Artykuł metodologiczny

Manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do funkcjonalnej analizy genomowej Toxoplasma gondii

18.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50598

⸱

12 lipca 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, The Geisel School of Medicine at Dartmouth

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy metodę wykorzystania szczepów Δku80 typu I i II Toxoplasma gondii do efektywnego generowania docelowych delecji genów i zamienników genów do funkcjonalnej analizy genomowej.

Streszczenie

Ukierunkowana manipulacja genetyczna za pomocą rekombinacji homologicznej jest metodą z wyboru do funkcjonalnej analizy genomowej w celu uzyskania szczegółowego obrazu funkcji genu i fenotypu. Rozwój zmutowanych szczepów z celowanymi delecjami genów, ukierunkowanymi mutacjami, uzupełnioną funkcją genów i/lub znakowanymi genami zapewnia potężne strategie radzenia sobie z funkcją genów, szczególnie jeśli te manipulacje genetyczne mogą być skutecznie ukierunkowane na locus genu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą integracji, w której pośredniczy podwójna krzyżowa rekombinacja homologiczna.

Ze względu na bardzo wysokie wskaźniki rekombinacji niehomologicznej, funkcjonalna analiza genomowa Toxoplasma gondii była wcześniej ograniczona przez brak skutecznych metod celowania w delecje genów i zamianę genów na określone loci genetyczne. Niedawno znieśliśmy główny szlak rekombinacji niehomologicznej w szczepach T. gondii typu I i typu II poprzez usunięcie genu kodującego białkoKU80 1,2. Szczepy Δku80 zachowują się normalnie w stadiach tachyzoitu (ostrego) i bradyzoitu (przewlekłego) in vitro i in vivo i wykazują zasadniczo 100% częstość rekombinacji homologicznej. Szczepy Δku80 umożliwiają funkcjonalne badania genomiczne zarówno na pojedynczym genie, jak i w skaligenomu 1-4.

Tutaj opisujemy metody wykorzystania szczepów Δku80Δhxgprt typu I i II do rozwoju metod celowania genów u T. gondii. Przedstawiamy skuteczne metody generowania delecji genów, wymiany genów i znakowanych genów poprzez ukierunkowaną insercję lub delecję markera selekcji fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-ksantynowo-guaninowej (HXGPRT). Opisany protokół celowania genów może być stosowany na wiele sposobów w szczepach Δku80 w celu przyspieszenia analizy funkcjonalnej genomu pasożyta i opracowania pojedynczych szczepów, które są nosicielami wielu ukierunkowanych manipulacji genetycznych. Zastosowanie tej metody genetycznej i późniejszych testów fenotypowych ujawni fundamentalne i unikalne aspekty biologii T. gondii i powiązanych z nim istotnych ludzkich patogenów, które powodują malarię (Plasmodium sp.) i kryptosporydiozę (Cryptosporidium).

Wprowadzenie

Toxoplasma gondii to powszechny wewnątrzkomórkowy pasożyt pierwotniakowy, który często i chronicznie infekuje szeroką gamę zwierząt i ludzi5. Szacuje się, że ponad 1 miliard ludzi jest obecnie i przewlekle zarażonych tym patogenem. Oprócz znaczenia choroby wywoływanej przez zakażenie T. gondii, rosnąca dostępność narzędzi eksperymentalnych, potężne zasoby genomiczne6, łatwość hodowli in vitro i doskonałe modele myszy sprawiły, że T. gondii stał się wiodącym systemem modelowym do szerszego badania wewnątrzkomórkowych patogenów eukariotycznych i innych znaczących pasożytów apikompleksanowych, które powodują wyniszczające choroby, takie jak malaria (Plasmodium sp.) i kryptosporydioza (Cryptosporidium)5,7. Istotnym ograniczeniem Toxoplasma gondii jako organizmu modelowego jest nieefektywne odzyskiwanie potomstwa, które jest nosicielem ukierunkowanych manipulacji genetycznych. Ten problem w celowaniu genów wynika z niskiej częstości rekombinacji homologicznej w porównaniu z bardzo wysoką częstością rekombinacji niehomologicznej w dzikich szczepach T. gondii, nawet gdy w docelowych cząsteczkach DNA stosowanych w badaniach genetycznych zapewniona jest rozległa homologia DNA2.

Niedawno genetycznie zablokowaliśmy główny szlak niehomologicznej rekombinacji w szczepach Toxoplasma gondii typu I i II, usuwając gen kodujący białko KU801,2. Powstałe szczepy Δku80 typu I i typu II wykazują normalne tempo wzrostu, wielkość i zachowanie zarówno in vitro, jak i in vivo podczas etapów tachyzoitu i bradyzoitu in vitro i in vivo, jednak szczepy te wykazują zasadniczo 100% częstość rekombinacji homologicznej, a ten fenotyp zwiększa prawdopodobieństwo szybkiego wyizolowania pożądanego potomstwa ukierunkowanych manipulacji genetycznych o kilkaset do kilku tysięcy razy1,2,4. Niedawne zastosowanie w całej społeczności szczepów Δku80 typu I i II znacznie zwiększyło tempo, różnorodność, a także wskaźnik sukcesu ukierunkowanych podejść genetycznych u T. gondii1-4,8-13. Tutaj opisujemy kompleksowy protokół celowanej delecji genów, wymiany genów i znakowania genów w szczepach Δku80 T. gondii. Pokazujemy, jak projektować i niezawodnie kierować manipulacje genetyczne do określonych genów lub loci genetycznych w szczepach Δku80 Toxoplasma gondii.

Protokół

1. Celowanie w geny w celu usunięcia interesującego genu

Ten protokół jest przeznaczony do efektywnego generowania zmutowanego szczepu, który ma celową delecję genu w określonym locus genetycznym. Wcześniej opisany marker fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-ksantynowo-guaninowej T. gondii (HXGPRT) jest używany w tym protokole do bezpiecznego i niezawodnego wprowadzania markera po selekcji kwasu mykofenolowego i ksantyny (MPA + X)14-16. Protokół ten wykorzystuje zwalidowaną i opłacalną metodę konstruowania cząsteczek ukierunkowanych na DNA w oparciu o klonowanie rekombinacyjne drożdży17,18. Na rynku dostępnych jest kilka alternatywnych protokołów konstruowania rekombinowanych cząsteczek docelowych przy użyciu metod klonowania rekombinacyjnego bakterii, metod klonowania rekombinacyjnego in vitro lub fusion PCR. Opisany poniżej protokół zapewnia najwyższą ogólną skuteczność i niezawodność odzyskiwania sklonowanych pasożytów posiadających celowaną delecję genu w szczepach Δku80 T. gondii.

1.1 Przygotowanie DNA do targetowania

  1. Uzyskaj dostęp do ToxoDB6 (http://www.toxodb.org), aby uzyskać sekwencje genomowe dla genu będącego przedmiotem zainteresowania (GOI).

Uwaga: Sekwencje genomowe powinny być uzyskiwane z sekwencji genomu typu I, II lub III w bazie danych ToxoDB, która jest najbliższa szczepowi, który jest manipulowany. Na przykład: GT1 dla RH i ME49 dla Pru.

  1. Zaprojektuj specyficzne startery nakładające się, które amplifikują genomowe boki docelowe 5' i 3' genu będącego przedmiotem zainteresowania (GOI), obejmujące nakładanie się 33 pz z wektorem wahadłowym drożdży pRS416 (lub alternatywnie pRS426) i włączają nakładanie się 33 pz z wybieralnym markerem (HXGPRT) (ryc. 1A-B). Dodaj unikalne miejsce enzymu restrykcyjnego w każdym starterze na obu końcach boków genomu docelowego 5' i 3', umieszczonego między nakładaniem się 33 pz a sekwencją (sekwencjami) startera specyficznego dla T. gondii (ryc. 1A-B).

Uwaga: Do efektywnego klonowania rekombinacji drożdży wymagane jest większe niż 30 punktów bazowych. Boki ukierunkowane genomowo 5' i 3' są zaprojektowane do amplifikacji określonych fragmentów DNA między 800 a 1,400 pz, które definiują docelową delecję. Należy pamiętać, że krótsze flanki znacznie zmniejszą skuteczność celowania w tle Δku80Δ hxgprt 2.

  1. PCR amplifikuje flankę celu 5' za pomocą starterów F1 i R1, a PCR wzmacnia flankę celu 3' za pomocą startera F2 i R2 (ryc. 1A-C) z genomowego DNA3. Oddzielnie PCR amplifikuje gen HXPGRT ~ 2 Kbp, w tym powiązane regiony flankujące dhfr 5' i 3' kasety14 cDNA HXGPRT 14 przy użyciu starterów HXF i HXR (ryc. 1B-C).

Uwaga: Wzmocnij docelowe boki za pomocą genomowego DNA ze szczepu rodzicielskiego, który ma być transfekowany.

Uwaga: Umieść marker HXGPRT w orientacji do przodu względem boków docelowych DNA 5' i 3', aby ułatwić późniejsze efektywne manipulacje genetyczne, takie jak celowe usunięcie HXGPRT z uszkodzonego locus.

  1. Sprawdź prawidłowe rozmiary produktów PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i oszacuj stężenie fragmentów DNA za pomocą wzorców żelu agarozowego lub innej metody oznaczania stężenia DNA.
  2. Wygeneruj kompetentne porcje drożdży zgodnie z opisem w Gietz i Schiestly17.
  3. Połączyć 50 ng 5' genomowego ucha celowego, 50 ng 3' genomowego ukierunkowanego boku, 100 ng markera selekcyjnego HXGPRT i 50 ng zlinearyzowanego wektora czółenkowego ze sterylnymH2O, aby uzyskać końcową objętość 10 - 20 μl. Przekształć kompetentne drożdże za pomocą trzech produktów PCR i drożdży-E. wektor wahadłowy coli do klonowania rekombinacyjnego przy użyciu protokołu opisanego przez Gietza i Schiestly'ego17. Drożdże przekształcone na płytkach uracyl-minus minimalna pożywka agarowa i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2 - 3 dni.

Uwaga: Uporządkowane składanie plazmidu, boku celu 5', markera HXGPRT i boku celu 3' jest ułatwione przez zaprojektowane nakładanie się fragmentów DNA na 33 pz (Rysunki 1A-B) i odbywa się za pośrednictwem rekombinacji homologicznej w drożdżach.

  1. Zbierz drożdże, dodając 2 ml 2x YPAD do płytek uracyl-minus i delikatnie zeskrobując, aby usunąć kolonie bez naruszania agaru. Odwirować roztwór drożdży przez 5 minut przy 5 000 x g i wyrzucić supernatant.
  2. Zawiesić osad drożdży w 250 μl buforu do reprodukcji zawierającego RNazęA i dodać 50 - 100 μl szklanych kulek przemytych kwasem do roztworu. Wiruj przez 5 minut z najwyższą prędkością, aby rozbić komórki drożdży.
  3. Pozwolić, aby szklane kulki osiadły na dnie probówki i przenieść supernatant do probówki Eppendorfa o pojemności 2 ml.
  4. Wyizoluj DNA drożdży za pomocą zestawu do izolacji DNA miniprep, ponownie zawieszając w końcowej objętości ~100 μl.
  5. Wymieszaj 2 μl DNA drożdży (~50 ng) z 40 μl E. coli kompetentnych do elektroporacji DH10B trzymanych na lodzie.
  6. Przenieś roztwór do schłodzonej kuwety elektroporacyjnej o odstępie 2 mm i naelektryzuj komórki bakteryjne napięciem 2,4 kV i 129 Ω.
  7. Uratuj komórki, dodając 0,8 ml bulionu SOC do każdej kuwety i przenieś roztwór do 14 ml probówki Falcon z zatrzaskową nakrętką. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C na bębnie rolkowym przez 40-60 minut.
  8. Umieścić E. coli na płytkach 2XYT + ampicylina (AMP) i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
  9. Wybierz ~6 - 8 pojedynczych kolonii i hoduj w 3 ml 2XYT + AMP przez ~16 godzin w temperaturze 37 °C.
  10. Przygotuj 30% zapas glicerolu do zamrażania każdego klonu E. coli.
  11. Wyizolować plazmid pΔGOI z klonów E. coli za pomocą zestawu do miniprzygotowania, ponownie zawieszając w końcowej objętości ~100 μl.
  12. Zwaliduj pΔGOI za pomocą trawienia enzymów restrykcyjnych w celu zmierzenia wielkości plazmidu DNA i zweryfikowania oczekiwanych wzorców prążków DNA pΔGOI.
  13. Sfinalizowanie walidacji pΔGOI poprzez sekwencjonowanie DNA boków docelowych genomu 5' i 3' w celu weryfikacji 100% sekwencji DNA na podstawie danych sekwencji genomu w http://www.ToxoDB.org.

Uwaga: Niemal idealna homologia sekwencji jest niezbędna do maksymalizacji efektywności celowania genów3, ponieważ każda różnica par zasad stanowi odpowiadające jej skrócenie długości doskonałej homologii.

Uwaga: Sekwencja genomu szczepu Δku80 typu II oparta na rodzicielskim szczepie Pru nie jest obecnie dostępna. W pracy wykorzystano sekwencję genomu ME49 typu II jako genom zastępczy dla szczepu Δku80 typu II. Na podstawie danych sekwencyjnych w wielu loci genetycznych szacuje się, że genom ME49 i genom Pru wykazują polimorfizmy pojedynczych nukleotydów z częstotliwością ~1 na 10 000 nukleotydów lub mniej.

  1. Wygeneruj >200 μg zapasu pΔGOI, zaszczepiając ~ 250 ml 2XYT + AMP kulturę na noc zapasami glicerolu z zatwierdzonego klonu E. coli miniprep.
  2. Wyizolować plazmidowe DNA pΔGOI z dużej hodowli za pomocą zestawu do izolacji DNA maxiprep, ponownie zawieszając w końcowej objętości ~ 1,000 μl.
  3. Powtórz trawienie enzymu restrykcyjnego lub sekwencjonowanie DNA pΔGOI maxiprep DNA w celu sprawdzenia prawidłowej docelowej cząsteczki DNA przed transfekcją.
  4. Linearyzuj ~15 μg pΔGOI na końcu 5' przy użyciu unikalnego enzymu restrykcyjnego X (RE. X) miejsce trawienia wbudowane w flankę celu 5' (rys. 1B).

Uwaga: Celowanie genów u T. gondii wymaga minimum ~10 μg DNA, aby uzyskać efektywną częstotliwość zdarzeń celowania w interesujące miejsce genu2.

  1. Zwaliduj linearyzację pΔGOI i oznacz stężenie DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym lub metody alternatywnej.

Uwaga: Jeśli trawienie enzymem restrykcyjnym na boku 5' nie daje pełnej linearyzacji, projektowane 3' unikalne RE. Miejsce trawienia Y może być używane jako alternatywne miejsce do linearyzacji pΔGOI.

Uwaga: Całkowicie zlinearyzowana cząsteczka DNA jest niezbędna do skutecznego celowania w geny przez homologiczną rekombinację w szczepach Δku80.

  1. Zneutralizować enzym restrykcyjny przez inkubację w temperaturze 68 °C przez 15 - 20 min.
  2. Przygotować co najmniej 15 μg zlinearyzowanego plazmidu w 100 μl sterylnegoH2O. Przechowywać zlinearyzowane pΔGOI w temperaturze -20 °C do czasu transfekcji.

1.2 Przygotowanie pasożytów T. gondii, transfekcja, selekcja, subklonowanie, walidacja, archiwizacja i utrzymanie genetycznie modyfikowanych szczepów

Ogólne metody hodowli i manipulacji T. gondii w ludzkich komórkach fibroblastów napletka (HFF) są opisane19-21. Szczepy Δku80Δhxgprt replikują się normalnie w pożywce do infekcji pasożytami (pożywka wzrostowa Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) uzupełniona 1% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% antybiotykiem przeciwgrzybiczym rozcieńczonym ze 100-krotnego wywaru)1,2. Wszystkie prace z Toxoplasma gondii muszą być wykonywane zgodnie z procedurami poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2. Szczep rodzicielski T. gondii RHΔku802 został wygenerowany ze szczepu RHΔhxgprt z Roos Lab14. Szczep rodzicielski PruΔku801 został wygenerowany z PruΔhxgprt (szczep Prugniaud BSG-422), który zawiera stabilnie zintegrowany marker wybieralny CAT i reporter białka zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą promotora LDH2 specyficznego dla etapu bradyzoitu.

  1. Zaszczepić kolbę o średnicy 25 cm2 zawierającą zlewające się komórki HFF 1 x 106 żywotnych pasożytów typu I RH Δku80Δhxgprt lub zaszczepić dwie kolby o średnicy 25 cm2 z 2 x 106 żywotnymi pasożytami typu II Prugniaud (Pru) Δku80Δhxgprt.

Uwaga: Żywotne pasożyty są definiowane jako pasożyty zewnątrzkomórkowe, które zostały świeżo wydalone.

Uwaga: Ta skala dostarcza wystarczającą liczbę żywotnych pasożytów dla trzech eksperymentów transfekcyjnych.

  1. Sprawdź Δku80Δhxgprt zakażone kultury ~ 68 - 72 godziny po zakażeniu. Sprawdź obecność żywotnych pasożytów i ~90 - 95% lizy komórek HFF, aby zaplanować dokładny czas transfekcji.

Uwaga: Izolacja świeżo uwolnionych pasożytów jest niezbędna dla powodzenia tego protokołu, ponieważ niska żywotność pasożytów zniesie skuteczność celowania w geny.

  1. Wstrząsnąć żywotnymi pasożytami w roztworze, zamykając pokrywę z uszczelką na kolbie o średnicy 25cm2 i energicznie potrząsać kolbą w przód iw tył, aby wymieszać pasożyty z powierzchni wzrostu bez rozpryskiwania płynu na wnętrze pokrywki lub szyjkę kolby.

Uwaga: Zbieranie pasożytów nie wymaga protokołu uwalniania igły strzykawki dla szczepów Δku80 typu I lub II.

  1. Przenieść roztwór pasożyta do strzykawki o pojemności 10 ml przymocowanej do uchwytu filtra zawierającego membranę 3 μm i umieścić jednostkę filtrującą na otwartej probówce z nakrętką o pojemności 15 ml. Strzykawka przefiltrować pasożyty do zakrętki o pojemności 15 ml.

Uwaga: Filtrowanie pasożytów przez błonę usuwa zainfekowane komórki i resztki komórkowe.

  1. Określić stężenie pasożyta (formy tachyzoitu na ml) za pomocą hemocytometru.

Uwaga: Opcjonalnie: Korzystając z roztworu pasożyta, ustaw test PFU (ang. test formowania płytki nazębnej)21, który zostanie odczytany 7 - 8 dni później, aby określić odpowiednią żywotność transfekowanych pasożytów (stosunek PFU do tachyzoitu wynosi ≥0,2).

  1. Osad pasożytów przez 7 min przy 1400 x g i odessać supernatant do ~0,4 ml bez naruszania osadu pasożyta. Wirować przez 2 minuty w temperaturze 1 400 x g i odessać pozostały supernatant do ~0,01 ml bez naruszania osadu pasożyta.
  2. Zawiesić osad pasożyta, przesuwając dno probówki i natychmiast dodać bufor cytomix23 (stężenie 1,33x) do osadu pasożyta, aby uzyskać stężenie pasożyta 4 - 5 x 107 pasożytów/ml cytomiksu.

Uwaga: Pomiń dodawanie ATP i glutationu do cytomiksu, ponieważ te dodatki nie poprawiają efektywności celowania genów.

  1. Rozmrozić 100 μl podwielokrotności zlinearyzowanego pΔGOI z protokołu 1.1 (krok 26).
  2. Przenieś 0,3 ml roztworu cytomiksu pasożyta (~1,3 - 1,6 x 107 pasożytów) do 100 μl zlinearyzowanego pΔGOI z protokołu 1.1 (krok 26) i natychmiast przenieś całą mieszaninę 0,4 ml pasożyta + pΔGOI do schłodzonej kuwety elektroporacyjnej o szczelinie 2 mm.
  3. Naelektryzować pasożyty napięciem 1,4 kV i 24 Ω.
  4. Odstaw kuwetę transfekcji w temperaturze pokojowej na ~5 minut, a następnie przenieś całą zawartość kuwety transfekcyjnej do kolby o długości 150cm2 zawierającej zbiegające się komórki HFF z 30 ml pożywki infekcyjnej i inkubuj zakażoną kulturę przez noc.
  5. Rozpocznij selekcję w kwasie mykofenolowym + ksantynie (MPA + X) ~ 20 godzin po transfekcji (ryc. 2A), zastępując pożywkę infekcyjną pożywką selekcyjną MPA + X (MPA (25 μg/ml) i ksantyną (50 μg/ml) w pożywce infekcyjnej).

Uwaga: Nie zakłócaj inkubującej kolby selekcyjnej MPA + X.

  1. Oszacuj całkowitą liczbę PFU w kolbie selekcyjnej MPA + X ~ 8 dni po transfekcji, dokonując wizualnej kontroli monowarstwy. Sprawdzić obecność rozwijających się PFU i zdrowych stref infekcji za pomocą mikroskopii świetlnej.

Uwaga: Jeśli blaszki nie są widoczne do 8 dnia, zachowaj selekcję i monitoruj oznaki infekcji, ponieważ zmutowane szczepy mogą mieć zmniejszoną szybkość replikacji.

Uwaga: Szczepy pasożytów Δku80Δ hxgprt mają wyjątkowo niskie tło niepożądanych zdarzeń niedocelowych, co pozwala na udaną izolację zmutowanych szczepów z dość poważnymi, ale nie śmiertelnymi wadami wzrostu. Jeśli gen jest niezbędny i nie można go usunąć, pierwotna transfekcja lub późniejsza przekazana populacja pasożyta może ujawnić fenotyp, w którym pasożyty przestają się replikować podczas selekcji, gdy populacja przechodzi w docelowe nokauty.

  1. Potrząsnąć kolbą jak w kroku 3, aby usunąć zewnątrzkomórkowe pasożyty z monowarstwy [po rozwinięciu się widocznych blaszek] w celu wytworzenia roztworu pasożyta. Przenieść ~0,5 ml roztworu pasożyta z kolby selekcyjnej MPA + X do kolby selekcyjnej25 cm 2 MPA + X zawierającej zbiegające się komórki HFF (oznaczyć tę hodowlę jako 1A).
  2. Usunąć pasożyty z oryginalnej 150 cm2 MPA + X kolby selekcyjnej ~ 3 dni później i przenieść ~0,5 ml roztworu pasożyta do drugiej 25 cm kolby selekcyjnej2 MPA + X zawierającej zbiegające się komórki HFF o średnicy 25 cm 2 (oznaczyć tę hodowlę jako 1B).
  3. Pozwól, aby strefy infekcji rozwinęły się w kolbach przepustowych 1A i/lub 1B przez ~5 dni. Sprawdź wzrokowo za pomocą mikroskopii świetlnej, czy kolby 1A i 1B zawierają co najmniej 25 żywotnych PFU ze zdrowymi strefami infekcji.
  4. Wybrać kolbę przelotową 1A lub przelotową 1B do dalszego przechodzenia w pożywce selekcyjnej MPA + X w kolbach 25 cm2. Zachowaj przejście w obszarze wyboru MPA + X.

Uwaga: Pasożyty muszą być hodowane przez wystarczającą liczbę pokoleń, aby usunąć niezintegrowane, trwałe episomy z populacji przed subklonowaniem. Nie należy wykonywać subklonowania przed 20 dniem po transfekcji w przypadku pasożytów typu I RH Δku80Δhxgprt lub przed 25 dniami po transfekcji w przypadku pasożytów typu II Pru Δku80Δhxgprt, aby zapewnić wystarczający czas na rozcieńczenie niezintegrowanych episomów1,2.

  1. Subklonuj pasożyty w 96-dołkowej tacce zawierającej zbiegające się komórki HFF z pożywką selekcyjną MPA + X. Przygotować jedną tacę o stężeniu 1 pasożyta/studzienkę i drugą tacę o stężeniu 2 pasożytów/studzienkę.

Uwaga: Subklonuj pasożyty, które niedawno uległy lizie (~90 - 95% komórek HFF w kolbie 25 cm), aby zapewnić wysoką żywotność pasożytów.

Uwaga: Optymalny przedział czasowy po transfekcji dla subklonowania został ustalony poprzez zmierzenie, jak szybko skutecznie namierzone pasożyty pojawiają się z dużą częstotliwością w wybranej populacji1.

  1. Kontynuować pasaż pierwotnej populacji transfekowanych pasożytów w pożywce selekcyjnej MPA + X, stosując tygodniowy harmonogram pasażowania polegający na zakażeniu kolby HFF o średnicy 25 cm2 10 μl roztworu pasożyta.

Uwaga: Jeśli klony z docelową delecją genu (nokauty) nie zostaną uzyskane z pierwszego subklonowania w kroku 18, ponownie przeklonuj pasożyty z nieprzerwanie utrzymywanej populacji ~10 - 12 tygodni po transfekcji.

Uwaga: Jednym z powodów, dla których delecja genu nie jest uzyskiwana, jest episomalne utrzymywanie się niektórych plazmidów pΔGOI. Trwałość episomalna jest określana przez sekwencje zawarte w bokach genomowych 5' i 3' i nie wydaje się, aby pochodziła z elementu genetycznego HXGPRT. Około 5 - 10% plazmidów docelowych wykazuje znaczną trwałość episomalną, która wymaga późniejszego czasu subklonowania, aby umożliwić populacji pasożyta wystarczającą liczbę pokoleń, aby rozcieńczyć utrzymujące się episomy i rozdzielić populację na głównie stabilne integranty.

  1. Oceń 96-dołkową tacę 6-7 dni po subklonowaniu (pasożyty typu I) lub 7-8 dni po subklonowaniu (pasożyty typu II) dla studzienek zawierających pojedynczy PFU, zidentyfikowany jako pojedyncza strefa infekcji w mikroskopii świetlnej przy mocy 40X lub 60X. Zaznacz małą kropkę na pokrywie tacki z 96 dołkami, aby wyznaczyć lokalizację PFU w studzience.
  2. Wymieszać zawartość każdej studzienki zawierającej pojedynczy PFU za pomocą pipety ustawionej na 50 μl (końcówka 200 μl), kierując przepływ płynu przez PFU w celu rozproszenia pasożytów w studzience.

Uwaga: Mieszanie studzienki przyspiesza lizę pasożytów monowarstwy HFF. Szczepy RH typu I będą lizować studnię ~ 4 dni po wymieszaniu, pasożyty Pru typu II będą lizować studnię ~ 5 dni po wymieszaniu.

  1. Wybierz kilkanaście zlizanych studzienek (klonów) i wydrap dno każdej z tych zlizowanych studzienek za pomocą końcówki pipety o pojemności 0,5 - 10 μl, jednocześnie pobierając 6 μl roztworu pasożyta. Przenieść 6 μl roztworu pasożyta do studzienki w 24-dołkowej tacy zawierającej zbiegające się komórki HFF w 1 ml pożywki selekcyjnej MPA + X.

Uwaga: Ważne jest, aby drapać dno studni, aby utrzymać otwór otwierający końcówkę pipety w stałym kontakcie z pasożytami znajdującymi się na dnie studni.

  1. Monitoruj 24-dołkową tacę pod kątem lizy komórek HFF.

Uwaga: Pasożyty typu I RH zazwyczaj analizują studnię w formacie 24-dołkowym w ciągu ~4 dni. Pasożyty Pru typu II zazwyczaj poddają się lizie studni w ciągu ~5 dni.

  1. Przenieść 2 μl żywego roztworu pasożyta wydrapanego z dna każdej studzienki w formacie 24-dołkowym do odpowiedniego dołka nowej 24-dołkowej tacy zawierającej zbiegające się komórki HFF i 1 ml pożywki selekcyjnej MPA+X na studzienkę.

Uwaga: Wszystkie klony i linie pasożytów mogą być stale utrzymywane poprzez przepuszczanie 2 μl żywego roztworu pasożyta co 7 dni w tym formacie tacki 24-dołkowej.

  1. Sprawdź, czy pasożyty zostały pomyślnie przeniesione do nowej 24-dołkowej tacy, dokonując oględzin za pomocą mikroskopu świetlnego ~ 18 godzin po pasażu.
  2. Zebrać pasożyty z lizowanych studzienek 24-dołkowej tacy z etapów 23 - 24 za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub 10 ml i przenieść roztwór pasożyta do probówki Eppendorfa.
  3. Osadzać pasożyty w ilości 1 400 x g przez 7 minut, płukać raz w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i ponownie osadzać w 1 400 x g przez 3 minuty.
  4. Odessać PBS z osadu, a następnie dodać 200 μl PBS do osadu, aby ponownie zawiesić pasożyty. Zamrozić roztwór pasożyta w temperaturze -80 °C do czasu izolacji DNA.
  5. Wyizoluj DNA pasożyta z każdego klonu za pomocą minizestawu do izolacji DNA tkankowego.
  6. Zwaliduj docelową delecję genu (nokaut) za pomocą PCR przy użyciu starterów walidacyjnych (ryc. 2A-C). Przeprowadzić test na brak funkcjonalnego regionu kodującego genu będącego przedmiotem zainteresowania i przy użyciu starterów genomowego DNA CxF i CxR (ryc. 2A-B) na obecność produktów PCR, które obejmują boki genomowe i HXGPRT, aby wykazać prawidłową celowaną integrację 5' i 3' genu HXGPRT z usuniętym locus genu.

Uwaga: Startery do walidacji muszą być unikalne dla interesującego genu, w przeciwnym razie można uzyskać fałszywie pozytywny wynik. Projekt startera można zweryfikować na http://www.toxodb.org poprzez wystrzelenie sekwencji starterów do genomu (genomów) w celu sprawdzenia, czy startery są unikalne.

  1. Pasaż pasożyta klonuje się zgodnie z harmonogramem tygodniowym, jak opisano w kroku 24. Po zweryfikowaniu usunięcia docelowego kontynuowanie wyboru w MPA+X jest opcjonalne.
  2. Archiwizuj klony pasożytów, przygotowując zapasy do zamrażania. Osad pasożytów zewnątrzkomórkowych z lizowanych komórek HFF w kolbie hodowlanej o średnicy 25cm2, usunąć pożywkę i delikatnie ponownie zawiesić osad pasożyta w pożywce do zamrażania hodowli komórkowych przy stężeniu pasożyta >4 x 107 pasożytów na ml. Przenieść podwielokrotności do kriowiów i przechowywać pasożyty przez czas nieokreślony w ciekłym azocie lub w temperaturze -80 °C.

2. Usunięcie HXGPRT

Ten protokół jest przeznaczony do usuwania markera HXGPRT z jego miejsca integracji w genomie genetycznie zmodyfikowanego szczepu Δku80. Usunięcie HXGPRT pozwala na odzyskanie markerów i wygenerowanie szczepów z wieloma manipulacjami genetycznymi przy użyciu wyłącznie selekcji opartych na HXGPRT1-3. Podczas gdy protokół szczegółowo opisany poniżej opisuje metodę ponownego ukierunkowania locus w celu usunięcia HXGPRT, należy zauważyć, że usunięcie HXGPRT w miejscu genu będącego przedmiotem zainteresowania umożliwia również jednoczesną reintegrację genu typu dzikiego (komplementacja), reintegrację zmutowanego genu, a także reintegrację znakowanego genu (N- lub C-końcowy GFP, znacznik HA, itp.), co pozwala na różnorodne manipulacje genetyczne. Mechanizmy działania24 i protokoły celowania z wykorzystaniem selekcji 6-tioksantyny zostały wcześniej opisane1-3,15.

2.1 Usuń HXGPRT

  1. Wyciąć marker do wyboru HXGPRT z pΔGOI przez trawienie z RE. Z, aby przeciąć unikalne miejsca enzymów restrykcyjnych po bokach HXGPRT (ryc. 1B).
  2. Sprawdź całkowite trawienie DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Odizoluj większe z dwóch pasm od żelu agarozowego.

Uwaga: Większa z dwóch prążków zawiera plazmid wraz z bokami docelowymi DNA 5' i 3', ale nie gen HXGPRT.

  1. Umieść odcinek agarozy zawierający większe pasmo DNA w kolumnie wirowej, kładąc żel płasko na membranie. Obracać kolumnę w temperaturze 13 000 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Dodać sterylnyH2Odo przepływu, aby doprowadzić objętość do 100 μl.

Uwaga: Dostępne są inne komercyjne metody izolowania DNA z agarozy.

  1. Zagęścić DNA przez wytrącanie EtOH, ponownie zawieszając DNA w końcowej objętości 18 μl sterylnegoH2O.
  2. Wymieszać 1 μl skoncentrowanego DNA z 7 ml H2O, 1 μl 10x buforu ligacyjnego i 1 μl ligazy DNA T4 (5 jednostek) i umieścić reakcję w temperaturze 4 °C na noc w celu wytworzenia pΔGOIc (pΔGOIclean) (Figura 3A).

Uwaga: Fragmenty DNA z RE. Na tym etapie można zaprojektować i uwzględnić końce DNA zawierające Z, aby stworzyć plazmidy odpowiednie do ukierunkowanej reintegracji genu typu dzikiego (komplementacja), ukierunkowanej reintegracji zmutowanego genu, a także ukierunkowanej reintegracji znakowanego genu (N- lub C-końcowy GFP, znacznik HA itp.).

  1. Rozcieńczyć reakcję 2x sterylnymH2Oprzed elektroporacją.
  2. Przekształć pΔGOIc w E. coli, jak w protokole 1.1, aby subklonować, izolować i walidować plazmid docelowy. Następnie linearyzować pΔGOIc w ramach przygotowań do transfekcji (patrz kroki 1.1.11 do 1.1.26).
  3. Powtórz protokół transfekcji pasożytów, jak opisano w protokole 1.2 (kroki od 1 do 11).

Uwaga: Przed przeprowadzeniem kroków od 1 do 8 sprawdź, czy celowe usunięcie HXGPRT jest możliwe w zmutowanym szczepie. Zakażoną kolbę o długości150 cm2 zlewających się komórek HFF 1 x 106 tachyzoitów zmutowanego szczepu przy użyciu pożywki selekcyjnej 6-tioksantyny (6TX) (200 μg/ml 6TX w pożywce infekcyjnej) i umieścić kolbę w teście PFU. Sprawdzić kolbę 8 dni później, aby upewnić się, że nie widać (lub jest ich bardzo mało; <10) PFU, co jest niezbędne do ustalenia, że potencjalna skuteczność celowania genu przekroczy potencjalną spontaniczną rewersję zmutowanego szczepu do fenotypu o obniżonej ekspresji HXGPRT (fenotyp oporności 6TX).

Uwaga: Około 5 - 10 % miejsc integracji HXGPRT wykazuje znaczącą i spontaniczną częstotliwość oporu 6TX, mimo że marker HXGPRT jest nadal zintegrowany w miejscu docelowym (zobacz sekcję Reprezentatywne wyniki w celu wyjaśnienia).

  1. Rozpocznij selekcję 6TX ~20 godzin po transfekcji, zmieniając pożywkę w kolbie 150 cm2 na pożywkę selekcyjną 6TX.

Uwaga: Nie naruszaj kolby przez ~10 dni po transfekcji.

  1. Sprawdzić kolbę pod kątem tworzenia się PFU w dniu 10-12 po transfekcji (pasożyty typu I) lub w dniu 10-16 po transfekcji (pasożyty typu II).

Uwaga: Pasożyty będące celem delecji HXGPRT nie zaczną rosnąć pod selekcją 6TX, dopóki gen HXGPRT i mRNA nie zostaną usunięte, a pozostałe białko HXGPRT nie zostanie dezaktywowane.

  1. Wstrząsnąć kolbą selekcyjną w celu wytworzenia roztworu pasożyta i przenieść 0,5 - 1,0 ml roztworu pasożyta do nowej kolby o długości 25cm2 zawierającej zbiegające się komórki HFF i 5 ml pożywki selekcyjnej 6TX. Powtarzać przenoszenie z pierwotnych kolb o średnicy 150cm2 do nowych kolbo średnicy 25 cm raz dziennie przez kolejne dwa dni.

Uwaga: Wielokrotne pobieranie próbek zwiększa szanse na schwytanie żywotnych pasożytów, które utraciły gen HXGPRT.

  1. Sprawdź kolby o średnicy 25 cm2 ~ 5 dni po zakażeniu, aby zweryfikować obecność rozwijających się PFU ze strefami zdrowych replikujących się pasożytów. Wybrać jedną lub dwie kolby zawierające strefy infekcji.

Uwaga: Pasożyty usunięte z genu HXGPRT replikują się w normalnym tempie wzrostu w selekcji 6TX.

  1. Kontynuuj przechodzenie pasożytów w pożywce selekcyjnej 6TX.
  2. Sklonuj populację pasożyta po 25 - 30 dniach selekcji. Ustaw jedną 96-dołkową tacę z ~ 1 pasożytem/studzienką, a drugą z ~ 2 pasożytami/studzienką.
  3. Przygotuj DNA pasożyta z izolowanych klonów i utrzymuj klony w kulturze w formacie 24-dołkowym zgodnie z protokołem 1.2 (kroki od 19 do 29).
  4. Zatwierdzić usunięcie HXGPRT metodą PCR, stosując strategię opisaną na rysunkach 3A-B.

3. C-końcowe znakowanie białek

Ten protokół jest przeznaczony do znakowania białek na C-końcu poprzez ukierunkowanie znacznika na integrację poprzez podwójną krzyżową rekombinację homologiczną w genomowym locus genu przy użyciu selekcji MPA + X2,4. Protokół ten działa wydajnie, ponieważ sekwencja 5' dhfr markera HXGPRT jest w pełni zwalidowanym funkcjonalnym regionem 3' bez translacji dla innych genów2,4.

3.1 Bezpośrednie znakowanie C-końcowe białek w endogennych loci genetycznych

  1. Utwórz celujący konstrukt plazmidu pΔGOItag przy użyciu klonowania rekombinacyjnego drożdży (ryc. 4) i metod opisanych w protokole 1.1. Bok celowania genomowego 5' zawiera ostatnie 800 do 1,200 pz regionu kodującego (lub genomowego DNA) GOI, z wyjątkiem kodonu terminacji, który jest przesunięty na pozycję 3' do wybranego znacznika (znacznik HA, znacznik Myc, znacznik His itp.)
  2. Utwórz ukierunkowaną insercję znacznika C-końcowego w endogennym locus genu kodującego białko, postępując zgodnie z krokami opisanymi w protokole 1.1 i 1.2, stosując opisaną strategię (Figura 4).
  3. Sprawdź wstawienie znacznika C-końcowego w endogennym locus genu za pomocą strategii PCR.
  4. Ponownie ukierunkować locus genu za pomocą metod opisanych w protokole 1 i protokole 2 w celu usunięcia selektywnego markera HXGPRT w celu stworzenia precyzyjnie regulowanego endogennego locus genu, który wyraża znakowane białko. Protokół ten odzyskuje również marker wybieralny HXGPRT, który może być ponownie użyty do celowania w inny locus w oznakowanym szczepie (patrz protokół 1).

Wyniki

Przedstawiono szczegółowy szablon konstrukcji plazmidu celującego służącego do delecji genu, obejmujący rozmieszczenie miejsc cięcia enzymów restrykcyjnych oraz projektowanie starterów ułatwiających celowanie genetyczne i walidację delecji genu, a także konstrukcję plazmidu do późniejszej delecji HXGPRT w procesie jednokrokowym (Rysunki 1A-C, Rysunek 2A, Rysunek 3A). Zaprezentowano ogólny schemat wykonywania celowanej delecji genu (Rysunek 2A), pary starterów wykorzystywane do walidacji nokautu, na przykład typu I rop18 (Rysunek 2B) oraz reprezentatywne wyniki walidacji metodą PCR (Rysunek 2C). Reprezentatywny wynik ten służy zilustrowaniu zakresu rezultatów, jakie można uzyskać w przypadku loci genetycznych, które są stosunkowo trudne do celowania. Pomyślnie przeprowadzona celowana delecja genu objawi się brakiem produktu PCR dla badanego genu (PCR 1), obecnością 3' flanki celowania genomicznego (PCR 2) oraz obecnością markera selekcyjnego HXGPRT prawidłowo zintegrowanego pomiędzy 5' a 3' flankami celowania genomicznego definiującymi delecję (PCR 3 i PCR 4). Klony 3, 4, 5, 6, 8, 9 i 11 są zwalidowanymi celowanymi delecjami genów (nokautami), w których HXGPRT zastąpił badany gen (Rysunek 2C).

Klon, który nie zawiera delecji genu, może być reprezentowany przez różne wzory prążkowania. Typowo klon bez delecji genu odzwierciedla szczep rodzicielski (wzór rodzicielski) z prążkami widocznymi dla PCR1 i PCR2, ale nie dla PCR3 lub PCR4, co widać w przypadku klonów 1 i 2 (Rysunek 2C). Ten „wzór rodzicielski” wynika z kilku potencjalnych mechanizmów. Sporadycznie wyselekcjonowane pasożyty oporne na MPA przenoszą niezlączone, utrzymujące się episomy plazmidu celującego pΔGOI; zauważamy, że dalsza selekcja często wymusza integrację tych episomów. Obserwujemy również rzadkie tło w szczepie typu I Δku80 z powodu niezamierzonej integracji plazmidu celującego pΔGOI, który zawiera cDNA HXGPRT ekspresyjne poprzez elementy promotora 5' i 3' DHFR, albo w locus DHFR, albo w częściowo usuniętym locus HXGPRT14. Choć to rzadkie zdarzenie jest integracją celowaną, nie była ona zamierzona i stanowi kluczowy punkt do zapamiętania przy projektowaniu każdej strategii wymiany genu. Homologia DNA większa niż 120 bp zawarta w plazmidzie celującym pΔGOI może dostarczyć alternatywnego miejsca rekombinacji w szczepach Δku802, co może prowadzić do powstania niepożądanego tła. W szczepie typu II Pru Δku80 tło to jest zredukowane lub nieobecne w porównaniu z typem I, ponieważ marker selekcyjny HXGPRT oparty jest na sekwencjach typu I, które wykazują polimorfizmy nukleotydowe w porównaniu z DNA typu II, co znacznie zmniejsza to rzadkie tło w eksperymentach z wykorzystaniem szczepu typu II Pru Δku801. Jeśli locus genu jest niezbędny (nie może zostać usunięty), wykazuje ekstremalnie niską częstotliwość celowania w locus, lub jeśli utrzymujące się [niezlączone] episomy nie są łatwo eliminowane poprzez wzrost i selekcję, wzór rodzicielski będzie dominował nad wzorem obserwowanym w klonach opornych na MPA. Alternatywnie, czasami obserwuje się integrację cząsteczki DNA celującego tylko w obrębie 5' lub 3' flanki genomowej i prążek jest widoczny dla PCR3 lub PCR4 (ale nie dla obu) wraz z PCR1 i PCR2, co widać w przypadku klonu 10 (integracja 5') i klonu 7 (integracja 3') (Rysunek 2C). Wzory te sugerują rzadkie występowanie pojedynczego crossoveru integracji plazmidu celującego w locus, który integruje HXGPRT, ale ta integracja celowana nie usuwa genu zainteresowania. Ten wzór (ścieżki 7 i 10 na Rysunku 2C) podkreśla konieczność raportowania danych PCR w celu weryfikacji, czy nastąpiła integracja celowana, a nie pojedynczy homologiczny crossover i druga niehomologiczna integracja cząsteczki celującej. Rzadko obserwujemy mieszaninę genetyczną reprezentowaną przez klon 12 (Rysunek 2C), która wykazuje zarówno wzór rodzicielski, jak i wzór delecji celowanej. Ten wzór najprawdopodobniej wynika sporadycznie z obecności dwóch genotypów pasożytów w tym samym miejscu w studzience klonowania.

Ogólny schemat usuwania HXGPRT z Δku80Δgoi::HXGPRT w celu usunięcia HXGPRT ze szczepu został przedstawiony (Rysunek 3A). Para starterów użyta do walidacji usunięcia HXGPRT z Δku80Δgra2::HXGPRT (Rysunek 3B)) amplifikuje unikalny prążek o wielkości ~1.2 Kbp w PCR5, co widać w klonach 4, 7, 9, 11 i 12 (Rysunek 3C). Jeśli HXGPRT nie zostanie usunięty z locus, obserwuje się prążek ~3.4 Kbp (klony 1, 2, 3, 6, 8, 10 oraz kontrola rodzicielska). Kilka mechanizmów sprawia, że usuwanie HXGPRT (selekcja 6TX) jest trudniejsze i mniej wydajne niż integracja HXGPRT (selekcja MPA + X). Selekcja MPA jest po prostu bardziej wydajna niż selekcja 6TX14,16. Ponadto do selekcji 6TX wymagane są wyższe poziomy ekspresji HXGPRT niż do selekcji MPA16,24. W konsekwencji mutacje, które mogą obniżyć aktywność enzymatyczną HXGPRT, lub mutacje bądź zmiany epigenetyczne obniżające poziom ekspresji HXGPRT w locus genu, mogą potencjalnie znieść skuteczność selekcji 6TX. Mimo tych trudności związanych z selekcją 6TX, wskaźnik sukcesu selekcji 6TX w szczepach Δku80 wynosi ponad 90% przy pierwszej próbie1-3.

Ogólny schemat bezpośredniego znakowania C-końca genów kodujących białka przedstawiono na (Rysunku 4). Schemat ten wykorzystuje bezpośrednią integrację poprzez podwójną rekombinację homologiczną z krzyżowaniem w obrębie 3' genu znakowanego z HXGPRT, a także stosuje strategie walidacji podobne do opisanych powyżej. W przypadku podejrzenia, że gen jest genem niezbędnym, można to zweryfikować za pomocą drugiej transfekcji z niezależnie wyizolowanym plazmidem DNA celującego. W celu dalszej weryfikacji, czy gen jest niezbędny, dostępne są alternatywne metody, takie jak schematy regulowanej ekspresji genów25.

Schemat edycji genów z plazmidem pRS416, genem HxGPRT, starterami i tabelą sekwencji do analizy PCR.
Rysunek 1. Przegląd projektu plazmidu z DNA celującym. A. Schemat projektowania starterów z nakładkami stosowanych do amplifikacji PCR flanki 5' i 3' celu z 33 pb nakładkami dla wektora wahadłowego pRS416 i kasety minigenu HXGPRT. Startery przedstawione na schemacie posłużyły do wygenerowania flanki 5' i 3' celu dla pΔROP1810. B. Ogólna strategia projektowania cząsteczki DNA celującego. Szkieletem pΔGOI jest wektor wahadłowy pRS416 zawierający markery selekcyjne uracylu (URA) i ampicyliny (AMP). Do pRS416 wstawiona jest flanka 5' DNA celu o długości ~1 Kbp amplifikowana z DNA genomowego z nakładkami dla kasety minigenu HXGPRT i pRS416 przy użyciu starterów F1 i R1, flanka 3' DNA celu o długości ~1 Kbp amplifikowana z DNA genomowego z nakładkami dla kasety minigenu HXGPRT i pRS416 przy użyciu starterów F2 i R2 oraz kaseta minigenu HXGPRT. Do starterów dodano następujące unikalne miejsca cięcia enzymów restrykcyjnych: RE.X (miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego X) w starterze F1 w celu przecięcia plazmidu na końcu 5' flanki 5' DNA celu, RE.Y w starterze R2 w celu przecięcia plazmidu na końcu 3' flanki 3' DNA celu oraz RE.Z w starterach R1 i F2 w celu wycięcia kasety minigenu HXGPRT. C. Sekwencje starterów użytych do wygenerowania konstruktu celującego do delecji rop18. Regiony pogrubione odpowiadają sekwencji genomowej T. gondii, a regiony niepogrubione odpowiadają miejscom cięcia enzymów restrykcyjnych i sekwencjom nakładającym się na pRS416 i kasetę minigenu HXGPRT. Para starterów HX_F i HX_R amplifikuje kasetę minigenu HXGPRT14. Startery odczytane od 5' do 3'. Tabela zaadaptowana z Fentress et al10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony rysunek.

Schemat edycji genów z procesem PCR, starterami i wynikami elektroforezy żelowej dla analizy DNA.
Rycina 2. Przegląd protokołu delecji genu z wykorzystaniem HXGPRT. A. Przerwanie GOI w szczepie Δku80Δhxgprt poprzez zdarzenie podwójnej homolologicznej rekombinacji krzyżowej z użyciem ok. 1 Kbp 5' flankującego fragmentu DNA celu i ok. 1 Kbp 3' flankującego fragmentu DNA celu na plazmidzie pΔGOI. Przedstawiono strategię PCR z użyciem PCR1, PCR2, PCR3 i PCR4 (nie w skali), która umożliwia weryfikację genotypu w celu walidacji klonów z ukierunkowaną integracją HXGPRT i delecją locus GOI. B. Reprezentatywne pary starterów zaprojektowane w celu walidacji delecji rop18. ROP18_DF i ROP18_DR amplifikują PCR1, ROP18_ExF i ROP18_CxR amplifikują PCR2, ROP18_CxF i DHFR_CxR amplifikują PCR3, a DHFR_CxF i ROP18_CxR amplifikują PCR4 (patrz Rycina 2A). Startery odczytane od 5' do 3'. Tabela zaadaptowana z Fentress et al10. C. Reprezentatywne wyniki walidacji ukierunkowanej delecji genu (rop18) z wykorzystaniem HXGPRT. Po transfekcji plazmidu pΔROP18 do Δku80Δhxgprt i selekcji w MPA+X, klony oporne na MPA+X poddano badaniu w kierunku delecji rop18. Kontrolny szczep rodzicielski jest dodatni dla produktów PCR 1(~400 bp) i PCR 2 (~650 bp) oraz ujemny dla produktów PCR 3 (~1 200 bp) i PCR 4 (~1 300 bp). Ukierunkowany knockout GOI jest dodatni dla produktów PCR2, PCR3 i PCR4 oraz ujemny dla produktu PCR 1 (patrz Rycina 2A). Przedstawiono reprezentatywne panele wyników PCR1 i PCR2 (panel górny), PCR3 (panel środkowy) i PCR4 (panel dolny). Klony 3, 4, 5, 6, 8, 9 i 11 wykazują prawidłowy wzór prążków dla PCR 1, PCR2, PCR3 i PCR4, co definiuje zdarzenie ukierunkowanej delecji genu w klonie. Klony 1, 2, 7, 10 i 12 nie są delecjami genowymi i odpowiadają innym potencjalnym reprezentatywnym wynikom. (C = kontrolny szczep rodzicielski Δku80Δhxgprt, M = markery wielkości). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Schemat procesu modyfikacji genetycznej z PCR, sekwencjami flankującymi i wynikami elektroforezy żelowej.
Rysunek 3. Przegląd protokołu ponownego celowania genu zainteresowania w celu usunięcia HXGPRT. A. Strategia usunięcia markera selekcyjnego HXGPRT poprzez zdarzenie podwójnej homologicznej rekombinacji krzyżowej w szczepie Δku80Δgoi::HXGPRT przy użyciu flanki 5' docelowego DNA o długości ~1 Kbp i flanki 3' docelowego DNA o długości ~1 Kbp na plazmidzie pΔGOIc. Strategia PCR dla weryfikacji genotypu jest przedstawiona z użyciem pary starterów do analizy produktu PCR (PCR5), który obejmuje delecję (nie w skali). B. Reprezentatywna para starterów zaprojektowana w celu walidacji usunięcia markera selekcyjnego HXGPRT z locus gra2 w szczepie Δku80Δgra2::HXGPRT. Startery GRA2 _CLF i GRA2_CxR amplifikują PCR5. Startery czytane są od 5' do 3'. C. Reprezentatywny panel klonów opornych na 6TX, które mogą zostać uzyskane po transfekcji plazmidu pΔGOIc do Δku80Δgoi::HXGPRT i selekcji w 6TX. Klony 4, 7, 9, 11 i 12 wykazują prawidłowy wzór prążków PCR5, który odpowiada celowanej delecji markera HXGPRT (produkt ~1.2 Kbp obejmujący flankę 3' z niewielkim nakładaniem na flankę 5' i poza flankę 3'). Klony 1, 2, 3, 6, 8 i 10 (ten prążek jest słaby) reprezentują oczekiwany wzór prążków o długości około ~3.4 Kbp, który odpowiada genotypowi klonu rodzicielskiego, mimo że klony te wykazały stopień oporności na 6TX, który umożliwił ich selekcję (fenotyp ten może sporadycznie pojawić się spontanicznie w wyniku wyciszenia ekspresji HXGPRT (patrz uwaga w protokole 2.1 (krok 8) i sekcja Reprezentatywne Wyniki). (C = rodzicielski szczep kontrolny Δku80Δgoi::HXGPRT, M = markery wielkości). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Schemat procesu edycji genów z integracją GOI przy użyciu strategii selekcji HXGPRT i MPA.
Rysunek 4. Projekt cząsteczki DNA celującego w celu oznakowania końca C-terminalnego białka. Strategia opiera się na zdolności markera HXGPRT do pełnienia funkcji 3' regulatorowego regionu downstream. Szkielet pΔGOItag stanowi wektor wahadłowy pRS416 zawierający markery selekcyjne uracylu (URA) i ampicyliny (AMP). Do pRS416 wstawiono flankujący fragment DNA 5' o długości ~1 Kbp, namnożony z DNA genomicznego z nakładkami dla kasety minigenu HXGPRT i pRS416 przy użyciu starterów Fgoi i Rtag; flankujący fragment DNA 3' o długości ~1 Kbp jest namnażany z DNA genomicznego z nakładkami dla kasety minigenu HXGPRT i pRS416 przy użyciu starterów F2 i R2 oraz kasety minigenu HXGPRT. Flankujący fragment DNA 5' zastępuje kodon stop znacznikiem (HA, Myc, His itd.), po którym następuje zastępczy kodon stop. Selekcja MPA + X integruje znacznik C-terminalny oraz downstream HXGPRT i przesuwa 3' UTR na pozycję następującą po markerze HXGPRT. Do starterów dodano następujące unikalne miejsca cięcia enzymów restrykcyjnych: RE.X (miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego X) w starterze Fgoi, aby przeciąć plazmid na końcu 5' flankującego fragmentu DNA 5', RE.Y w starterze R2, aby przeciąć plazmid na końcu 3' flankującego fragmentu DNA 3', oraz RE.Z w starterach Rtag i F2, aby wyciąć kasetę minigenu HXGPRT do wykorzystania w konstrukcji plazmidu w celu ponownego celowania w locus genu z znacznikiem, aby usunąć marker HXGPRT, co przywróci pierwotne położenie 3' UTR.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznego celowania w geny w szczepach pasożytów Δku80 , aby umożliwić skuteczne odzyskiwanie genetycznie zmodyfikowanego potomstwa, które posiada docelowe delecje genów, wymianę genów i/lub oznakowane geny. Sekwencyjne wykonywanie tych metod zapewnia wiarygodne podejście do izolacji mutantów pasożytów, które zawierają jedną lub wiele ukierunkowanych manipulacji genetycznych1-3. Podczas gdy generowanie docelowej delecji zależy od wielu czynników, zastosowanie szczepu Δku80 z przedstawioną strategią i protokołem znacznie zwiększa wydajność i łatwość tworzenia precyzyjnie zdefiniowanych zmutowanych szczepów T. gondii do funkcjonalnych badań genomicznych.

Genom T. gondii w stadiach bezpłciowych jest haploidalny. W związku z tym planując usunięcie genu, należy wziąć pod uwagę, że gen nie może być niezbędny in vitro. Niemniej jednak skuteczność celowania w nokauty genów w szczepach Δku80 jest niezwykle wysoka, co umożliwia izolację zmutowanych szczepów o znacznie upośledzonych szybkościach replikacji. Jeśli docelowy gen jest niezbędny, pasożyty często przestają się replikować podczas selekcji. Innym krytycznym czynnikiem w ukierunkowanej manipulacji genetycznej jest to, że do uzyskania wykrywalnych celowanych integracji wymaganych jest doskonała homologia z co najmniej 620 pz genomowego bokucelowania2. Dłuższe obszary homologii zapewniają wyższą skuteczność celowania, a użycie docelowych boków DNA o długości około 1000 pz jest niezawodnym i wydajnym podejściem1-4. Z tego powodu ważne jest, aby boki ukierunkowane genomowo były generowane z tego samego szczepu T. gondii (RH, Pru), co szczep, który jest poddawany manipulacji genetycznej. Brak wystarczającej homologii może często prowadzić do ukierunkowanej integracji jednej flanki genomowej, ale nie drugiej. Niepełna integracja lub niepowodzenie w uzyskaniu nokautu może być również spowodowane utrzymywaniem się epizodycznie. Bezpośrednio po transfekcji wszystkie cząsteczki docelowe są niezintegrowanymi episomami, a czasami cząsteczki celujące mogą utrzymywać się jako episomy przez wiele pokoleń. Użycie docelowych boków DNA o wartości ~1 Kbp i kontynuowanie przenoszenia pasożytów podczas selekcji przed ponownym subklonowaniem często rozwiązuje problemy związane z trwałością episomalną.

Po walidacji nokautu i usunięciu markera HXGPRT, strategię celowania w gen można powtórzyć na drugim GOI, aby wygenerować wiele delecji genów w jednym szczepie pasożyta1-3. Generowanie delecji, zamienników lub znakowanych genów można również osiągnąć przy użyciu różnych selektywnych markerów (bleomycyna, CAT, DHFR oporny na pirymetaminę itp.). Chociaż marker selektywny CAT jest obecnie obecny w genomie1 typu II Δku80 Pru, marker ten można usunąć za pomocą opisanego tutaj protokołu selekcji HXGPRT. W naszych rękach selekcja HXGPRT jest najbezpieczniejszym i najbardziej wydajnym markerem o najwyższej skuteczności celowania, w którym ukierunkowana insercja z pojedynczą kopią jest wystarczająca do solidnej selekcji w pożywce MPA + X. HXGPRT zapewnia również jedyne obecnie użyteczne podejście do celowanej delecji wybieralnego markera (Figura 3) przy użyciu selekcji 6-tioksantyny (6TX)2,3. W związku z tym protokół ten stanowi jedyne aktualne podejście do opracowywania zdefiniowanych zmutowanych szczepów z kilkoma ukierunkowanymi manipulacjami genetycznymi.

Protokół ten stanowi cenną i skuteczną metodę ukierunkowanej manipulacji genetycznej w szczepach Δku80 Toxoplasma gondii i ma zastosowanie do analizy pojedynczego genu, rodziny genów lub funkcjonalnych badań genomowych całego genomu. Przed udostępnieniem szczepów Δku80 1,2 podejścia te nie były powszechnie wykonalne ze względu na nieskuteczność tych metod. W związku z tym protokół ten ma szerokie zastosowanie w ukierunkowanej manipulacji genetycznej Toxoplasma gondii i jest dostępny dla wszystkich badaczy zainteresowanych odpowiedzią na szereg pytań dotyczących biologii pasożytów, odpowiedzi gospodarza i genomiki funkcjonalnej.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z NIH dla DJB (AI041930, AI073142, AI075931 i AI091461).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Overlap PrimersZintegrowane technologie DNA 4nmole Ultramer DNA oligonukleoty
Walidacja StarteryZintegrowane technologie100 nmole DNA Oligo
Szczep drożdży #90845Oznaczenie ATCCFY834
Shuttle Vector pRS416ATCC87521
DH10B E. coliInvitrogen12033-015Rosół SOC w zestawie z E. coli
Bufor do resuspensjiQiagenBufor P1 w QIAprep Spin Miniprep
Kit Zestaw miniprepQiagen27104QIAprep Spin Miniprep
Kit Szklane koralikiScientific IndustriesSI-BG050,5 mm myta kwasem
zautomatyzowana zrobotyzowana stacja robocza QiacubeQiagen
Kuweta do elektroporacjiUSA Scientific9104-5050
Elektroporator BTX600Zestaw BTX
MaxiprepQiagen12662QIAprep Spin Maxiprep Kit
25 cm2 Kolba uszczelniająca z zatyczką z przechyloną szyjkąCorning430168
150 cm2 Kolba uszczelniająca z przechyloną szyjkąCorning430823
Ludzkie komórki fibroblastów napletka (HFF)ATCCSCRC1041
Uchwyt filtra Swin-lok Whatman420200średnicy 25 mm
Whatman110612Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm wielkość porów, średnica 25 mm
Kwas mykofenolowy (MPA)Sigma
Xanthine (X)Sigma
96-dołkowa taca do hodowli tkankowychCorning Costar
24-dołkowa taca do hodowli tkankowychCorning Costar
MEM Eagle MediaLonza Biowhittaker12-611F
Płodowa surowica bydlęcaGibco26140-111
Antybiotykowo-przeciwgrzybicza (anty-anty)Gibco15240-062
Kolumna wirującaPrimm LabsPAE-100Easy Clean DNA Extraction Spin Kit
T4 DNA Ligaza DNANew England Biolabs
6-tioksantynaAcros Organics
Tissue DNA MinikitQiagen51104QIAamp DNA Blood Mini Kit
Pożywka do zamrażania/odzyskiwania kultur komórkowychGibco126-48-010
Hyconsoli fizjologicznej buforowany fosforanamiSH30028,02minus wapń, minus magensium
DNA z odstępem 2 mm Membrana o

Bibliografia

  1. Fox, B. A., et al. Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection. Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).
  2. Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).
  3. Fox, B. A., Bzik, D. J. Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii. Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).
  4. Hortua Triana, M. A., et al. Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).
  5. Kim, K., Weiss, L. M. Toxoplasma gondii: the model apicomplexan. Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).
  6. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).
  7. Kim, K., Weiss, L. M. Toxoplasma: the next 100 years. Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).
  8. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS pathogens. 7, e1002236(2011).
  9. Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility. Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).
  10. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).
  11. Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA. Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).
  12. Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii. PLos Pathog. 7, e1002007(2011).
  13. Szatanek, T., et al. Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).
  14. Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation. J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).
  15. Donald, R. G., Roos, D. S. Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis. Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).
  16. Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine. Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).
  17. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).
  18. Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast. Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).
  19. Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation. Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).
  20. Roos, D. S. Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).
  21. Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).
  22. Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).
  23. vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20, 2902(1992).
  24. Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine. Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).
  25. Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion. Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wymiana genurekombinacja homologicznaszczepy delta ku80marker HXGPRTdelecja genucelowana insercjawalidacja PCRtransfekcja paso yt wizolacja klonalna

Powiązane artykuły