Użycie modelu, który naśladuje stan chorób płuc u ludzi, jest kluczowe dla badania patofizjologii i/lub etiologii danej choroby oraz dla opracowania interwencji terapeutycznej. W artykule przedstawiono nieinwazyjną metodę intubacji dotchawiczej, która może bezpośrednio dostarczać materiały egzogenne do płuc myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nieinwazyjna intubacja dotchawicza w celu zbadania patologii i fizjologii płuc myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Użycie modelu, który naśladuje stan chorób płuc u ludzi, jest kluczowe dla badania patofizjologii i/lub etiologii danej choroby oraz dla opracowania interwencji terapeutycznej. Wraz z rosnącą dostępnością pochodnych nokautowych i transgenicznych, wraz z ogromną ilością informacji genetycznej, myszy stanowią jeden z najlepszych modeli do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw patologii i fizjologii chorób płuc. Wdychanie, wkraplanie donosowe, wkraplanie dotchawicze i intubacja dotchawicza są najczęściej stosowanymi technikami przez wielu badaczy do podawania interesujących materiałów do płuc myszy. Każda technika ma swoje plusy i minusy, w zależności od celów badania. W artykule przedstawiono nieinwazyjną metodę intubacji dotchawiczej, która może bezpośrednio dostarczać materiały egzogenne do płuc myszy. Technika ta została zastosowana do podawania bleomycyny do płuc myszy jako modelu do badania zwłóknienia płuc.
Wprowadzenie
Płuco jest organem, w którym często diagnozuje się wiele wyniszczających chorób. Wśród nich rak płuc jest drugim najczęściej diagnozowanym nowotworem zarówno u mężczyzn, jak i kobiet oraz najczęstszą przyczyną zgonów z powodu nowotworu. Przewlekła obturacyjna choroba płuc, znana również jako rozedma płuc i przewlekłe zapalenie oskrzeli, jest bardzo poważną chorobą i trzecią najczęstszą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych. Szacuje się, że w 2011 roku 25,9 miliona Amerykanów miało astmę, w tym 7,1 miliona dzieci poniżej 18 roku życia. Astma jest trzecią najczęstszą przyczyną hospitalizacji wśród dzieci poniżej 15 roku życia (American Lung Association, http://www.lung.org). W celu zbadania patofizjologii i/lub etiologii tych wyniszczających chorób i ich mechanizmów leżących u ich podstaw, kluczowe znaczenie ma zastosowanie dokładnych modeli w połączeniu z wygodnym i nieinwazyjnym podawaniem różnych materiałów będących przedmiotem zainteresowania płuc. Myszy stanowią jeden z najlepszych modeli do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw patologii i fizjologii chorób płuc ze względu na rosnącą dostępność myszy nokautowych i transgenicznych oraz ogromną ilość dostępnych informacji genetycznych.
Różne metody były używane przez wielu badaczy w różnych ustawieniach do dostarczania interesujących materiałów do płuc myszy, w tym wdychanie, wkraplanie donosowe, wkraplanie dotchawicze i intubacja dotchawicza1-4. Ta ostatnia procedura nie jest rutynowo stosowana, ponieważ uważa się ją za dość trudną do wykonania. Opisana w niniejszym dokumencie intubacja dotchawicza jest nieinwazyjną, prostą i szybką metodą dostarczania interesujących materiałów do płuc myszy w celu zbadania wpływu dostarczonych materiałów na wzorce ekspresji genów, patologię i/lub fizjologię płuc5. Technika ta zapewnia dostarczanie materiałów egzogennych do całego płuca i nie wiąże się z żadną operacją przetrwania, a zatem prawdopodobnie zostanie zatwierdzona przez wszelkie instytucjonalne komitety ds. opieki i wykorzystania zwierząt.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Poniższy protokół opisuje nieinwazyjną, prostą i szybką metodę dostarczania interesujących materiałów do płuc myszy. Procedura ta została zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt National Cancer Institute.
1. Znieczulenie
- Najpierw znieczul mysz za pomocą mieszaniny ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 100 mg/kg masy ciała i 10 mg/kg masy ciała). Jest to znieczulenie i dawka zalecana przez ACUC. Przy tej ilości myszy są nieprzytomne co najmniej przez ~20 minut.
- Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas znieczulenia.
- Po kilku minutach uszczypnij stopę myszy, aby sprawdzić, czy jest przytomny. Po stwierdzeniu, że jesteś nieprzytomna, umieść mysz na stojaku do intubacji pod kątem ~60° i przytrzymaj ją w miejscu, zaczepiając jej górne siekacze o małą gumową opaskę znajdującą się w górnej części stojaka.
2. Intubacja dotchawicza
- Delikatnie odsuń język myszy na bok za pomocą końcówki higienicznej.
- W przypadku korzystania z systemu oświetlenia intubacyjnego BioLITE należy ostrożnie włożyć system intubacyjny, aż krtań zostanie uwidoczniona za pomocą światłowodu.
- Po uwidocznieniu nagłośni i chrząstek arytenoidalnych włóż włókno na nagłośnię i między chrząstki nagłośni i przesuwaj się, aż zostanie wprowadzona odpowiednia długość cewnika.
Uwaga: Aby uzyskać odpowiednią długość cewnika, który ma być wprowadzony, najpierw zmierz długość między ustami a punktem rozwidlenia oskrzeli, używając wcześniej myszy ćwiczebnej o podobnej wielkości (Rysunek 1). Długość w dużej mierze zależy od wielkości myszy. Wprowadzenie cewnika powinno zatrzymać się powyżej punktu rozwidlenia (~1,5 cm dla myszy o masie ~25 g). Gwarantuje to, że zaintubowany materiał trafi do wszystkich płatów. Aby osoba wykonująca intubację osiągnęła biegłość w tej technice, może być potrzebnych co najmniej 50 myszy ćwiczących (biegła oznacza, że wskaźnik powodzenia intubacji wynosi ponad 95%).
- Po wprowadzeniu cewnika szybko wyjmij światłowód światłowodowy z cewnika, aby zwierzę mogło normalnie oddychać. Gdy system oświetlenia intubacyjnego nie jest używany, należy bezpośrednio wprowadzić cewnik zgodnie z opisem.
- Dodać roztwór zawierający interesujące materiały do cewnika. Upewnij się, że roztwór został zasysany do płuc natychmiast po dodaniu. Rutynowo stosuje się pięćdziesiąt mikrolitrów na ~25 g masy ciała myszy.
3. Odzyskiwanie zwierząt
- Gdy tylko roztwór zostanie zassany do płuca, zdejmij mysz ze stojaka i włóż ją z powrotem do oryginalnej klatki.
- Obserwuj mysz, aż zacznie się poruszać.
- Po potwierdzeniu, że mysz jest w dobrym stanie, umieść klatkę z powrotem na stojaku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wstępnie, w celu przećwiczenia intubacji myszy, zastosowano roztwór barwiony na zielono. Płuca wycięto bezpośrednio po intubacji, aby sprawdzić, jak równomiernie barwnik rozprzestrzenił się w narządzie (Rycina 2). Technikę tę zastosowano do badania włóknienia płuc indukowanego bleomycyną u myszy C57BL/6. Po intubacji intratrachealnej myszy dawką 1,2 U/kg bleomycyny lub soli fizjologicznej jako kontroli i przeprowadzeniu sekcji 3 tygodnie później, stwierdzono rozwój włóknienia indukowanego bleomycyną w ca...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj intubacja dotchawicza jest prostą, ale doskonałą nieinwazyjną metodą równomiernego dostarczania interesujących materiałów do płuc myszy. Metoda ta pozwala na zbadanie wpływu i/lub roli podawanego materiału na fizjologię i/lub patologię płuc. Podawane materiały mogą być cząsteczkami endogennymi, takimi jak cytokiny, lub materiałami egzogennymi, takimi jak ksenobiotyczne chemikalia/leki, czynniki rakotwórcze, zanieczyszczenia, alergeny lub wirusy, które powodują różne choroby płuc, które mogą stanowić model d...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Intramural Research Program of the National Cancer Institute, Center for Cancer Research.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| KetaVed | Vedco | Ketamina | |
| AnaSed Injection 20 mg | LLOYD | Xylazine | |
| BioLite Stand | Braintree Scientific | RIS100 | Dla myszy |
| System oświetlenia intubacyjnego BioLite | Braintree Scientific | BIO MI-KIT | Dla myszy |
| 22 G, 1-calowy cewnik dożylny | Terumo | SR-OX2225CA | Dla myszy poniżej 30 g. Cewnik jest używany tylko w przypadku, gdy system oświetlenia intubacyjnego nie jest używany. |
| Cewnik dożylny 20 G, 1 cal | Terumo | SR-OX2025CA | Dla myszy ponad 30 g. Cewnik jest używany tylko w przypadku, gdy system oświetlenia intubacyjnego nie jest używany. |
Bibliografia
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J. Vis. Exp. (73), e50318(2013).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7, e31359(2012).
- Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702(2011).
- Riesenfeld, E. P., et al. Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease. Respir. Res. 11, 22(2010).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- Bonniaud, P., et al. Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).
- Haegens, A., et al. Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production. J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).
- Jackson, P., et al. Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring. Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).
- Bodewes, R., et al. Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation. Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473, 101-104 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
