejszym artykule przedstawiamy zoptymalizowany protokół przygotowania próbek z materiału FFPE do analizy LC-MS/MS. Protokół ten obejmuje przygotowanie wycinków tkanek do mikrodysekcji, lizę wyizolowanych komórek oraz przetwarzanie próbki w formacie reaktora (FASP) 6. Następnie opisujemy spektrofluorometryczne oznaczanie wydajności peptydów; Jest to zadanie o dużym znaczeniu dla optymalnej identyfikacji peptydów za pomocą spektrometrii mas. Na koniec demonstrujemy technikę separacji opartą na silnym wymieniaczu anionowym (SAX) do frakcjonowania peptydów. W tej metodzie zarówno separacja peptydów, jak i końcowe oczyszczanie są przeprowadzane za pomocą mikrokolumn 10, 11 z końcówkami pipet. Ten etap jest opcjonalny, ale jest zalecany w badaniach, w których można uzyskać więcej niż kilka peptydów mikrogramowych z jednej próbki. Frakcjonowanie SAX może znacznie zwiększyć liczbę i zakres dynamiczny identyfikacji oraz rozszerzyć pokrycie sekwencji białek 3, 10.

Protokół

1. Wymagana aparatura

  1. Przygotowanie skrawków tkanki do mikrosekcji i lizy próbek
    1. Blok grzejny ustawiony na 99 °C lub kąpiel w wrzącej wodzie.
    2. Laserowy mikrosekcjoner (na przykład PALM, Zeiss, Göttingen, Niemcy).
    3. Kompaktowa wirówka z termostatem, temperatura ustawiona na 20 °C.
    4. Wilgotna komora (pojemnik) ze statywem na probówki do utylizacji typu Eppendorf.
    5. Inkubator ustawiony na 37 °C.
    6. Spektrofluorometr umożliwiający pomiar fluorescencji wzbudzanej światłem bliskim UV z wykorzystaniem mikrokwartowych kuwet (0.1-0.2 ml).

2. Roztwory

  1. Bufor do lizy tkanek ('Tissue Lysis Buffer', TLB): 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 M DTT, 0.5% (w/v) glikolu polietylenowego 20 000 oraz 4% SDS.
  2. Roztwór UA: 8 M mocznika w 0.1 M Tris-HCl pH 8.5. Przygotować 1 ml na 1 próbkę. Roztwory UA i IAA muszą być przygotowane na świeżo i wykorzystane w ciągu jednego dnia.
  3. Roztwór IAA: 0.05 M jodooctanu w UA. Przygotować 0.1 ml na 1 próbkę.
  4. Endoproteinaza Lys-C, roztwór stokowy.
  5. Trypsyna, roztwór stokowy.
  6. Bufor do trawienia ('Digestion buffer', DB): 0.05 M Tris-HCl pH 8.5. Przygotować 0.25 ml na 1 próbkę.
  7. Standardowy roztwór tryptofanu ('Tryptophan Standard Solution'): 0.1 μg tryptofanu w 1 ml wody dejonizowanej.
  8. Bufor do analizy B ('Assay buffer B', ABB): 10 mM Tris-HCl, pH 7.6.
  9. Roztwór stokowy uniwersalnego buforu Brittona i Robinsona (BRUB). Przygotować roztwór zawierający 0.1 M CH3COOH, 0.1 M H3PO4 oraz 0.1 M H3BO3 i dostosować za pomocą 1 M NaOH do wymaganego pH (2, 4, 5, 6 i 11). Przed użyciem rozcieńczyć 5-krotnie wodą dejonizowaną.
  10. Bufor A: 1% (v/v) CH3COOH w wodzie dejonizowanej.
  11. Bufor B: 60% (v/v) CH3CN, 1% (v/v) CH3COOH w wodzie dejonizowanej.

3. Końcówki do pipet i kolumny „StageTip”

  1. Przygotować kolumnę z końcówki SAX, układając 6 warstw membrany Empore- Anion w zwykłej końcówce do pipety o pojemności 0.2 ml. Wykonać dwie kolumny SAX-tip na każdą próbkę.
  2. Przygotować „StageTip”, układając 3 warstwy Empore-C18 w końcówce do pipety o pojemności 0.2 ml. Przygotować 6 końcówek StageTip dla każdej próbki.

4. Przygotowanie skrawków tkankowych do mikrosekcji i lizy próbek

  1. Przygotować skrawki za pomocą mikrotomu (grubość plastrów zależy od próbki; zazwyczaj mikrodyssekcja przebiega pomyślnie przy grubości 7-10 μm).
  2. Naświetlać szkiełka membranowe (MembraneSlide 1.0 PEN) światłem UV przez 45 min.
  3. Nanieść skrawki na naświetlone szkiełka membranowe i suszyć w temperaturze 37 °C przez 2 hr.
  4. Odparafinować naniesione skrawki poprzez dwie następujące po sobie inkubacje w ksylenie przez 2,5 min i 1,5 min. Nawodnić skrawki poprzez kolejne inkubacje w etanolu absolutnym, 70% etanolu i wodzie, każdorazowo przez 1 min.
  5. Zabarwić skrawki hematoksyliną Mayera przez 20 sec, płukać wodą przez 1 min i suszyć na powietrzu.
  6. Zebrać interesującą populację komórek przy użyciu systemu laserowej mikrodysekcji. Podczas korzystania z urządzenia PALM (Zeiss) zbierać próbki do nakrętek adhezyjnych (Adhesive CAP 200).
  7. Nanieść pipetą alikwot buforu TLB na materiał poddany mikrodysekcji w nakrętce. Zamknąć probówkę i zebrać zawiesinę poprzez krótkie wirowanie. Lizować mikrodysekcjonowaną tkankę w temperaturze 99 °C w bloku grzejnym z mieszaniem (600 rpm) przez 1 hr. Należy użyć 3 μl buforu na 10 nl mikrodysekcjonowanej tkanki.
  8. Oczyścić ekstrakt surowy poprzez wirowanie przy 16,000 x g w temperaturze 18 °C przez 10 min. Lizat można przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.

5. Przetwarzanie próbek

  1. W jednostkach do ultrafiltracji (Forensic 30k) wymieszać do 50 μl klarownego lizatu z 200 μl UA i wirować przy 14,000 x g, aż w filtrze pozostanie mniej niż 10 μl roztworu. Zazwyczaj ten etap wymaga wirowania przez 10-15 min.
  2. Do jednostki do ultrafiltracji pipetować 200 μl UA i wirować zgodnie z opisem w punkcie 5.1. Opróżnić probówkę zbiorczą.
  3. Pipetować 50 μl roztworu IAA, mieszać przy 600 rpm w termomikserze przez 1 min, a następnie wirować zgodnie z opisem w punkcie 5.1.
  4. Do jednostki do ultrafiltracji pipetować 100 μl UA i wirować zgodnie z opisem w punkcie 5.1. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.
  5. Do jednostki do ultrafiltracji pipetować 100 μl DB i wirować zgodnie z opisem w punkcie 5.1. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.
  6. Przenieść jednostki filtracyjne do nowych probówek zbiorczych. Pipetować 40 μl DB z endoproteinazą Lys-C (stosunek proteinazy do całkowitej ilości białka 1:100) i mieszać przy 600 rpm w termomikserze przez 1 min. Inkubować jednostki w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 18 hr.
  7. Wirować jednostki filtracyjne przy 14,000 x g, analogicznie jak w punkcie 5.1.
  8. Pipetować 160 μl wody dejonizowanej i wirować jednostki filtracyjne zgodnie z opisem w punkcie 5.1. Połączony filtrat (z etapów 5.7 i 5.8) zawiera peptydy uwolnione przez endoproteinazę Lys C.
  9. Przenieść jednostkę do ultrafiltracji do nowej probówki zbiorczej. Dodać 40 μl DB z trypsyną (stosunek enzymu do białka 1:100) i mieszać przy 600 rpm w termomikserze przez 1 min. Inkubować jednostki w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 4 hr. Powtórzyć kroki 5.7 i 5.8, aby zebrać peptydy tryptyczne.

6. Oznaczanie ilościowe peptydów

  1. Pomiar zawartości peptydów w hydrolizatach białek można przeprowadzić w rozcieńczonym buforze, ponieważ reszty tryptofanu są dobrze dostępne dla rozpuszczalnika.
  2. Do kuwety kwarcowej pipetujemy 0,2 ml ABB i rejestrujemy widmo emisji dla „próbki ślepej”.
  3. Przygotowujemy krzywą kalibracyjną w krokach 0,1 μg, dodając do kuwety 1 μl aliquotów TSS i delikatnie mieszając z ABB.
  4. Kuwetę należy oczyścić.
  5. Pipetujemy próbkę i rejestrujemy widmo (próbka).
  6. Obliczenie stężenia białek i peptydów
    Ponieważ 0,1 μg tryptofanu odpowiada około 9 μg białka (na podstawie średniej zawartości tryptofanu wynoszącej 1,1% w mieszaninach białek otrzymanych z lizy ludzkich komórek), zawartość białka w próbce lub zawartość peptydów w hydrolizacie wynosi:
    Równanie ilościowe peptydów (μg), formuła do analizy danych eksperymentalnych, obliczenia laboratoryjne.
    gdzie F(Standard1) to fluorescencja standardu 0,1 μg tryptofanu. Zawartość peptydów pozwala na obliczenie wydajności procedury trawienia i dostarcza kluczowych informacji dla następującego po niej frakcjonowania peptydów oraz analizy spektrometrią mas.

7. Frakcjonowanie peptydów trawionych Lys-C i trypsyną

  1. Rozcieńczyć roztwory peptydów otrzymane po trawieniu za pomocą Lys-C i trypsyny odpowiednio 0,2 ml BRUB pH 11 oraz pH 5.
  2. Zamontować kolumnę typu tip SAX w pokrywie adaptera do probówki do wirowania.
  3. Przemyć i zrównoważyć kolumnę typu tip SAX kolejno 0,1 ml metanolu, 0,1 ml 1 M NaOH oraz 3 razy 0,1 ml BRUB pH 11 w przypadku rozdziału peptydów Lys-C i BRUB pH 5 w przypadku peptydów trypsynowych. Przepływ roztworów przez materiał kolumny ułatwić poprzez wirowanie przy 4,000 x g.
  4. Przemyć i zrównoważyć C18-'StageTips' kolejno 0,05 ml metanolu, następnie 0,05 ml Buforu B oraz 0,05 ml Buforu A. Przygotować sześć C18-'StageTips': 4 do rozdziału peptydów Lys-C i dwa do rozdziału peptydów trypsynowych.
  5. Zamontować kolumnę typu tip SAX w C18-'StageTip'. Nanieść roztwory próbek na zrównoważone kolumny typu tip SAX i wirować kolumny przy 5,000 x g przez 3 min.
  6. Zrównoważyć kolumny typu 'pipette-tip' odpowiednio 0,1 ml BRUB pH 11 lub pH 5 dla próbek Lys-C i trypsynowych. Przepływ ułatwić poprzez wirowanie przy 5,000 x g.
  7. Przenieść kolumnę typu tip SAX do kolejnego C18-'StageTip'.
  8. Kontynuować elucję peptydów za pomocą BRUB pH 6, 4 i 2 dla próbki Lys-C oraz BRUB pH 2 dla próbki z peptydami trypsynowymi. Dla każdego etapu elucji użyć oddzielnego C18-'StageTip'.
  9. Przemyć C18-'StageTips' 0,05 ml Buforu A.
  10. Eluować frakcje 0,05 ml Buforu B do fiolek używanych bezpośrednio do wstrzykiwania próbek do systemu LC połączonego ze spektrometrem mas.

Wyniki

Analiza proteomiczna materiału FFPE wymaga solidnych i powtarzalnych metod przygotowania próbek. W niniejszej publikacji prezentujemy protokół umożliwiający efektywną izolację populacji komórek z utrwalonego materiału oraz ich obróbkę chemiczną, co pozwala na uzyskanie wysokiej czystości frakcji peptydowych, które mogą być bezpośrednio wykorzystane do analizy LC-MS/MS. Procedura składa się z czterech odrębnych części: (1) przygotowania skrawków próbek FFPE i ich mikrosekcji, (2) lizy próbki i obróbki białek z wykorzystaniem podejścia MED FASP, (3) oznaczania ilościowego oraz (4) frakcjonowania peptydów (Rycina 1).

W pierwszym kroku procedury próbki FFPE są cięte mikrotomem i osadzane na szkiełkach pokrytych membraną. Aby zwiększyć adhezję między skrawkami tkanki a powierzchnią szkiełka, konieczne jest naświetlenie powierzchni szkiełka światłem UV. W tym celu wykorzystujemy światło lampy UV zintegrowanej z komorą do hodowli komórkowej. Po tym kroku szkiełka poddawane są przemywaniu w celu usunięcia parafiny i rehydratacji próbek. Zrehydratowany materiał barwi się hematoksyliną przez krótki czas. Powoduje to słabe zabarwienie próbki, co jest jednak wystarczające do wizualizacji obszarów próbki przeznaczonych do mikrodysekcji. Proces barwienia należy szybko przerwać, płucząc szkiełka nadmiarem wody. Przedłużone barwienie próbki prowadzi do niskiej wydajności uzyskiwanych peptydów.

W następnym kroku wysuszone skrawki poddawane są mikrodysekcji. Wybór obszarów tkankowych poszczególnych komórek zależy od rodzaju badania i zawsze wymaga specjalistycznej wiedzy z zakresu histologii lub patomorfologii. Materiał uwolniony za pomocą lasera jest zbierany na powierzchniach klejących probówek do zbierania próbek. Ponieważ pojemność wiążąca materiału klejącego jest ograniczona, po mikrodysekcji każdych 3-5 mm2 próbki konieczne jest przeniesienie wyizolowanego materiału z zakrętki do probówki. Można to łatwo wykonać, pipetując kilka mikrolitrów buforu do lizy tkanek (LTB) na zakrętkę i krótko wirując probówkę w wirówce. Po zebraniu próbki na dnie probówki można kontynuować mikrodysekcję i zbieranie materiału na zakrętce. Po zebraniu całej próbki probówki należy dodatkowo zabezpieczyć Parafilmem i inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze około 99 °C przy ciągłym mieszaniu przez 1 hr. Ponieważ podczas inkubacji na zakrętce skrapla się woda, co 15 min należy krótko wirować probówki, aby zebrać wodę z powrotem w stożku probówki.

W celu uzyskania peptydów lizaty tkankowe są przetwarzane przy użyciu metody MED-FASP. W tej metodzie z lizowanych białek usuwa się detergent oraz inne substancje o niskiej masie cząsteczkowej, przeprowadza karboamidometylowanie pozostałości cysteiny, a następnie wykonuje następujące po sobie trawienia dwoma enzymami o różnej specyficzności cięcia: endoproteinazą LysC oraz trypsyną. Po każdym etapie trawienia peptydy są zbierane w oddzielne frakcje. W tej części przygotowania próbki ważne jest kontynuowanie każdego z etapów wirowania do momentu, aż przez membranę przejdzie ponad 95% roztworu początkowo załadowanego do jednostki filtracyjnej. Analizując tkankę jelita grubego oraz nowotwór tej tkanki, zaobserwowaliśmy, że procedura ta daje od 3-6 μg peptydu na 100 nl (100 μg tkanki lub 10 mm2 skrawka o grubości 10 μm) materiału mikrodissekcyjnego (Tabela 1). Ponieważ całkowita ilość białka możliwego do wyekstrahowania z tkanek stanowi około 10% masy tkanki, procedury ekstrakcji i trawienia łącznie dają wydajność na poziomie 30-60% w stosunku do pierwotnej świeżej tkanki. Wartości te odzwierciedlają straty białka podczas dehydratacji i barwienia, mikrodissekcji oraz zatrzymanie części niestrawionej próbki w jednostkach ultrafiltracyjnych. Ponieważ ekstrakcja i przetwarzanie tkanki FFPE bez mikrodissekcji skutkowały wydajnością konwersji białka na peptyd na poziomie 75% 5, prawdopodobne jest, że krytyczne straty próbek występują na etapach poprzedzających MED-FASP. Ważną cechą mieszanin peptydowych otrzymywanych tą procedurą jest ich wysoka czystość, która ułatwia dalszy proces frakcjonowania peptydów oraz identyfikację metodą spektrometrii mas. Zostało to niedawno wykazane w analizie próbek gruczolaków jelita grubego 3. W tym badaniu około 40% zdarzeń MS/MS doprowadziło do identyfikacji peptydów z tkanki FFPE i skutkowało zmapowaniem do 17 000 peptydów w jednym przebiegu LC-MS/MS. Wyższe wskaźniki identyfikacji osiągnięto jedynie w analizie mrożonych komórek hodowanych in vitro 3.

W dwóch ostatnich częściach całej procedury wyizolowane peptydy są oznaczane ilościowo i frakcjonowane na mikrokolumnach z końcówek pipet. Ponieważ ilości peptydów wyizolowanych z tkanki poddanej mikrosekcji są niższe niż 10 μg, nie można ich oznaczyć ilościowo przy użyciu powszechnie stosowanych testów białkowych opartych na barwnikach. Ponadto pomiary widma UV przy A280 w tych stężeniach nie są użyteczne ze względu na efekt rozpraszania światła. W przeciwieństwie do tego, pomiary fluorescencji reszt tryptofanu oferują niezawodną metodę oznaczenia zawartości peptydów.

Niedawno wykazaliśmy, że w ramach jednej 4-godzinnej analizy LC-MS/MS („single shot”) można zidentyfikować do 5 000 białek z hodowli komórkowych 7. Jednakże ten rodzaj analizy zastosowany do tkanek natywnych rzadko pozwala na identyfikację więcej niż 3 000 białek. Aby zwiększyć głębokość analizy, peptydy uzyskane metodą MED FASP muszą zostać poddane frakcjonowaniu przed analizą LC-MS/MS. Separacja na mikrokolumnach oparta na SAX jest prostą i wydajną metodą frakcjonowania 10. Została ona zastosowana już w kilku badaniach proteomicznych, w tym w tych analizujących utrwalone tkanki 5, 8, 9. Mikrokolumny SAX w końcówkach do pipet oraz kolumny odsalające C18 „StageTip” 9 są łatwe do przygotowania. Kolumny składa się poprzez układanie wkładów, wyciętych z membran SAX lub C18, w końcówce do pipety o pojemności 200 μl 11. Przykłady analizy próbek FFPE frakcjonowanych metodą SAX przedstawiono w Tabeli 1.

Schemat mikrodysekcji próbki, przetwarzania MED-FASP, oznaczania stężenia peptydów i frakcjonowania SAX.
Rycina 1. Przegląd procedury. Procedura składa się z czterech odrębnych części: (1) przygotowania skrawków z próbek FFPE i ich mikrodysekcji, (2) lizy próbki i przetwarzania białek z wykorzystaniem metody MED FASP oraz (3) oznaczania ilości i (4) frakcjonowania peptydów.

PróbkaPrzedfrakcjonowanie / trawienie próbkiWykorzystany spektrometr masowyWydajność peptydów ng / nL próbki (±SD)Liczba unikalnych zidentyfikowanych białek na jedną próbkęBibliografia
•Gruczolakowrak
•Normalna błona śluzowa okrężnicy 		SAX/jeden enzymOrbitrap -Velos36±11 (n = 8)
30±8 (n = 8)		5,985±54
5,868±110		8
•Gruczolak jelita grubegoSAX/dwa enzymyQ Exactive56±6,1 (n = 3)9,501±283

Tabela 1. Reprezentatywne wyniki analiz proteomicznych mikrozdyssekcjowanej tkanki FFPE.

Dyskusja

Możliwość badania materiału FFPE za pomocą technologii proteomicznej na głębokość porównywalną z technikami sekwencjonowania kwasów nukleinowych i mikromacierzy otwiera nowe perspektywy w odkrywaniu biomarkerów i celów leków. Opisany protokół umożliwia charakterystykę i ocenę ilościową proteomów populacji mikrowypreparowanych komórek w skali 10 000 białek. Przy użyciu mniejszej ilości materiału z mikropreparacji można wygenerować mniejsze zestawy danych, ale być może w wielu przypadkach mogą one również dostarczyć cennych danych klinicznych. Dzięki temu albo próbki mogą być analizowane bezpośrednio po procedurze MED-FASP, albo mogą być rozdzielane na mniejsze frakcje. Ponieważ procedura FASP jest kompatybilna z każdym typem proteazy, inne enzymy lub ich kombinacja mogą być stosowane z trawienia białek 6.

Jakość materiału FFPE wydaje się być najbardziej krytyczną kwestią w analizie. Doświadczyliśmy, że utrwalona tkanka tego samego pochodzenia, ale pochodząca z różnych klinik, miała różne właściwości. Korzystając z tkanki z jednego źródła, byliśmy w stanie wygenerować peptydy z dużą wydajnością, podczas gdy podobny materiał z innej kliniki był prawie bezużyteczny. Jest prawdopodobne, że zastosowane procedury utrwalania i zatapiania oraz warunki przechowywania są głównymi czynnikami wpływającymi na właściwości materiału klinicznego 12. Dlatego wskazane jest przetestowanie właściwości kilku próbek przed rozpoczęciem większego projektu.

W wielu publikacjach informowano o wykorzystaniu materiałów FFPE w przeszłości. Jednak liczba białek zidentyfikowanych w tych badaniach nigdy nie przekraczała 1000-2000 białek 4. Biorąc pod uwagę rozmiar proteomów specyficznych dla komórek ludzkich, składających się z ponad 10 000 białek, takie badania były w stanie dostarczyć tylko bardzo powierzchownego obrazu, prawie ograniczonego do bardzo obfitych białek zaangażowanych w funkcje porządkowe. Nasz protokół umożliwia skuteczną izolację materiału klinicznego lub biologicznego od zakonserwowanej tkanki i jest zoptymalizowany pod kątem lizy, przetwarzania białek i wstępnej frakcjonowania peptydów. W związku z tym nasz proces przygotowania próbek, w połączeniu z wysokiej klasy spektrometrią mas, umożliwia wgląd w prawie kompletne proteomy. Warto zauważyć, że jest to możliwe przy minimalnych wymaganiach dotyczących ilości próbki.

Główną zaletą stosowania zachowanych tkanek jest ich relatywnie szeroka dostępność. Próbki FFPE archiwizowane przez wiele lat i dekad, a czasem uważane za bezużyteczne, teraz, dzięki technologii proteomicznej, pojawiają się jako bardzo cenny materiał do badań klinicznych. Podczas gdy wiele chorób można badać przy użyciu świeżego lub mrożonego materiału, badanie materiału FFPE wydaje się być szczególnie ważne dla badania chorób rzadkich 12, gdzie pobranie reprezentatywnego zestawu próbek jest zwykle długotrwałe.

Oświadczenia

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

Autor dziękuje dr Matthiasowi Mannowi za ciągłe wsparcie oraz Pani Katharinie Zettl za demonstrację metody.

Ta praca była wspierana przez Max-Planck Society for the Advancement of Science.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MembraneSlide 1.0 PENCarl-Zeiss Microscopy GmBH, Göttingen, Niemcy415190-9041-000
Samoprzylepna nasadka 200 nieprzezroczystaCarl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Niemcy415190-9181-000
Roztwór hematoksyny Mayera Sigma-Aldrich St. Louis, MOMHS32
Forensic 30k Merck Millipore Darmstadt, NiemcyMRCF0R030(Wcześniej sprzedawany jako Microcon YM-30)
Empore AnionBioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN2252
Empore C18Technologie bioanalityczne 3M Company ST. Paul, MN2215
Trypsin Promega2014-06-27
Endoproteinaza Lys-CWako129-02541

Bibliografia

  1. Nagaraj, N., et al. Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line. Molecular systems biology. 7, 548(2011).
  2. Beck, M., et al. The quantitative proteome of a human cell line. Molecular systems biology. 7, 549(2011).
  3. Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics. Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).
  4. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  5. Ostasiewicz, P., et al. Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry. J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).
  6. Wisniewski, J. R., et al. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature. 6 (5), 359-362 (2009).
  7. Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers. Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).
  8. Wisniewski, J. R., et al. Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma. Mol. Syst. Biol. 8, 611(2012).
  9. Wisniewski, J. R., Mann, M. Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis. Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).
  10. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome. J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).
  11. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).
  12. Thompson, S. M., et al. Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Proteomics Clin. Appl. , (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

tkanka FFPEtechnika mikrodyssekcjiprzygotowanie pr bek z pomoc filtr wfrakcjonowanie peptyd wtrawienie endoproteinazfluorescencja tryptofanusilna wymiana anionowako c wki Stage Tip C18proteomika ilo ciowa
Przygotowanie próbki proteomicznej z tkanki utrwalonej formaliną i zatopionej w parafinie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.