Przygotowanie próbki proteomicznej z tkanki utrwalonej formaliną i zatopionej w parafinie

Podsumowanie

Archiwalne próbki kliniczne z utrwalonego formaliny i zatopionej w parafinie (FFPE) są cennym materiałem do badania chorób. W tym miejscu demonstrujemy proces przygotowania próbki, który pozwala na dogłębną analizę proteomiczną mikrowypreparowanej tkanki FFPE.

Streszczenie

Zachowany materiał kliniczny jest unikalnym źródłem do badań proteomicznych ludzkich zaburzeń. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół umożliwiający analizę ilościową na dużą skalę tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE). Procedura składa się z czterech odrębnych etapów. Pierwszym z nich jest przygotowanie skrawków z materiału FFPE i mikrodysekcja interesujących nas komórek. W drugim etapie wyizolowane komórki są poddawane lizie i przetwarzane przy użyciu techniki "przygotowania próbki wspomaganej filtrem" (FASP). Na tym etapie białka są usuwane z odczynników używanych do lizy próbki i są trawione w dwóch etapach przy użyciu endoproteinazy LysC i trypsyny.

Po każdym trawieniu, peptydy są zbierane w oddzielnych frakcjach, a ich zawartość jest określana za pomocą bardzo czułego pomiaru fluorescencji. Na koniec peptydy są frakcjonowane na mikrokolumnach typu "końcówka pipety". Peptydy LysC są rozdzielane na 4 frakcje, podczas gdy peptydy tryptyczne są rozdzielane na 2 frakcje. W ten sposób przygotowane próbki pozwalają na analizę proteomów od niewielkich ilości materiału do głębokości 10 000 białek. W związku z tym opisany przepływ pracy jest potężną techniką badania chorób w sposób ogólnosystemowy, a także identyfikacji potencjalnych biomarkerów i celów leków.

Wprowadzenie

Utrwalanie za pomocą paraformaldehydu i zatapianie w parafinie (FFPE) jest standardową metodą konserwacji i badań patomorfologicznych materiału tkankowego. Mikroskopia zachowanej tkanki pozwala na identyfikację zmian morfologicznych związanych z chorobą oraz wykrycie i ocenę występowania antygenów związanych z chorobą. Ponieważ zazwyczaj tylko niewielka część próbki FFPE jest wykorzystywana w tych analizach, duże ilości materiału klinicznego pozostają zarchiwizowane i mogą być wykorzystane w innych typach badań.

W ciągu ostatniej dekady badania w dziedzinie nauk przyrodniczych zostały wzmocnione przez potężną technologię proteomiczną. Technologia ta umożliwia identyfikację i ilościowe określenie tysięcy białek w złożonych mieszaninach białkowych. Ważną cechą tej technologii jest to, że do analiz na dużą skalę potrzebne są tylko niewielkie ilości materiału. Ostatnie badania proteomiczne wykazały, że białka można badać w skali prawie kompletnych proteomów ^{1, 2}. Tego typu badania umożliwiają ogólnosystemowy wgląd w skład komórek i identyfikację grup białek występujących na nieprawidłowych poziomach w chorobach. Podczas gdy badania te wymagały dużych zdolności w zakresie spektrometrii mas, ostatnie prace wykazały, że podobny zakres identyfikacji można osiągnąć w ciągu jednego dnia od pomiaru ³.

Wymóg stosunkowo niskiej ilości próbek i szeroka dostępność zachowanych próbek klinicznych skusiły nas i innych do opracowania metod umożliwiających proteomiczną eksplorację materiału FFPE (przegląd patrz ⁴). Wykorzystując odwracalność utrwalania formaliny pod wpływem obróbki cieplnej, opracowaliśmy protokół umożliwiający ilościową ekstrakcję białek z utrwalonej tkanki ⁵. Wykazaliśmy, że procedura utrwalania zachowuje nie tylko białka, ale także przynajmniej niektóre modyfikacje potranslacyjne. Fosforylację i N-glikozylację można badać przy użyciu próbek FFPE ⁵, jednak warunkiem wstępnym jest dokładnie kontrolowane warunki pobierania, przechowywania i utrwalania tkanek. Następnie zoptymalizowaliśmy metodę mikrodysekcji utrwalonej tkanki wychwytu laserowego oraz przetwarzania próbek w oparciu o reaktor proteomiczny ^{6, 7}. Zakrojone na szeroką skalę badania nad rakiem jelita grubego pozwoliły na analizę ilościową 7500 białek pochodzących z mikrowypreparowanego materiału klinicznego ⁸. Wreszcie, ulepszyliśmy sposób eksploracji mikropreparowanego materiału, stosując sekwencyjny dwuetapowy protokół trawienia białek ⁹. W porównaniu z powszechnymi strategiami trawienia wykorzystującymi pojedynczy enzym, procedura ta umożliwia wytwarzanie peptydów o większej liczbie unikalnych sekwencji, a w konsekwencji skutkuje większą głębokością identyfikacji białek. Analiza mikrowypreparowanego ludzkiego gruczolaka jelita grubego pozwoliła na analizę proteomiczną do głębokości 9500 białek na próbkę ³. W tym badaniu zmapowaliśmy 55 000 peptydów na próbkę, co pozwoliło na identyfikację 88-89% białek z co najmniej 2 peptydami. W niniejszym artykule przedstawiamy zoptymalizowany protokół przygotowania próbek z materiału FFPE do analizy LC-MS/MS. Protokół ten obejmuje przygotowanie wycinków tkanek do mikrodysekcji, lizę wyizolowanych komórek oraz przetwarzanie próbki w formacie reaktora (FASP) ⁶. Następnie opisujemy spektrofluorometryczne oznaczanie wydajności peptydów; Jest to zadanie o dużym znaczeniu dla optymalnej identyfikacji peptydów za pomocą spektrometrii mas. Na koniec demonstrujemy technikę separacji opartą na silnym wymieniaczu anionowym (SAX) do frakcjonowania peptydów. W tej metodzie zarówno separacja peptydów, jak i końcowe oczyszczanie są przeprowadzane za pomocą mikrokolumn ^{10, 11} z końcówkami pipet. Ten etap jest opcjonalny, ale jest zalecany w badaniach, w których można uzyskać więcej niż kilka peptydów mikrogramowych z jednej próbki. Frakcjonowanie SAX może znacznie zwiększyć liczbę i zakres dynamiczny identyfikacji oraz rozszerzyć pokrycie sekwencji białek ^{3, 10}.

Protokół

1. Wymagane oprzyrządowanie

1. Przygotowanie wycinków tkanek do mikrodysekcji i lizy próbki
   1. Termoblok ustawiony na 99 °C lub kąpiel z wrzącą wodą.
   2. Mikrodysektor operacyjny laserem (np. PALM, Zeiss, Getynga, Niemcy).
   3. Wirówka stołowa z termostatem, temperatura ustawiona na 20 °C.
   4. Komora mokra (skrzynka) ze stojakiem na rurki do utylizacji typu Eppendorf.
   5. Inkubator ustawiony na 37 °C.
   6. Spektrofluorometr umożliwiający pomiar fluorescencji wzbudzonej w pobliżu światła UV za pomocą mikroskalowych kuwet kwarcowych (0,1-0,2 ml).

2. Rozwiązania

1. "Bufor do lizy tkanek" (TLB): 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M DTT, 0,5% (w/v) glikolu polietylenowego 20 000 i 4% SDS.
2. Roztwór UA: 8 M mocznik w 0,1 M Tris-HCl pH 8,5. Przygotować 1 ml na 1 próbkę. Roztwory UA i IAA muszą być przygotowane na świeżo i zużyte w ciągu jednego dnia.
3. Roztwór IAA: 0,05 M jodoacetamid w UA. Przygotować 0,1 ml na 1 próbkę.
4. Endoproteinaza Lys-C, roztwór podstawowy.
5. Trypsyna, roztwór podstawowy.
6. 'Bufor do wytrawiania' (DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8,5. Przygotować 0,25 ml na 1 próbkę.
7. 'Roztwór wzorcowy tryptofanu': 0,1 μg tryptofanu w 1 ml wody dejonizowanej.
8. 'Bufor do oznaczania B' (ABB): 10 mM Tris-HCl, pH 7,6.
9. Roztwór podstawowy buforu uniwersalnego Britton & Robinson (BRUB). Przygotować roztwór zawierający 0,1 M CH₃COOH, 0,1 M H₃PO₄ i 0,1 M H₃BO₃ i dostosować 1 M NaOH do wymaganego pH (2, 4, 5, 6 i 11). Przed użyciem rozcieńczyć 5-krotnie wodą dejonizowaną.
10. Bufor A: 1% (v/v)_CH3COOH w wodzie dejonizowanej.
11. Bufor B: 60% (v/v) CH₃CN, 1% (v/v) CH3COOH w wodzie dejonizowanej.

3. Kolumny Końcówka do pipet i StageTip

1. Przygotuj kolumnę z końcówką SAX, układając 6 warstw membrany Empore-Anion we wspólnej końcówce do pipety o pojemności 0,2 ml. Wykonaj dwie kolumny końcówki SAX na próbkę.
2. Przygotuj końcówkę StageTip, układając 3 warstwy Empore-C₁₈ w końcówce do pipety o pojemności 0,2 ml. Wykonaj 6 końcówek etapu dla każdej próbki.

4. Przygotowanie wycinków tkanek do mikrodysekcji i lizy próbek

1. Wytnij skrawki za pomocą mikrotomu (grubość plastrów zależy od próbki. Zwykle mikrodysekcja dobrze sprawdza się w przypadku plastrów o wielkości 7-10 μm).
2. Naświetlać szkiełka membranowe (MembraneSlide 1.0 PEN) światłem UV przez 45 min.
3. Zamontuj sekcje na szkiełkach membranowych napromieniujących i susz w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
4. Odparafinować zamontowane sekcje przez dwie kolejne inkubacje w ksylenie przez 2,5 minuty i 1,5 minuty. Ponownie uwodnić sekcje przez kolejne inkubacje w absolutnym etanolu, 70% etanolu i wodzie, każda przez 1 minutę.
5. Zabarwić skrawki hematoksyliną Mayera przez 20 sekund, spłukiwać wodą przez 1 minutę i wysuszyć na powietrzu.
6. Zbierz interesującą populację komórek za pomocą systemu mikrodysekcji wychwytywania laserowego. W przypadku korzystania z przyrządu PALM (Zeiss) należy pobrać próbki do nasadek samoprzylepnych (Adhesive CAP 200).
7. Odpipetować porcję TLB na mikrowycięty materiał w nasadce. Zamknąć probówkę i zebrać zawiesinę przez krótkie odwirowanie. Mikrowypreparowaną tkankę poddać lizie w temperaturze 99 °C w bloku grzewczym z mieszaniem (600 obr./min) przez 1 godzinę. Użyć 3 μl buforu na 10 nl mikrowypreparowanej tkanki.
8. Klarować surowy ekstrakt przez odwirowanie w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 18 °C przez 10 minut. Lizat można przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C.

5. Przetwarzanie próbek

1. Wymieszać do 50 μl oczyszczonego lizatu z 200 μl UA w jednostkach ultrafiltracji (Forensic 30k) i odwirować przy 14 000 x g, aż w filtrze pozostanie mniej niż 10 μl roztworu. Zwykle ten krok wymaga 10-15 minutowego wirowania.
2. Odpipetować pipetą 200 μl UA do jednostki ultrafiltracyjnej i odwirować jak w ppkt 5.1. Opróżnij probówkę zbiorczą.
3. Odpipetować pipetą 50 μl roztworu IAA i mieszać z prędkością 600 obr./min w termomikserze przez 1 minutę i odwirować jak w ppkt 5.1.
4. Odpipetować 100 μl UA do jednostki ultrafiltracji i odwirować jak w ppkt 5.1. Powtórz ten krok dwa razy
5. Odpipetować 100 μl DB do jednostki ultrafiltracji i odwirować w temperaturze 5.1. Powtórz ten krok dwukrotnie.
6. Przenieś jednostki filtracyjne do nowych probówek zbiorczych. Odpipetować 40 μl DB endoproteinazą Lys-C (stosunek proteinazy do białka całkowitego 1:100) i mieszać z prędkością 600 obr./min w termomikserze przez 1 min. Inkubować jednostki w mokrej komorze w temperaturze 37 °C przez 18 godzin.
7. Odwirować jednostki filtrujące przy 14 000 x g, tak jak w ppkt 5.1.
8. Pobrać pipetą 160 μl wody dejonizowanej i odwirować jednostki filtrujące jak w ppkt 5.1. Łączny przepływ (5,7 i 5,8 kroków) zawiera peptydy uwalniane przez endoproteinazę Lys C.
9. Przenieś jednostkę ultrafiltracji do nowej probówki zbiorczej. Dodać 40 μl DB z trypsyną (stosunek enzymu do białka 1:100) i mieszać z prędkością 600 obr./min w termomikserze przez 1 min. Inkubować jednostki w mokrej komorze w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Powtórz kroki 5.7 i 5.8, aby zebrać peptydy tryptyczne
.

6. Kwantyfikacja peptydów

1. Pomiar zawartości peptydów w trawienkach białkowych można przeprowadzić w rozcieńczonym buforze, ponieważ reszty tryptofanu są dobrze dostępne dla rozpuszczalnika.
2. Odpipetować 0,2 ml ABB do kuwety kwarcowej i zapisać widmo emisji dla "ślepej" próby.
3. Przygotować krzywą kalibracyjną w krokach co 0,1 μg, dodając 1 μl porcji TSS do kuwety i delikatnie mieszając z ABB.
4. Wyczyść kuwetę.
5. Odpipetować próbkę i zapisać widmo (próbkę).
6. Obliczanie stężenia białka i peptydu
   Ponieważ 0,1 μg tryptofanu odpowiada około 9 μg białka (w oparciu o średnią 1,1% zawartości tryptofanu w mieszaninach białkowych otrzymanych w wyniku lizy komórek ludzkich), zawartość białka w próbce lub zawartość peptydów w trawieniu wynosi:
   
   gdzie F(Standard1) jest fluorescencją wzorca tryptofanu 0,1 μg. Zawartość peptydów umożliwia obliczenie wydajności procedury trawienia i dostarcza niezbędnych informacji do śledzenia frakcjonowania peptydów i analizy spektrometrii mas.

7. Frakcjonowanie peptydów Lys-C i tryptycznych

1. Rozcieńczyć roztwory peptydów otrzymane przez trawienie Lys-C i trypsyną odpowiednio w 0,2 ml BRUB pH 11 i pH 5.
2. Zamontuj kolumnę końcówki SAX w pokrywie adaptera rurki odśrodkowej.
3. Przemyć i zrównoważyć kolumnę końcówki SAX kolejno 0,1 ml metanolu, 0,1 ml 1 M NaOH i 3 razy 0,1 ml BRUB, pH 11 w celu oddzielenia peptydów Lys-C i BRUB, pH 5 w przypadku peptydów tryptycznych. Przepływ roztworów przez materiał kolumny jest ułatwiony przez odwirowanie przy 4 000 x g.
4. Przemyć i zrównoważyć C₁₈-"StageTips" kolejno 0,05 ml metanolu, następnie 0,05 ml buforu B i 0,05 ml buforu A. Przygotować sześć końcówek C₁₈-"StageTips"; 4 do oddzielenia peptydów Lys-C i dwie do oddzielenia peptydów tryptycznych.
5. Zamontuj kolumnę końcówki SAX w C₁₈-'StageTip'. Załaduj roztwory próbek do zrównoważonych kolumn SAX Tip i odwiruj kolumny przy 5,000 x g przez 3 minuty.
6. Zrównoważyć kolumny "końcówka pipety" z 0,1 ml BRUB, pH 11 lub pH 5, odpowiednio z próbkami Lyc-C i próbkami tryptycznymi. Ułatwić przepływ poprzez odwirowanie przy 5 000 x g.
7. Przenieś kolumnę SAX Tip do następnego C₁₈-'StageTip'.
8. Kontynuować elucję peptydów za pomocą BRUB pH 6, 4 i 2 dla próbki Lys C oraz BRUB pH 2 dla próbki z peptydami tryptycznymi. Dla każdego etapu elucji należy użyć oddzielnej końcówki C₁₈-'StageTip'.
9. Przemyć C₁₈-'StageTips' 0,05 ml buforu A.
10. Eluować frakcje za pomocą 0,05 ml buforu B do fiolek używanych bezpośrednio do wstrzykiwania próbek do układu LC wyposażonego w spektrometr masowy.

Wyniki

Analiza proteomiczna materiału FFPE wymaga solidnych i powtarzalnych metod przygotowania próbek. W niniejszej publikacji przedstawiono protokół pozwalający na skuteczną izolację populacji komórek od utrwalonego materiału i ich chemiczną obróbkę, w wyniku której uzyskuje się frakcje peptydowe o wysokiej czystości, które można bezpośrednio wykorzystać do analizy LC-MS/MS. Procedura składa się z czterech odrębnych części: (1) przygotowania skrawków próbek FFPE i jej mikrodysekcji, (2) lizy próbki i przetwarzania białek przy użyciu podejścia MED FASP oraz (3) oceny ilościowej i (4) frakcjonowania peptydów (rysunek 1).

W pierwszym kroku procedury próbki FFPE są dzielone za pomocą mikrotomu i umieszczane na szkiełkach pokrytych membraną. Aby zwiększyć adhezję między skrawkami tkanki a powierzchnią membrany szkiełka, konieczne jest naświetlanie powierzchni szkiełka światłem UV. W tym celu wykorzystujemy światło lampy UV zintegrowanej z ławką do hodowli komórkowych. Po tym etapie preparaty poddawane są płukaniu pozwalającemu na usunięcie parafiny i ponowne uwodnienie próbek. Uwodniony materiał jest barwiony hematoksyną przez krótki czas. Powoduje to słabe zabarwienie próbki, ale jest wystarczające do wizualizacji obszarów próbki do mikrodysekcji. Proces barwienia należy szybko zatrzymać poprzez spłukanie szkiełek nadmiarem wody. Długotrwałe barwienie próbki powoduje słabą wydajność peptydów.

W następnym kroku wysuszone sekcje są poddawane mikrosekcji. Dobór obszarów tkankowych poszczególnych komórek zależy od rodzaju badania i zawsze wymaga specyficznej wiedzy z zakresu histologii lub patomorfologii. Uwolniony laserowo materiał jest zbierany na klejących powierzchniach probówek do pobierania próbek. Ponieważ zdolność wiązania materiału klejącego jest ograniczona, konieczne jest przeniesienie mikrowypreparowanego materiału z wieczka do probówki po rozcięciu co 3-5^mm2 próbki. Można to łatwo zrobić, odpipetowując kilka mikrolitrów buforu do lizy tkanek (LTB) na pokrywkę i krótko obracając probówkę w wirówce. Po pobraniu próbki na dno probówki, mikrodysekcja i pobieranie próbki na pokrywie mogą być kontynuowane. Po pobraniu całej próbki, probówki muszą być dodatkowo zakorkowane Parafilmem i inkubowane w łaźni wodnej w temperaturze około 99 °C z ciągłym mieszaniem przez 1 godzinę. Ponieważ podczas inkubacji woda skrapla się na pokrywie, co 15 minut probówki muszą być krótko odwirowane, aby zebrać wodę z powrotem w stożku probówki.

Aby uzyskać peptydy, lizaty tkankowe są przetwarzane przy użyciu metody MED-FASP. W tej metodzie lizowane białka są pozbawiane detergentu i innych substancji o niskiej masie cząsteczkowej, karboamidometylowane w resztach cysteinylu, a następnie kolejno trawione dwoma enzymami różniącymi się swoistością łupania: endoproteinazą LysC i trypsyną. Po każdym etapie trawienia peptydy są zbierane do oddzielnych frakcji. W tej części przygotowania próbki ważne jest, aby kontynuować każdy z etapów wirowania, aż ponad 95% roztworu początkowo załadowanego do jednostki filtracyjnej przejdzie przez membranę. Analizując tkankę jelita grubego i jej raka zaobserwowaliśmy, że w wyniku tej procedury uzyskuje się 3-6 μg peptydu na 100 nl (100 μg tkanki lub 10^mm2 z przekroju 10 μm) mikrowypreparowanego materiału (tab. 1). Ponieważ całkowite białko ekstrahowane z tkanek stanowi około 10% masy tkanki, procedury ekstrakcji i trawienia razem dają 30-60% wydajności w stosunku do oryginalnej świeżej tkanki. Wartości te odzwierciedlają straty białka podczas odwadniania i barwienia, mikrodysekcji i zatrzymywania części niestrawionej próbki w jednostkach ultrafiltracji. Ponieważ ekstrakcja i przetwarzanie niemikropreparowanej tkanki FFPE spowodowało uzyskanie wydajności konwersji białka do peptydu na poziomie 75% ⁵, jest prawdopodobne, że krytyczne straty próbki wystąpią na etapach poprzedzających MED-FASP. Istotną cechą mieszanin peptydowych otrzymanych w tej procedurze jest ich wysoka czystość, która ułatwia dalszy proces frakcjonowania, frakcjonowania peptydów oraz identyfikację za pomocą spektrometrii mas. Wykazano to ostatnio w analizie próbek gruczolaka jelita grubego ³. W tym badaniu około 40% zdarzeń SM/MS doprowadziło do identyfikacji peptydów z tkanki FFPE i spowodowało mapowanie do 17 000 peptydów na pojedynczy przebieg LC-MS/MS. Wyższe wskaźniki identyfikacji osiągnięto jedynie w analizie zamrożonych komórek hodowanych in vitro ³.

W dwóch ostatnich częściach całej procedury, wyizolowane peptydy są oznaczane ilościowo i frakcjonowane na mikrokolumnach z końcówkami pipet. Ponieważ ilości peptydu wyizolowanego z mikrowypreparowanej tkanki są mniejsze niż 10 μg, nie można ich określić ilościowo za pomocą powszechnie stosowanych testów białkowych na bazie barwników. Również pomiary widma UV A₂₈₀ przy tych stężeniach nie są przydatne ze względu na efekt rozpraszania światła. W przeciwieństwie do tego, pomiary fluorescencji reszt tryptofanu oferują wiarygodny sposób oznaczania zawartości peptydów.

Ostatnio pokazaliśmy, że nawet 5 000 białek z hodowanych komórek można zidentyfikować w 'pojedynczym strzale' 4-godzinnej analizie LC-MS/^{MS 7}. Jednak tego typu analiza stosowana do tkanek natywnych rzadko pozwala na identyfikację więcej niż 3000 tysięcy białek. Aby zwiększyć szczegółowość analizy, peptydy wytworzone w MED FASP muszą zostać wstępnie frakcjonowane przed LC-MS/MS. Separacja mikrokolumnowa oparta na SAX jest prostą i wydajną metodą frakcjonowania ¹⁰. Został już zastosowany w kilku badaniach proteomicznych, w tym analizujących utrwalone tkanki ^{5, 8, 9}. Mikrokolumny SAX-"pipeta-końcówka" i kolumny odsalające C₁₈-"StageTip" ⁹ są łatwe w przygotowaniu. Kolumny są montowane poprzez ułożenie w stos zatyczek, wyciętych z membrany SAX lub C₁₈, w końcówce do pipety ¹¹ o pojemności 200 μl. Przykłady analizy próbek FFPE frakcjonowanych metodą SAX przedstawiono w tabeli 1.

Rysunek 1. Przegląd procedur. Procedura składa się z czterech odrębnych części: (1) przygotowania skrawków próbek FFPE i jej mikrodysekcji, (2) lizy próbki i przetwarzania białek przy użyciu metody MED FASP oraz (3) oceny ilościowej i (4) frakcjonowania peptydów.

Próbka	Wstępne frakcjonowanie / trawienie próbki	Używany spektrometr masowy	Wydajność peptydu ng / nL próbki (±SD)	Unikalne Identyfikacje Białek Na Pojedynczą Próbkę	Odniesienie
•Gruczolakorak •Prawidłowa błona śluzowa jelita grubego	SAX/jeden enzym	Orbitrap -Velos	36±11 (n = 8) 30±8 (n = 8)	5,985±54 5 868±110	8
•Gruczolak jelita grubego	SAX/dwa enzymy	Q Bardzo aktywny	56±6,1 (n = 3)	9 501±28	3

Tabela 1. Reprezentatywne wyniki analiz proteomicznych mikrowypreparowanej tkanki FFPE.

Dyskusja

Możliwość badania materiału FFPE za pomocą technologii proteomicznej na głębokość porównywalną z technikami sekwencjonowania kwasów nukleinowych i mikromacierzy otwiera nowe perspektywy w odkrywaniu biomarkerów i celów leków. Opisany protokół umożliwia charakterystykę i ocenę ilościową proteomów populacji mikrowypreparowanych komórek w skali 10 000 białek. Przy użyciu mniejszej ilości materiału z mikropreparacji można wygenerować mniejsze zestawy danych, ale być może w wielu przypadkach mogą one również dostarczyć cennych danych klinicznych. Dzięki temu albo próbki mogą być analizowane bezpośrednio po procedurze MED-FASP, albo mogą być rozdzielane na mniejsze frakcje. Ponieważ procedura FASP jest kompatybilna z każdym typem proteazy, inne enzymy lub ich kombinacja mogą być stosowane z trawienia białek ⁶.

Jakość materiału FFPE wydaje się być najbardziej krytyczną kwestią w analizie. Doświadczyliśmy, że utrwalona tkanka tego samego pochodzenia, ale pochodząca z różnych klinik, miała różne właściwości. Korzystając z tkanki z jednego źródła, byliśmy w stanie wygenerować peptydy z dużą wydajnością, podczas gdy podobny materiał z innej kliniki był prawie bezużyteczny. Jest prawdopodobne, że zastosowane procedury utrwalania i zatapiania oraz warunki przechowywania są głównymi czynnikami wpływającymi na właściwości materiału klinicznego ¹². Dlatego wskazane jest przetestowanie właściwości kilku próbek przed rozpoczęciem większego projektu.

W wielu publikacjach informowano o wykorzystaniu materiałów FFPE w przeszłości. Jednak liczba białek zidentyfikowanych w tych badaniach nigdy nie przekraczała 1000-2000 białek ⁴. Biorąc pod uwagę rozmiar proteomów specyficznych dla komórek ludzkich, składających się z ponad 10 000 białek, takie badania były w stanie dostarczyć tylko bardzo powierzchownego obrazu, prawie ograniczonego do bardzo obfitych białek zaangażowanych w funkcje porządkowe. Nasz protokół umożliwia skuteczną izolację materiału klinicznego lub biologicznego od zakonserwowanej tkanki i jest zoptymalizowany pod kątem lizy, przetwarzania białek i wstępnej frakcjonowania peptydów. W związku z tym nasz proces przygotowania próbek, w połączeniu z wysokiej klasy spektrometrią mas, umożliwia wgląd w prawie kompletne proteomy. Warto zauważyć, że jest to możliwe przy minimalnych wymaganiach dotyczących ilości próbki.

Główną zaletą stosowania zachowanych tkanek jest ich relatywnie szeroka dostępność. Próbki FFPE archiwizowane przez wiele lat i dekad, a czasem uważane za bezużyteczne, teraz, dzięki technologii proteomicznej, pojawiają się jako bardzo cenny materiał do badań klinicznych. Podczas gdy wiele chorób można badać przy użyciu świeżego lub mrożonego materiału, badanie materiału FFPE wydaje się być szczególnie ważne dla badania chorób rzadkich ¹², gdzie pobranie reprezentatywnego zestawu próbek jest zwykle długotrwałe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MembraneSlide 1.0 PEN	Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Göttingen, Niemcy	415190-9041-000
Samoprzylepna nasadka 200 nieprzezroczysta	Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Niemcy	415190-9181-000
Roztwór hematoksyny Mayera	Sigma-Aldrich St. Louis, MO	MHS32
Forensic 30k	Merck Millipore Darmstadt, Niemcy	MRCF0R030	(Wcześniej sprzedawany jako Microcon YM-30)
Empore Anion	Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN	2252
Empore C18	Technologie bioanalityczne 3M Company ST. Paul, MN	2215
Trypsin	Promega	2014-06-27
Endoproteinaza Lys-C	Wako	129-02541