Artykuł metodologiczny

Zastosowanie cytometrii obrazowej do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza

DOI:

10.3791/50599

⸱

19 czerwca 2013

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Merrimack College, 2Center for Biotechnology and Biomedical Sciences, Merrimack College, 3Department of Technology R&D, Nexcelom Bioscience LLC

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy, jak cytometria obrazowa może być wykorzystana do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza w hodowli. Ta technika może być używana jako alternatywa dla wyliczania CFU.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania mechanizmów patogenezy komórkowej chorobotwórczych drożdży, takich jak Candida albicans, Histoplasma capsulatum, i Cryptococcus neoformans, często wykorzystują infekcję gospodarzy ssaków lub komórek gospodarza (np. makrofagów), a następnie kwantyfikację drożdży za pomocą analizy jednostek tworzących kolonie lub cytometrii przepływowej. Podczas gdy liczenie jednostek tworzących kolonie jest najczęściej stosowaną metodą w tej dziedzinie, technika ta ma wady i ograniczenia, w tym powolny wzrost niektórych gatunków grzybów na pożywkach stałych oraz niską i/lub zmienną wydajność posiewu, co jest szczególnie niepokojące przy porównywaniu wzrostu szczepów typu dzikiego i zmutowanych. Cytometria przepływowa może dostarczyć szybkich informacji ilościowych na temat żywotności drożdży, jednak zastosowanie wykrywania metodą cytometrii przepływowej dla drożdży chorobotwórczych było ograniczone z wielu powodów praktycznych, w tym ze względu na wysokie koszty i bezpieczeństwo biologiczne. Tutaj demonstrujemy metodologię cytometryczną opartą na obrazie przy użyciu Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) do ilościowego oznaczania żywotnych drożdży chorobotwórczych we wspólnej hodowli z makrofagami. Nasze badania koncentrują się na wykrywaniu dwóch patogenów grzybiczych człowieka: Histoplasma capsulatum i Candida albicans. H. capsulatum kolonizuje makrofagi pęcherzykowe poprzez replikację w fagosomie makrofagów, a tutaj ilościowo oceniamy wzrost drożdży H. capsulatum w makrofagach RAW 264.7 za pomocą barwienia pomarańczą akrydynową/jodkiem propidyny w połączeniu z cytometrią obrazową. Nasza metoda wiernie odwzorowuje trendy wzrostu mierzone tradycyjnym liczeniem jednostek tworzących kolonie, ale ze znacznie zwiększoną czułością. Dodatkowo bezpośrednio oceniamy zakażenie żywych makrofagów szczepem C. albicans wykazującym ekspresję GFP. Nasza metodologia oferuje szybkie, dokładne i ekonomiczne środki do wykrywania i ilościowego oznaczania ważnych patogenów grzybiczych u ludzi w połączeniu z komórkami gospodarza.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z ich gospodarzami i/lub komórkami gospodarza często wymagają ilościowego określenia żywotnych komórek grzybów w czasie lub w różnych warunkach infekcji. Wyliczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) jest standardową metodą, za pomocą której mierzy się liczbę żywotnych komórek grzybów, jednak technika ta ma kilka wad i ograniczeń. Po pierwsze, wiele gatunków grzybów rośnie powoli. Wzrost widocznych kolonii na pożywkach stałych może trwać 1-2 tygodnie, co znacznie spowalnia tempo badań. Po drugie, manipulowanie próbkami podczas posiewu CFU jest pracochłonnym procesem, ponieważ należy posiać kilka rozcieńczeń, aby zapewnić policzalną liczbę kolonii. Po trzecie, liczba CFU jest zwykle niższa niż liczba żywotnych organizmów posianych, ponieważ wydajność posiewu jest znacznie poniżej 100%. Na przykład skuteczność posiewu dimorficznego patogenu grzybowego Histoplasma capsulatum może wynosić nawet 90%, ale zwykle wynosi zaledwie 30%, a jest jeszcze niższa (10%) w przypadku pokrewnego dimorfu grzyba Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Skuteczność posiewu Candida albicans również podlega zmienności 3. Wreszcie, analiza CFU uwzględnia tylko żywe i aktywnie dzielące się komórki zdolne do rozpoczęcia wzrostu na pożywkach stałych, podczas gdy w wielu sytuacjach przydatne byłoby określenie obecności i stężenia martwych i/lub metabolicznie nieaktywnych komórek.

Poprzednio, metody cytometrii przepływowej do oznaczania ilościowego kilku gatunków grzybów chorobotwórczych zostały opisane 4-6. Jednak ze względu na problemy związane z ograniczaniem bezpieczeństwa biologicznego związane ze stosowaniem patogenów na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) lub BSL3 na cytometrach ze wspólnym przepływem, zastosowanie tej techniki było ograniczone. Podobnie jak cytometria przepływowa, cytometria obrazowa jest czułą i szybką metodą oznaczania ilościowego komórek. Jednak cytometrię obrazową można wykonać za ułamek kosztów z porównywalnymi wynikami 7-11. W tym miejscu opisano metody wykonywania cytometrii obrazowej grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza. Demonstrujemy nasze metody z wykorzystaniem dwóch ludzkich patogenów grzybiczych: Histoplasma capsulatum i Candida albicans. H. capsulatum jest dymorficznym patogenem grzybiczym, który powoduje choroby układu oddechowego; U ludzi rośnie jako pączkujące drożdże i replikuje się w makrofagach pęcherzykowych. Candida albicans to ludzki gatunek komensalny, który czasami powoduje kandydozę. Pokazujemy, że cytometria obrazowa pozwala na szybkie określenie ilościowe tych drożdży, wraz z możliwością wizualizacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zakażenie makrofagów H. capsulatum, C. albicans

  1. 16 godzin przed infekcją wysiewaj makrofagi o pożądanej gęstości na płytkach 24-dołkowych. W tym protokole zastosowano gęstość 3,0 x 105 komórek/studzienkę.
  2. Dodaj komórki grzybów we wzroście w fazie logarytmicznej przy pożądanej wielokrotności infekcji (MOI). Ten protokół może obsługiwać zakres MOI (0,2 - 5,0). Do zakażenia makrofagów RAW264.7 H. capsulatum użyliśmy MOI 0,2.
  3. Po 1,5 godziny, aby umożliwić fagocytozę, przemyj makrofagi trzykrotnie PBS, aby usunąć grzyby zewnątrzkomórkowe.
  4. Inkubować przez żądaną liczbę godzin przed analizą próbki. Przy niskim MOI (0,2 w naszym eksperymencie) zakażone komórki makrofagów pozostają żywotne przez kilka dni, a próbki można analizować mniej więcej co 12-24 godziny.

2. Liza makrofagów

  1. Aby uwolnić grzyby z komórek makrofagów, usuń pożywkę, przemyj 3 razy PBS i dodaj 0,5 ml sterylnej wody. W tych warunkach makrofagi ulegną lizie, a komórki grzybów pozostaną nienaruszone.
  2. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Przenieś lizat do sterylnej probówki, trzymaj na lodzie.
  4. Przenieść 20 μl lizatu do osobnej probówki, a następnie dodać 20 μl roztworu AO/PI. Przejdź bezpośrednio do kroku 5: "Przygotowanie próbki do analizy cytometrycznej obrazu"

3. Poszycie CFU

  1. Przeprowadzić dziesięciokrotne rozcieńczenie lizatów (od kroku 2.3) w pożywce.
  2. Umieścić 100 μl każdego rozcieńczenia, w dwóch egzemplarzach, na płytkach HMM-agarozy. Inkubować płytki w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 7-8 dni.
  3. Ręcznie policz kolonie na tabliczkach wyświetlających co najmniej 100 i maksymalnie 1,000 odrębnych kolonii.

4. Wizualizacja grzybów w żywych makrofagach

  1. Aby zebrać żywe makrofagi, umyj komórki 3 razy PBS. Dodać 0,5 ml PBS i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Aby usunąć makrofagi z dołków hodowli tkankowych, delikatnie pipetuj w górę iw dół kilka razy. Przenieś płyn do sterylnej probówki, trzymaj na lodzie.
  3. Przenieść próbkę o objętości 20 μl do osobnej probówki, a następnie dodać 20 μl roztworu AO/PI. Przejdź bezpośrednio do kroku 5: "Przygotowanie próbki do analizy cytometrycznej obrazu".

5. Przygotowanie próbki do analizy cytometrycznej obrazu

  1. Dokładnie odpipetować próbkę docelową, a następnie przenieść 20 μl próbki do jednorazowej komory zliczania komórek.
  2. Pozwól komórkom osiąść w komorze przez 30 sekund.
  3. Włóż komorę zliczającą do cytometru obrazowego.

6. Ustawienia instrumentu do celometru

  1. Włóż moduły optyki fluorescencyjnej: VB-535-402 i VB-660-502 do systemu i upewnij się, że są zablokowane na swoim miejscu.
    1. VB-535-402 (wzbudzenie przy 475 nm, emisja przy 535 nm) służy do wykrywania oranżu akrydynowego i GFP.
    2. VB-660-502 (wzbudzenie przy 540 nm, emisja przy 660 nm) służy do detekcji jodku propidyny.
  2. Włącz cytometr obrazowy i otwórz dołączone oprogramowanie.

7. Konfiguracja oprogramowania wiolometru

  1. Wybierz ustawienie wstępne "Typ testu" i "Typ komórki" z menu rozwijanego testu.
    1. Aby zapewnić żywotność, test jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania oranżu akrydynowego i jodku propidyny.
    2. W celu wykrycia zakażenia Candida albicans test jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania GFP.
  2. Wybierz "Opcje" u góry i kliknij "Weź obraz tła" i poczekaj na zakończenie operacji.
  3. Kliknij "Podgląd obrazu w jasnym polu".

8. Procedura pozyskiwania obrazu

  1. Włóż przygotowaną komorę na próbkę do cytometru obrazowego.
  2. Użyj pokrętła ostrości i wyreguluj ostrość.
  3. Po ustawieniu ostrości kliknij "Policz" i poczekaj, aż operacja akwizycji obrazu zostanie zakończona.
  4. Wyjmij jednorazową komorę liczącą i zutylizuj w odpowiedni sposób.

9. Analiza danych obrazu

  1. Pomiar koncentracji i żywotności
    1. Po zakończeniu liczenia stężenie i żywotność komórek docelowych są wyświetlane na stronie wyników.
    2. Kliknij "Eksportuj", aby wyeksportować dane do FCS Express 4 w celu analizy populacji komórek GFP w eksperymencie infekcji Candida albicans.
  2. Analiza FCS Express komórek zakażonych Candida albicans
    1. Zaimportuj plik ". NXDAT" do FCS Express 4 i wykreślić wyniki na histogramie fluorescencji.
    2. Zastosuj bramkę populacji komórek do histogramu, aby określić procentową populację komórek zakażonych Candida albicans.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy cytometru obrazowego Cellometer Vision do monitorowania wzrostu H. capsulatum w komórkach makrofagów. Komórki RAW 264.7 zostały zakażone komórkami drożdży H. capsulatum, a w różnych punktach czasowych próbki poddano barwieniu AO/PI, a następnie analizie cytometrycznej opartej na obrazie. Równolegle próbki analizowano za pomocą tradycyjnego liczenia CFU. W każdym punkcie czasowym próbki inkubowano w wodzie w celu lizy makrofagów, a uwolnione komórki drożdży identyfikowano za pomocą oprogramowani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria obrazowa pozwala użytkownikowi na uchwycenie wysokiej jakości obrazów i za pomocą specjalistycznego oprogramowania szybkie określenie ilościowe komórek. Jednym z potencjalnych wyzwań związanych z zastosowaniem cytometrii obrazowej w dziedzinie patogenezy drobnoustrojów jest to, że drobnoustroje, które mają być policzone, są obecne w mieszanej populacji komórek, w tym w komórkach gospodarza ssaków. Tutaj pokazujemy, że cytometria obrazowa może być stosowana do ilościowego oznaczania żywotnych drożdży chorobotwó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy, Leo Li-Ying Chan i Benjamin Paradis są pracownikami Nexcelom Bioscience LLC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
REAGENTS
DMEMLife Technologies11965-084
Płodowa surowica bydlęcaTechnologies16000044
Roztwór AO/PINexcelom BioscienceCSK-0102
Jednorazowa komora liczącaNexcelom BioscienceCHT4-SD100
< strong>EQUIPMENT
Cellometer VisionNexcelom Bioscience
Cellometer Vision SoftwareNexcelom Bioscience
Life

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
  2. Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
  3. Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
  4. Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
  5. Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
  6. Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
  7. Chan, L. L. -Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
  8. Chan, L. L. -Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
  9. Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
  10. Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
  11. Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
  12. Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
  13. Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
  14. Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
  15. Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oznaczanie ilo ci dro d yjednostki tworz ce koloniecytometria przep ywowapomara cz akrydynowy i jodek propidynyekspresja GFPzaka enie makrofag wywotno grzyb w

Powiązane artykuły