CometChip: wysokowydajna, 96-dołkowa platforma do pomiaru uszkodzeń DNA w mikromacierzowanych komórkach ludzkich

Summary

Opisujemy tutaj platformę, która pozwala na wykrywanie uszkodzeń DNA metodą testów komet z niespotykaną dotąd wydajnością. Urządzenie tworzy modele komórek ssaków w mikromacierz i umożliwia równoległe przetwarzanie 96 próbek. Podejście to ułatwia analizę uszkodzeń DNA na poziomie podstawowym, uszkodzeń DNA wywołanych ekspozycją oraz kinetyki naprawy DNA.

Abstract

Czynniki uszkadzające DNA mogą sprzyjać starzeniu się, chorobom i nowotworom, są wszechobecne w środowisku i produkowane w komórkach ludzkich jako normalne metabolity komórkowe. Jak na ironię, w dużych dawkach środki uszkadzające DNA są również stosowane w leczeniu raka. Zdolność do ilościowego określania reakcji na uszkodzenia DNA ma zatem kluczowe znaczenie w dziedzinie zdrowia publicznego, farmacji i kliniczności. W tym miejscu opisujemy nowatorską platformę, która wykorzystuje techniki mikrowytwarzania do modelowania komórek w ustalonej mikromacierzy. "CometChip" opiera się na dobrze znanym teście elektroforezy żelowej z pojedynczymi komórkami (znanym również jako test komet), który szacuje poziom uszkodzenia DNA poprzez ocenę zakresu migracji DNA przez matrycę w polu elektrycznym. Rodzaj uszkodzeń mierzonych za pomocą tego testu obejmuje miejsca podstawowe, ogniwa krzyżowe i pęknięcia nici. Zamiast być losowo rozpraszane w agarozie w tradycyjnym teście, komórki są wychwytywane grawitacyjnie do układu mikrostudzienek agarozowych. Platforma rozszerza się również z rozmiaru standardowego szkiełka mikroskopowego do formatu 96-dołkowego, umożliwiając przetwarzanie równoległe. W tym miejscu opisujemy protokoły użycia chipa do oceny uszkodzeń DNA spowodowanych przez znane czynniki genotoksyczne oraz odpowiedź naprawczą komórek następującą po ekspozycji. Dzięki integracji zasad biologicznych i inżynieryjnych, metoda ta wzmacnia solidne i czułe pomiary uszkodzeń DNA w komórkach ludzkich i zapewnia niezbędną przepustowość do badań genotoksyczności, opracowywania leków, badań epidemiologicznych i testów klinicznych.

Introduction

Test jednokomórkowej elektroforezy żelowej (SCGE) (znany również jako test komet) jest szeroko stosowaną techniką do ilościowego oznaczania szerokiego spektrum zmian DNA, w tym zmian zasadowych, miejsc zasadowych, pęknięć pojedynczej nici, pęknięć podwójnej nici, usieciowań krzyżowych i miejsc wrażliwych na zasady. Podstawową zasadą testu jest to, że uszkodzone DNA migruje łatwiej niż nieuszkodzone DNA z powodu fragmentacji i utraty struktury superhelikalnej. Zakres migracji jest proporcjonalny do ilości uszkodzeń DNA i można go uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przechwytywanie obrazu i analiza profilu intensywności poszczególnych DNA w kształcie komety dostarcza pomiarów parametrów, takich jak długość ogona, moment warkocza i % DNA w ogonie, aby ujawnić poziom uszkodzeń DNA w komórce^1-4.

Obecnie istnieją dwie powszechnie używane wersje testu komet: a) alkaliczny test kometa i b) neutralny test komet. Najczęściej stosowaną wersją jest alkaliczny test kometowy, który wykorzystuje bufor o wysokim pH do odwijania DNA przed elektroforezą, a tym samym wykrywa wszystkie rodzaje pęknięć nici i miejsca wrażliwe na zasady. Z drugiej strony, test neutralnej komety jest mniej praktykowany, ponieważ wykorzystuje neutralny bufor do utrzymania podwójnych helis i wykrywania tylko pęknięć podwójnej nici^2,5. W przypadku czynników chemicznych i fizycznych, które indukują DSB, SSB są tworzone wspólnie i powstają na znacznie wyższych poziomach (np. SSB indukowane przez γIR są o rząd wielkości bardziej powszechne niż DSB). W przypadku większości ekspozycji na uszkodzenia DNA, DSB występują znacznie rzadziej niż inne klasy uszkodzeń DNA, a zatem są trudniejsze do wykrycia. W poprzednich publikacjach pokazaliśmy okno wykrywania obu wersji. ^6,7

Chociaż test komet był rutynowo używany do podstawowych badań nad uszkodzeniami i naprawą DNA oraz testami genotoksyczności^1,2,8-15, stwierdzono, że test ma słabą powtarzalność ze względu na zmienność między próbkami, między ludźmi i między laboratoriami. Ponadto test ma niską przepustowość, częściowo dlatego, że pozyskiwanie obrazów i analiza danych są pracochłonne. Razem te ograniczenia przyczyniają się do jego stosunkowo niskiej akceptacji w badaniach na dużą skalę. Dzięki integracji technologii i zasad inżynierii, CometChip przynosi rozwiązanie problemów związanych z przepustowością i niespójnościami, które są związane z tradycyjnym testem kometarnym^6,7. Krótko mówiąc, aby stworzyć chip, forma jest mikrofabrykowana za pomocą fotolitografii, aby stworzyć mikrosłupki o średnicy tak małej, jak pojedyncza komórka. Forma jest następnie używana do stemplowania stopionej agarozy, w wyniku czego po zestaleniu się żelu powstaje szereg mikrostudzienek. Opracowywane są chipy, które mają zapewnić naukowcom studzienki o różnych rozmiarach, które będą kompatybilne z różnymi typami komórek. Aby załadować chip, komórki w mediach mogą osadzać się w studzienkach grawitacyjnie; Nadmiar komórek jest zmywany. Uwięzione komórki są następnie zamykane w kapsułkach za pomocą cienkiej warstwy agarozy o niskiej temperaturze topnienia, a następnie bezdenna 96-dołkowa płytka jest zaciskana na powierzchni żelu w celu utworzenia 96 makrodołków, z których każda ma setki mikrodołków na dolnej powierzchni.

Ten protokół opisuje ogólne procedury eksperymentów z tym chipem, które obejmują przygotowanie żelu, ładowanie komórek, dozowanie i naprawę, lizę komórek, elektroforezę i obrazowanie fluorescencyjne. Pokazujemy dwa przykłady eksperymentów z odpowiedzią na dawkę z komórkami limfoblastowymi narażonymi na znane czynniki uszkadzające DNA, używając odpowiednio alkalicznej i neutralnej wersji testu. Pokazano również dwa eksperymenty naprawcze, które opisują, w jaki sposób można ocenić reakcję naprawczą po ekspozycji za pomocą systemu.

Protocol

1. Przygotowanie żetonu

1. Wyjmij żel wiórowy z opakowania i umieść w prostokątnej płytce z jedną komorą, folią żelową do dołu.
2. Żel do mycia w 25 ml 1x PBS przez 15 min, powtórzyć dwa razy.
3. Ustaw żel na szklanej płytce i odpowiednio oznacz orientację żelu.
4. Delikatnie dociśnij odwróconą 96-dołkową płytkę bez dna do żelu; upewnij się, że wszystkie dołki płytki bez dna znajdują się w obszarze żelu.
5. Użyj 1.5-calowych spinaczy do segregatorów po każdej stronie płyty, aby zabezpieczyć clamping ze szkłem.
6. Odessać nadmiar buforu PBS do każdej studzienki.

2. Wczytywanie komórek

1. Przygotować zawiesiny komórek:
   1. W przypadku zawiesinowych linii komórkowych rozcieńczyć zawiesinę komórek w pożywce, aby uzyskać końcowe stężenie 10⁵–10⁶ komórek/ml.
   2. W przypadku przylegających linii komórkowych postępuj zgodnie z normalnymi protokołami odłączania/trypsynizacji i rozcieńczaj oderwane komórki w pożywce do końcowego stężenia 10⁵–10⁶ komórek / ml. Jeśli komórki agregują się, przepuść zawiesinę komórek w filtrze komórkowym, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
2. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej.
3. Przykryj płytkę folią żelową, aby zapobiec parowaniu mediów.
4. Pozostawić komórki do załadowania przez co najmniej 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
5. Wyjmij wiór z inkubatora i odessaj pożywkę z każdej studzienki.
6. Usuń spinki do segregatora i 96-dołkową płytkę bez dna; przytrzymaj chip szklaną płytką pod kątem i delikatnie spłucz 1x PBS, aby usunąć nadmiar komórek na agarozie.
7. Sprawdź obciążenie komórek za pomocą mikroskopu jasnego pola z soczewką obiektywową 4X. Jeśli zaobserwuje się niewystarczające obciążenie, powtórz od kroku 2.1.
8. Umieść załadowany wiór na równej powierzchni (stół laboratoryjny). Chip wierzchni z 1% agarozą o niskiej temperaturze topnienia (LMP), który jest wstępnie podgrzewany w temperaturze 37 °C. Na każdy chip potrzeba około 2–3 ml agarozy LMP.
9. Pozostawić nakładkę do zestalenia się w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie przenieść do lodówki o temperaturze 4 °C na 5 minut w celu całkowitego zżelowania.

3. Dozowanie i naprawa

UWAGA: Aby zbadać podstawowy poziom uszkodzenia DNA, przejdź do kroku 4.

1. Ostrożnie wyrównaj dołki chipa (utworzone z poprzedniego mocowania) z dołkami nowej 96-dołkowej płytki bez dna. Ponownie dociśnij 96-dołkową płytkę bez dna na górze i zabezpiecz zacisk za pomocą klipsów do segregatora.
2. Dodać 100 μl substancji chemicznej o pożądanej dawce do każdego dołka płytki 96-dołkowej; dozować/leczyć na lodzie lub w lodówce o temperaturze 4 °C przez żądany okres czasu.
3. Po dozowaniu odessać chemikalia z każdej studzienki i wypłukać pozostałości chemikaliów za pomocą 1x PBS. Jeśli w tym miejscu badane są uszkodzenia bezpośrednie, przejdź do kroku 4.
4. Aby zbadać kinetykę naprawy, pozwól komórkom w chipie naprawić się w pożywce w temperaturze 37 °C. Liza (przejdź do kroku 4) w określonych punktach czasowych.
   UWAGA: Naprawę można wykonać na chipie z dołączoną 96-dołkową płytką bez dna lub chip można pociąć na oddzielne kawałki po wyjęciu 96-dołkowej płytki bez dna.

4. Liza

1. Aby wykonać alkaliczny test komet:
   1. Stwórz działający alkaliczny bufor do lizy, dodając 1% Triton X-100 do alkalicznego roztworu podstawowego do lizy (2,5 M NaCl, 100 mM Na₂EDTA, 10 mM Tris, pH 10). Przygotować około 25 ml roboczego buforu do lizy dla każdego wióra.
   2. Wstępnie schładzany alkaliczny bufor do lizy w temperaturze 4 °C.
   3. Zanurz chip w chłodnym, działającym alkalicznym buforze do lizy i pozwól, aby liza wykonała O/N w lodówce o temperaturze 4 °C.
2. Aby wykonać test neutralnej komety:
   1. Stwórz działający neutralny bufor do lizy, dodając 1% Triton X-100 i 10% DMSO do neutralnego roztworu podstawowego do lizy (2,5 M NaCl, 100 mM Na₂EDTA, 10 mM Tris, 1% N-lauroilsarkozyny, pH 9,5). Przygotować około 25 ml roboczego buforu do lizy dla każdego wióra.
   2. Wstępnie podgrzany pracujący neutralny bufor do lizy w temperaturze 43 °C.
   3. Zanurz chip w ciepłym, pracującym neutralnym buforze do lizy i pozwól, aby liza przeprowadziła O/N w inkubatorze o temperaturze 43 °C.

5. Elektroforeza

1. Aby wykonać alkaliczny test komet:
   1. Usuń bufor do lizy i szybko spłucz wiór za pomocą 1x PBS.
   2. Zabezpiecz wiór w komorze elektroforetycznej folią żelową stroną skierowaną w dół za pomocą taśmy dwustronnej.
   3. Doprowadzić komorę do chłodni o temperaturze 4 °C.
   4. Napełnij komorę zimnym alkalicznym buforem do elektroforezy (0,3 M NaOH, 1 mM Na₂EDTA) do poziomu, który pokryje tylko żel.
   5. Pozostaw do alkalicznego odwinięcia na 40 minut.
   6. Uruchomić elektroforezę przy napięciu 1 V/cm i natężeniu 300 mA przez 30 minut w chłodni. Dostosuj objętość bufora do elektroforezy w komorze, aby uzyskać żądany prąd roboczy.
2. Aby wykonać test neutralnej komety:
   1. Usunąć bufor do lizy i przepłukać chip neutralnym buforem do elektroforezy (2 mM Na₂EDTA, 90 mM Tris, 90 mM kwas borowy, pH 8,5) przez 2 x 15 minut w temperaturze 4 °C.
   2. Zabezpiecz wiór w komorze elektroforetycznej folią żelową stroną skierowaną w dół za pomocą taśmy dwustronnej.
   3. Doprowadzić komorę do chłodni o temperaturze 4 °C.
   4. Napełnij komorę zimnym obojętnym buforem do elektroforezy (2 mM Na₂EDTA, 90 mM Tris, 90 mM kwas borowy, pH 8,5) do poziomu, który pokryje tylko żel.
   5. Pozostaw żel w chłodnym pomieszczeniu na 60 minut.
   6. Uruchomić elektroforezę przy 0,6 V/cm i 6 mA przez 60 minut w chłodni. Dostosuj objętość bufora do elektroforezy w komorze, aby uzyskać żądany prąd roboczy.

6. Obrazowanie fluorescencyjne

1. Usuń wiór z komory elektroforezy z chłodni.
2. Neutralizować żele w buforze neutralizacyjnym (0,4 M Tris, pH 7,5) przez 2 x 15 minut w lodówce o temperaturze 4 °C.
3. Wybarwić chip wybranym fluorescencyjnym barwnikiem DNA (tj. SYBR Gold, bromek etydyny) zgodnie z procedurami zalecanymi przez producenta. Obraz za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

7. Analiza danych

Analizuj obrazy komet za pomocą standardowego oprogramowania do badania komet, takiego jak Komet 5.5.

Results

W tym pierwszym przykładzie opisujemy podejście do ilościowego określania początkowych poziomów uszkodzeń DNA w ludzkich komórkach limfoblastoidalnych po ekspozycji na uszkodzenia oksydacyjne za pomocą_H2O₂. W celu oceny zmian zasadowych wywołanych przez_H2O2i pęknięć pojedynczej nici stosuje się alkaliczne warunki kometowe. Po zakończeniu ładowania i zamknięciu komórek w nakładce agarozowej, do powierzchni dociskuje się 96-dołkową płytkę bez dna, aby utworzyć 96 przegródek na chipie. Do każdej z 96 studzienek można dozować inny rodzaj lub stężenie chemikaliów. Tutaj zastosowano cztery różne dawki_H2O2i 1x PBS jako kontrolę ujemną. Reprezentatywne obrazy komet w układzie są pokazane na rysunku 1A, gdzie próbki naświetlone przez H₂O₂ 2 i 100 μM (na dole) bez obróbki (na górze), 50 μM (w środku) i 100 μM (na dole) wykazały różne poziomy warkoczy komet. Analiza obrazów komet może być przeprowadzona za pomocą komercyjnie dostępnego oprogramowania, które zazwyczaj określa ilościowo poziomy uszkodzeń na podstawie całkowitej intensywności fluorescencji i odległości migracji każdego warkocza komety. Pomiary są zwykle wykonywane na 50 do 100 kometach na kondycję i obliczana jest mediana wartości (% DNA warkocza lub długość warkocza). Rysunek 1B ilustruje procentową krzywą odpowiedzi DNA ogona analizowaną z komet komórek limfoblastoidalnych TK6 wystawionych na działanie czterech różnych stężeń_H2O2. Spójność między niezależnymi eksperymentami pokazuje skuteczność tego podejścia w ocenie odpowiedzi na uszkodzenia DNA na różnych poziomach leczenia chemicznego w komórkach.

Aby dowiedzieć się więcej o zmienności między próbkami (np. wśród makrostudzie) i między powtórzeniami tego samego eksperymentu, na rysunku 2A i 2B wykreślono zmienność między próbkami i między eksperymentami. W każdym eksperymencie każda studzienka 96-dołkowego chipa jest równoważna innej próbce, a zatem wariant od studni do studni ujawnia zmienność urządzenia między próbkami. W tym przypadku komórki TK6 załadowane do 12 dołków 96-dołkowego chipa poddano działaniu tej samej dawki_H2O2i poddano lizie natychmiast po zabiegu. Wszystkie inne etapy eksperymentalne przeprowadzono równolegle, a mediany co najmniej 50 komet z każdej makrostuby zostały wykreślone na rysunku 2A. Średnia mediany wynosi 77,53% DNA w ogonie, a odchylenie standardowe wynosi 3,99%. Na podstawie tych danych obliczamy, że współczynnik zmienności między próbkami wynosi 5,2%, czyli jest kilkakrotnie niższy niż w przypadku tradycyjnego testu, co świadczy o zwiększonej odporności tego testu^6,16. Aby dowiedzieć się o odtwarzalności testu, wystawiliśmy komórki TK6 w chipie z 75 μM H₂O₂ i przeanalizowaliśmy natychmiastowy poziom uszkodzenia DNA. Eksperyment ten powtórzono sześć razy, a dane z każdego eksperymentu przedstawiono na rysunku 2B. W identycznych warunkach eksperymentalnych uzyskaliśmy wyniki w zakresie od 41,76% do 57,87%, pokazane na rysunku jako szare paski. Średnia z sześciu powtórzeń wynosi 49,57%, a błąd standardowy średniej wynosi tylko 2,04%. Niewielka zmienność między powtórzeniami sugeruje, że test komet przeprowadzony za pomocą tego nowatorskiego urządzenia jest wysoce powtarzalny.

Aby ocenić kinetykę naprawy, komórkom pozwala się na naprawę swojego DNA w świeżych pożywkach po leczeniu. Liza makrostudzienek w różnych punktach czasowych ujawnia zmianę uszkodzeń DNA w czasie. Przykład pokazano na rysunku 3. W tym eksperymencie komórki TK6 zostały najpierw zamknięte w chipie, potraktowane 50 μM H₂O₂ i pozostawione do naprawy do 60 minut po ekspozycji. Komórki poddano lizie odpowiednio po 0, 20, 45 i 60 minutach. Reprezentatywne obrazy komet w różnych punktach czasowych są pokazane na rysunku 3A, a zmiany w poziomie uszkodzeń DNA w czasie są wykreślone na rysunku 3B. Dane te ujawniły, że prawie wszystkie uszkodzenia są naprawiane w ciągu 45 minut po leczeniu H_{2O2 .} Na szybkość naprawy może wpływać wiele zmiennych, w tym rodzaj linii komórkowej i użyty środek chemiczny. W związku z tym badacze mogą wprowadzać zmiany w protokole (tj. wydłużać czas naprawy), aby uwzględnić dodatkowe potrzeby w swoich badaniach. Tutaj podajemy kolejny przykład eksperymentu naprawczego z użyciem tego chipa, w którym komórki TK6 są poddawane innemu czynnikowi genotoksycznemu N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG) jest środkiem alkilującym, o którym wiadomo, że indukuje zmiany zasadowe, w tym 7-metyloguaninę i 3-metyladeninę. Zmiany te są przekształcane w miejsca zasadowe albo przez spontaniczne wydychanie, albo przez enzymatyczne usuwanie przez glikozylazy DNA. Powstałe w ten sposób miejsce zasadowe może zostać rozszczepione w warunkach alkalicznych, a tym samym wykryte na chipie. Początkowa ekspozycja powoduje znaczny wzrost uszkodzeń, widocznych w długich ogonach, a z czasem ogony te ulegają zmniejszeniu, ponieważ komórki przywracają nienaruszone DNA podczas naprawy. Chociaż zarówno alkilacja, jak i uszkodzenia oksydacyjne są naprawiane głównie przez szlak naprawy przez wycinanie zasady, ilość generowanych zmian i białek zaangażowanych w naprawę są różne. Różnice te mogą prowadzić do różnych wskaźników konwersji na strony podstawowe, a także do różnych wskaźników naprawy powstałych witryn podstawowych. Na rysunku 4 przedstawiono kinetykę naprawy komórek TK6 wystawionych na działanie 0,1, 1 i 3 μg/ml MNNG. W tym eksperymencie wydłużyliśmy czas eksperymentu do 2 godzin po ekspozycji, ponieważ uszkodzenia wywołane przez MNNG wydają się utrzymywać dłużej i są usuwane w wolniejszym tempie w porównaniu z uszkodzeniami wywołanymi przez_H2O2.

Analiza DSB w warunkach neutralnych jest bardzo podobna do protokołu analizy zmian jednoniciowych w warunkach alkalicznych. Aby pokazać początkowe poziomy uszkodzeń, ogniwa TK6 wystawiono na działanie zmiennych poziomów, a powstałe ogniwa poddano lizie i elektroforezie w neutralnym pH (ryc. 5A). Warto zauważyć, że morfologia warkoczy komet różni się od warunków testu alkalicznego. Aby uzyskać obserwowalne fragmentaryczne DNA za pomocą tego testu, zastosowana dawka IR jest znacznie wyższa (0-100 Gy) niż dawka wymagana do zobaczenia uszkodzeń w warunkach zasadowych. Ponadto odkryliśmy, że długość warkocza jest najbardziej czułym parametrem odzwierciedlającym zakres uszkodzeń DNA przy użyciu neutralnego testu komety⁷. Analizowaną krzywą dawka-odpowiedź przedstawiono na rysunku 5B. Naprawa pęknięć podwójnej nici DNA w komórkach może być również oceniona, co zostało wykazane przez Weingeist i wsp. ⁷. Podsumowując, neutralny CometChip stanowi cenne narzędzie do wysokoprzepustowej analizy DSB DNA.

Rysunek 1. Odpowiedź na dawkę_H2O2komórek TK6 przy użyciu alkalicznego testu kometowego. (A) Ułożone w układ komety mikrostudzienkowe z nieleczonych limfoblastów TK6 (u góry) i komórek TK6 wystawionych na działanie 50 μM (w środku) i 100 μM (na dole) H₂O₂ przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Podziałka wynosi 100 μm. (B) Odpowiedź na dawkę H₂O₂ komórek TK6 wystawionych na różne poziomy_H2O2. Każdy punkt danych jest średnią z trzech niezależnych eksperymentów, w których w każdym eksperymencie uzyskano medianę procentowego DNA ogona co najmniej 50 pojedynczych komet. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej z trzech niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Zmienność między próbkami i między eksperymentami. (A) Zmienność między próbkami. Ludzkie komórki limfoblastowe TK6 załadowano do 12 dołków 96-dołkowego chipa. Każdą studzienkę wystawiono na działanie 100 μl 50 μM H₂O₂ przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Komórki natychmiast poddano lizie i oznaczono na obecność % DNA ogona. Dane każdego odwiertu są pokazane tutaj. Każde pole reprezentuje medianę co najmniej 50 pojedynczych komet z każdego dołka. Średnia z 12 dołków wynosi 77,53%, odchylenie standardowe wynosi 3,99%, a współczynnik zmienności oblicza się na 5,2%. (B) Zmienność między eksperymentami. Ludzkie komórki limfoblastowe TK6 załadowano do 96-dołkowego chipa, wystawiono na działanie 100 μl 75 μM H₂O₂ przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Komórki natychmiast poddano lizie i oznaczono na obecność % DNA ogona. Ten sam eksperyment powtórzono 6 razy, a dane z każdego powtórzenia są pokazane jako szary pasek. Każda ramka reprezentuje medianę % DNA warkocza co najmniej 100 pojedynczych komet z każdego powtórzenia. Średnia z 6 powtórzeń wynosi 49,57%, pokazana tutaj jako tylny pasek. Odchylenie standardowe 6 powtórzeń wynosi 4,99%, a błąd standardowy średniej oblicza się jako 2,04%, co jest reprezentowane jako słupek błędu na rysunku.

Rysunek 3. Naprawa uszkodzeń wywołanych przez_H2O2w limfoblastach TK6. (A) Schemat badania naprawy z reprezentatywnymi kometami. Komórki TK6 są traktowane czynnikami uszkadzającymi i pozostawiane do naprawy w pożywce w temperaturze 37 °C przed lizą. (B) Kinetyka naprawy komórek TK6 po traktowaniu 50 μM H₂O₂ przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Każdy punkt danych jest średnią z trzech niezależnych eksperymentów, w których w każdym eksperymencie uzyskano medianę procentowego DNA ogona co najmniej 50 pojedynczych komet. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej z powtarzających się eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Naprawa uszkodzeń wywołanych przez MNNG w limfoblastach TK6. Komórki TK6 traktuje się 0,1, 1 i 3 μg/ml MNNG przez 30 minut w temperaturze 4 °C i pozostawia do naprawy w pożywce w temperaturze 37 °C do 120 minut po ekspozycji. Medianę procentowego DNA warkocza co najmniej 50 pojedynczych komet uzyskano dla każdego z trzech niezależnych eksperymentów. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej z trzech niezależnych eksperymentów.

Rysunek 5. Odpowiedź na dawkę IR komórek TK6 przy użyciu neutralnego testu komety. (A) Ułożone w układ komety mikrostudzienki z nieleczonych limfoblastów TK6 (na górze) i komórek TK6 wystawionych na promieniowanie gamma 40 Gy (w środku) i 80 Gy (na dole). Podziałka wynosi 100 μm. (B) Odpowiedź na dawkę IR komórek TK6 wystawionych na różne poziomy promieniowania gamma. Każdy punkt danych reprezentuje medianę długości warkocza (μm) co najmniej 300 komet zebranych z sześciu makrodołków na chipie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Wszechobecne genotoksyny w środowisku, a także w komórkach ludzkich, wywołują nieunikniony stres i uszkodzenia DNA komórkowego. W rzeczywistości szacuje się, że w ludzkich komórkach w stanie stacjonarnym¹⁸ występuje 1000 uszkodzeń DNA. Zrozumienie podatności na uszkodzenia i kinetyki naprawy u ludzi nie tylko zapewnia wgląd w badania podstawowe, ale także przynosi korzyści w opracowywaniu leków. Jak na ironię, pomimo zdolności uszkodzeń DNA do promowania raka, środki uszkadzające DNA są stosowane w bardzo wysokich stężeniach w leczeniu raka, co sprawia, że wiedza na temat uszkodzeń i naprawy DNA jest istotna dla medycyny spersonalizowanej. CometChip to nowatorskie urządzenie badawcze, które wykorzystuje praktyki mikrofabrykacji, aby zrewolucjonizować istniejący od dawna test uszkodzeń DNA. Opierając się na tych samych zasadach, co tradycyjny test komet, chip zapewnia znacznie wyższą przepustowość i lepszą odtwarzalność. Opisujemy tutaj metody korzystania z tego chipa. Aby wyjaśnić jego użyteczność i solidność, przedstawiamy wyniki kilku eksperymentów, w których chip został wykorzystany do oceny uszkodzeń wywołanych przez kilka różnych czynników uszkadzających DNA oraz gdzie został wykorzystany do oceny naprawy DNA. Przedstawione tutaj wyniki dostarczają przydatnych informacji na temat korzystania z chipa i pokazują jego szerokie zastosowanie w badaniach nad uszkodzeniem i naprawą DNA.

Jednym z najważniejszych kroków w tym protokole jest osiągnięcie efektywnego ładowania komórek. W tym systemie przetestowano wiele linii komórkowych, w tym zarówno komórki zawiesinowe, jak i przylegające. Wydajność ładowania zależy od wielu zmiennych, takich jak typ ogniwa, rozmiar ogniwa, stężenie obciążenia i czas. Zawiesinowe linie komórkowe, takie jak komórki limfoblastoidalne, są najłatwiejsze w obróbce. Stężenie zawiesiny komórek może wahać się od 10,⁴ do 10,⁶ komórek na 96 dołków, a ładowanie zwykle kończy się w ciągu 15–30 minut. Większa gęstość komórek ułatwia ładowanie i skraca czas potrzebny komórkom na osiedlenie się w mikrostudzienkach.

Parametry obciążenia dla ogniw przylegających mogą różnić się od ogniw zawiesinowych. Stwierdzono, że linie komórkowe, takie jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), mają podobną wydajność ładowania jak komórki zawiesinowe (po trypsynizacji), a zatem wykorzystują podobne warunki obciążenia. Inne typy komórek, takie jak komórki nowotworowe, które łatwo tworzą agregaty komórkowe w zawiesinie, wymagają dodatkowej obsługi. Przepuszczanie zawiesin komórkowych przez filtr jednokomórkowy i dodawanie trypsyny do podłoża zawiesinowego może hamować tworzenie się klastrów komórkowych podczas ładowania. Wreszcie, jeśli chodzi o czas ładowania, czas potrzebny do wychwycenia przylegających linii komórkowych w mikrostudzienkach może wynosić od 20 minut do 1 godziny. W związku z tym zaleca się, aby użytkownicy przeprowadzili eksperymenty pilotażowe w celu określenia optymalnych warunków obciążenia przed przystąpieniem do dalszych badań. Skuteczność ładowania można zobrazować pod mikroskopem jasnego pola lub dokładniej ujawnić poprzez barwienie zamkniętych komórek za pomocą DAPI lub innych barwników DNA przed oceną pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Jedną z głównych zalet tej metody i chipa jest wszechstronność. Po pierwsze, naukowcy nie są ograniczeni do określonego stężenia komórek roboczych, ponieważ nadmiar komórek jest wypłukiwany, a mikromacierz zapewnia jednolitą gęstość komety. Po drugie, mikrostudzienki mogą być wykonane o różnych rozmiarach, aby pomieścić typy komórek o różnych rozmiarach. W warunkach, w których wiele komórek jest wychwytywanych w pojedynczej mikrostudzince, komety wielokomórkowe są samokalibrowane i dają spójne wyniki w porównaniu z kometami jednokomórkowymi^6,7. Kolejną zaletą tworzenia wzorów komórek w mikromacierzy jest to, że wszystkie komety znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej ze stałymi pozycjami, co redukuje szum spowodowany nieostrymi kometami i ułatwia automatyczne obrazowanie i analizę. Znaczna poprawa przepustowości i czułości zapewniana przez CometChip umożliwia zastosowanie testu w badaniach na dużą skalę. Podsumowując, chip stanowi cenne narzędzie do oceny uszkodzeń DNA dla badaczy, toksykologów, klinicystów i epidemiologów.

Podczas gdy test kometarny jest znany ze swojej doskonałej czułości w wykrywaniu szerokiego zakresu uszkodzeń DNA, test ten cierpi również na niską specyficzność. Użycie tego protokołu znacznie poprawia odtwarzalność i przepustowość testu, ale nie wykazuje postępu w swoistości. Niemniej jednak stwierdzono, że multipleksowanie testu z innymi metodologiami jest skuteczne w osiąganiu wyższej swoistości. Jednym z przykładów jest włączenie oczyszczonych enzymów specyficznych dla zmian chorobowych. Enzymy te mogą przekształcać niewykrywalne w inny sposób zmiany podstawowe w wykrywalne pęknięcia nici i miejsca zasadowe^1,19-21. Szeroko stosowanym przykładem jest endonukleaza naprawcza formamidopirymidyno-glikozylaza DNA (Fpg), która ujawnia oksydacyjne modyfikacje DNA^19,22. Ponieważ etap trawienia enzymatycznego jest stosowany po lizie komórek, system może być traktowany w taki sam sposób, jak tradycyjny szkiełko agarozowe bez zmian w protokole. Chociaż szczegółowy protokół nie jest tutaj opisany, podejście to zostało zaadaptowane przez wielu tradycyjnych użytkowników testów komet w przeszłości, a protokoły można łatwo znaleźć. W poprzedniej publikacji zastosowaliśmy tę metodę do identyfikacji uszkodzeń wywołanych światłem fluorescencyjnym ²² .

Główną zaletą tej metody jest zapewniana przez nią przepustowość, która otwiera drzwi do badań, które wcześniej były praktycznie niemożliwe. Możliwość przetwarzania 96 próbek na tej samej platformie nie tylko zmniejsza nakład pracy i czas, ale także redukuje odgłosy eksperymentalne i znacznie zwiększa odtwarzalność. Zmienność między próbkami jest znacznie niższa niż w przypadku tradycyjnej zmiany typu slide-to-slide, która może być 2-krotnie wyższa niż zmienność obserwowana przy użyciu tego chipa^6,7. Zmniejszenie szumów prowadzi również do poprawy czułości, umożliwiając wykrywanie bardziej subtelnych różnic między próbkami. Ponieważ urządzenie wykorzystuje standardowy format 96-dołkowy, jest kompatybilne z ogólną aparaturą badawczą i technologiami HTS. Weźmy pod uwagę badanie, które wymaga oceny 100 próbek, przy założeniu, że przeciętny badacz może przetworzyć ~30 szklanych szkiełek w ciągu kilku dni. Biorąc pod uwagę, że każda próbka musi być wykonana w trzech egzemplarzach, ukończenie takiego badania zajęłoby około jednego miesiąca, co również nieuchronnie ucierpiałoby z powodu zmienności między próbkami. Natomiast przetwarzanie 100 warunków, każdy w trzech egzemplarzach, za pomocą tego chipa wymaga tylko kilku płytek i może być wykonane w ciągu trzech dni. Ta znaczna poprawa przepustowości otwiera drzwi do badań, które wcześniej były nieosiągalne.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje zarówno podstawowe procedury wykonywania standardowego testu komety, jak i zmodyfikowane kroki wymagane do korzystania z platformy CometChip. Dzięki możliwości pomiaru zarówno wrodzonych poziomów uszkodzeń DNA, jak i późniejszej odpowiedzi naprawczej, test jest bardzo przydatny w różnych zastosowaniach biologicznych i klinicznych. Informacje na temat wpływu określonych substancji chemicznych na genom ułatwiają zapobieganie chorobom i ich leczenie. Co więcej, istnieje również duże zainteresowanie określeniem różnic we wrażliwości na uszkodzenia DNA i zdolności naprawczych wśród osób^23,24. Technika ta zapewnia przepustowość wymaganą dla takich badań na dużą skalę. Wiedza na temat różnic międzyosobniczych ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji osób podatnych oraz dla projektowania zindywidualizowanych terapii lub strategii zapobiegawczych. Podsumowując, zaprezentowana tutaj technologia zapewnia wysoce wydajną, obiektywną i ilościową platformę analizy uszkodzeń DNA, która ma potencjał, aby w niedalekiej przyszłości stać się standardową metodologią.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure LMP Agaroza (niska temperatura topnienia)	Invitrogen	16520	Wielu dostawców
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS) 1x	Gibco firmy life technologies	14190	Wielu dostawców
Krystaliczny NaCl	Macron Chemicals	7581-06	Wielu dostawców
Krystaliczny Na2EDTA	Macron Chemicals	4931-04	Wielu dostawców, Drażniący
krystaliczny Tris (baza)	Sigma-Aldrich	T1503	Wielu dostawców, Drażniący
krystaliczny Tris (kwas)	J.T.Baker	4106	Wielu dostawców
Krystaliczna N-lauroilsarcosine	Sigma-Aldrich	L9150	Wielu dostawców, Wysoce toksyczny przez drogi oddechowe, Drażniący
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Wielu dostawców, Szkodliwy po spożyciu., Drażniący
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D4540	Wielu dostawców, Ciecz palna, Wpływ narządów docelowych
Krystaliczny NaOH	Macron Chemicals	7708-06	Wielu dostawców,
Kwas solny	VWR	BDH3871	Wielu dostawców,
Krystaliczny kwas borowy	Sigma-Aldrich	B6768	Wielu dostawców, Efekt narządu docelowego, Teratogen, Zagrożenie reprodukcyjne
CometChip	Trevigen		W trakcie opracowywania do dystrybucji, skontaktuj się bezpośrednio z Trevigen w celu uzyskania niezbędnych materiałów
Naczynie 1-dołkowe	Thomas Scientific	73521-420
Płytka 96-dołkowa bez dna	VWR	655000-06
1,5-calowe spinacze do segregatorów	Zszywki		Wielu dostawców
Szklana płyta	Tag Sprzęt		Dostosowany do rozmiaru 96-dołkowej
płytki Sowa Poziomy system elektroforezy	VWR	27372-131	Wielu dostawców
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	164-5050	Wielu dostawców