Artykuł metodologiczny

CometChip: wysokowydajna, 96-dołkowa platforma do pomiaru uszkodzeń DNA w mikromacierzowanych komórkach ludzkich

20.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50607

⸱

18 października 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Environmental Toxicology, Chulabhorn Graduate Institute, 3Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tutaj platformę, która pozwala na wykrywanie uszkodzeń DNA metodą testów komet z niespotykaną dotąd wydajnością. Urządzenie tworzy modele komórek ssaków w mikromacierz i umożliwia równoległe przetwarzanie 96 próbek. Podejście to ułatwia analizę uszkodzeń DNA na poziomie podstawowym, uszkodzeń DNA wywołanych ekspozycją oraz kinetyki naprawy DNA.

Streszczenie

Czynniki uszkadzające DNA mogą sprzyjać starzeniu się, chorobom i nowotworom, są wszechobecne w środowisku i produkowane w komórkach ludzkich jako normalne metabolity komórkowe. Jak na ironię, w dużych dawkach środki uszkadzające DNA są również stosowane w leczeniu raka. Zdolność do ilościowego określania reakcji na uszkodzenia DNA ma zatem kluczowe znaczenie w dziedzinie zdrowia publicznego, farmacji i kliniczności. W tym miejscu opisujemy nowatorską platformę, która wykorzystuje techniki mikrowytwarzania do modelowania komórek w ustalonej mikromacierzy. "CometChip" opiera się na dobrze znanym teście elektroforezy żelowej z pojedynczymi komórkami (znanym również jako test komet), który szacuje poziom uszkodzenia DNA poprzez ocenę zakresu migracji DNA przez matrycę w polu elektrycznym. Rodzaj uszkodzeń mierzonych za pomocą tego testu obejmuje miejsca podstawowe, ogniwa krzyżowe i pęknięcia nici. Zamiast być losowo rozpraszane w agarozie w tradycyjnym teście, komórki są wychwytywane grawitacyjnie do układu mikrostudzienek agarozowych. Platforma rozszerza się również z rozmiaru standardowego szkiełka mikroskopowego do formatu 96-dołkowego, umożliwiając przetwarzanie równoległe. W tym miejscu opisujemy protokoły użycia chipa do oceny uszkodzeń DNA spowodowanych przez znane czynniki genotoksyczne oraz odpowiedź naprawczą komórek następującą po ekspozycji. Dzięki integracji zasad biologicznych i inżynieryjnych, metoda ta wzmacnia solidne i czułe pomiary uszkodzeń DNA w komórkach ludzkich i zapewnia niezbędną przepustowość do badań genotoksyczności, opracowywania leków, badań epidemiologicznych i testów klinicznych.

Wprowadzenie

Test jednokomórkowej elektroforezy żelowej (SCGE) (znany również jako test komet) jest szeroko stosowaną techniką do ilościowego oznaczania szerokiego spektrum zmian DNA, w tym zmian zasadowych, miejsc zasadowych, pęknięć pojedynczej nici, pęknięć podwójnej nici, usieciowań krzyżowych i miejsc wrażliwych na zasady. Podstawową zasadą testu jest to, że uszkodzone DNA migruje łatwiej niż nieuszkodzone DNA z powodu fragmentacji i utraty struktury superhelikalnej. Zakres migracji jest proporcjonalny do ilości uszkodzeń DNA i można go uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przechwytywanie obrazu i analiza profilu intensywności poszczególnych DNA w kształcie komety dostarcza pomiarów parametrów, takich jak długość ogona, moment warkocza i % DNA w ogonie, aby ujawnić poziom uszkodzeń DNA w komórce1-4.

Obecnie istnieją dwie powszechnie używane wersje testu komet: a) alkaliczny test kometa i b) neutralny test komet. Najczęściej stosowaną wersją jest alkaliczny test kometowy, który wykorzystuje bufor o wysokim pH do odwijania DNA przed elektroforezą, a tym samym wykrywa wszystkie rodzaje pęknięć nici i miejsca wrażliwe na zasady. Z drugiej strony, test neutralnej komety jest mniej praktykowany, ponieważ wykorzystuje neutralny bufor do utrzymania podwójnych helis i wykrywania tylko pęknięć podwójnej nici2,5. W przypadku czynników chemicznych i fizycznych, które indukują DSB, SSB są tworzone wspólnie i powstają na znacznie wyższych poziomach (np. SSB indukowane przez γIR są o rząd wielkości bardziej powszechne niż DSB). W przypadku większości ekspozycji na uszkodzenia DNA, DSB występują znacznie rzadziej niż inne klasy uszkodzeń DNA, a zatem są trudniejsze do wykrycia. W poprzednich publikacjach pokazaliśmy okno wykrywania obu wersji. 6,7

Chociaż test komet był rutynowo używany do podstawowych badań nad uszkodzeniami i naprawą DNA oraz testami genotoksyczności1,2,8-15, stwierdzono, że test ma słabą powtarzalność ze względu na zmienność między próbkami, między ludźmi i między laboratoriami. Ponadto test ma niską przepustowość, częściowo dlatego, że pozyskiwanie obrazów i analiza danych są pracochłonne. Razem te ograniczenia przyczyniają się do jego stosunkowo niskiej akceptacji w badaniach na dużą skalę. Dzięki integracji technologii i zasad inżynierii, CometChip przynosi rozwiązanie problemów związanych z przepustowością i niespójnościami, które są związane z tradycyjnym testem kometarnym6,7. Krótko mówiąc, aby stworzyć chip, forma jest mikrofabrykowana za pomocą fotolitografii, aby stworzyć mikrosłupki o średnicy tak małej, jak pojedyncza komórka. Forma jest następnie używana do stemplowania stopionej agarozy, w wyniku czego po zestaleniu się żelu powstaje szereg mikrostudzienek. Opracowywane są chipy, które mają zapewnić naukowcom studzienki o różnych rozmiarach, które będą kompatybilne z różnymi typami komórek. Aby załadować chip, komórki w mediach mogą osadzać się w studzienkach grawitacyjnie; Nadmiar komórek jest zmywany. Uwięzione komórki są następnie zamykane w kapsułkach za pomocą cienkiej warstwy agarozy o niskiej temperaturze topnienia, a następnie bezdenna 96-dołkowa płytka jest zaciskana na powierzchni żelu w celu utworzenia 96 makrodołków, z których każda ma setki mikrodołków na dolnej powierzchni.

Ten protokół opisuje ogólne procedury eksperymentów z tym chipem, które obejmują przygotowanie żelu, ładowanie komórek, dozowanie i naprawę, lizę komórek, elektroforezę i obrazowanie fluorescencyjne. Pokazujemy dwa przykłady eksperymentów z odpowiedzią na dawkę z komórkami limfoblastowymi narażonymi na znane czynniki uszkadzające DNA, używając odpowiednio alkalicznej i neutralnej wersji testu. Pokazano również dwa eksperymenty naprawcze, które opisują, w jaki sposób można ocenić reakcję naprawczą po ekspozycji za pomocą systemu.

Protokół

1. Przygotowanie żetonu

  1. Wyjmij żel wiórowy z opakowania i umieść w prostokątnej płytce z jedną komorą, folią żelową do dołu.
  2. Żel do mycia w 25 ml 1x PBS przez 15 min, powtórzyć dwa razy.
  3. Ustaw żel na szklanej płytce i odpowiednio oznacz orientację żelu.
  4. Delikatnie dociśnij odwróconą 96-dołkową płytkę bez dna do żelu; upewnij się, że wszystkie dołki płytki bez dna znajdują się w obszarze żelu.
  5. Użyj 1.5-calowych spinaczy do segregatorów po każdej stronie płyty, aby zabezpieczyć clamping ze szkłem.
  6. Odessać nadmiar buforu PBS do każdej studzienki.

2. Wczytywanie komórek

  1. Przygotować zawiesiny komórek:
    1. W przypadku zawiesinowych linii komórkowych rozcieńczyć zawiesinę komórek w pożywce, aby uzyskać końcowe stężenie 105–106 komórek/ml.
    2. W przypadku przylegających linii komórkowych postępuj zgodnie z normalnymi protokołami odłączania/trypsynizacji i rozcieńczaj oderwane komórki w pożywce do końcowego stężenia 105–106 komórek / ml. Jeśli komórki agregują się, przepuść zawiesinę komórek w filtrze komórkowym, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
  2. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej.
  3. Przykryj płytkę folią żelową, aby zapobiec parowaniu mediów.
  4. Pozostawić komórki do załadowania przez co najmniej 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  5. Wyjmij wiór z inkubatora i odessaj pożywkę z każdej studzienki.
  6. Usuń spinki do segregatora i 96-dołkową płytkę bez dna; przytrzymaj chip szklaną płytką pod kątem i delikatnie spłucz 1x PBS, aby usunąć nadmiar komórek na agarozie.
  7. Sprawdź obciążenie komórek za pomocą mikroskopu jasnego pola z soczewką obiektywową 4X. Jeśli zaobserwuje się niewystarczające obciążenie, powtórz od kroku 2.1.
  8. Umieść załadowany wiór na równej powierzchni (stół laboratoryjny). Chip wierzchni z 1% agarozą o niskiej temperaturze topnienia (LMP), który jest wstępnie podgrzewany w temperaturze 37 °C. Na każdy chip potrzeba około 2–3 ml agarozy LMP.
  9. Pozostawić nakładkę do zestalenia się w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie przenieść do lodówki o temperaturze 4 °C na 5 minut w celu całkowitego zżelowania.

3. Dozowanie i naprawa

UWAGA: Aby zbadać podstawowy poziom uszkodzenia DNA, przejdź do kroku 4.

  1. Ostrożnie wyrównaj dołki chipa (utworzone z poprzedniego mocowania) z dołkami nowej 96-dołkowej płytki bez dna. Ponownie dociśnij 96-dołkową płytkę bez dna na górze i zabezpiecz zacisk za pomocą klipsów do segregatora.
  2. Dodać 100 μl substancji chemicznej o pożądanej dawce do każdego dołka płytki 96-dołkowej; dozować/leczyć na lodzie lub w lodówce o temperaturze 4 °C przez żądany okres czasu.
  3. Po dozowaniu odessać chemikalia z każdej studzienki i wypłukać pozostałości chemikaliów za pomocą 1x PBS. Jeśli w tym miejscu badane są uszkodzenia bezpośrednie, przejdź do kroku 4.
  4. Aby zbadać kinetykę naprawy, pozwól komórkom w chipie naprawić się w pożywce w temperaturze 37 °C. Liza (przejdź do kroku 4) w określonych punktach czasowych.
    UWAGA: Naprawę można wykonać na chipie z dołączoną 96-dołkową płytką bez dna lub chip można pociąć na oddzielne kawałki po wyjęciu 96-dołkowej płytki bez dna.

4. Liza

  1. Aby wykonać alkaliczny test komet:
    1. Stwórz działający alkaliczny bufor do lizy, dodając 1% Triton X-100 do alkalicznego roztworu podstawowego do lizy (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, pH 10). Przygotować około 25 ml roboczego buforu do lizy dla każdego wióra.
    2. Wstępnie schładzany alkaliczny bufor do lizy w temperaturze 4 °C.
    3. Zanurz chip w chłodnym, działającym alkalicznym buforze do lizy i pozwól, aby liza wykonała O/N w lodówce o temperaturze 4 °C.
  2. Aby wykonać test neutralnej komety:
    1. Stwórz działający neutralny bufor do lizy, dodając 1% Triton X-100 i 10% DMSO do neutralnego roztworu podstawowego do lizy (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, 1% N-lauroilsarkozyny, pH 9,5). Przygotować około 25 ml roboczego buforu do lizy dla każdego wióra.
    2. Wstępnie podgrzany pracujący neutralny bufor do lizy w temperaturze 43 °C.
    3. Zanurz chip w ciepłym, pracującym neutralnym buforze do lizy i pozwól, aby liza przeprowadziła O/N w inkubatorze o temperaturze 43 °C.

5. Elektroforeza

  1. Aby wykonać alkaliczny test komet:
    1. Usuń bufor do lizy i szybko spłucz wiór za pomocą 1x PBS.
    2. Zabezpiecz wiór w komorze elektroforetycznej folią żelową stroną skierowaną w dół za pomocą taśmy dwustronnej.
    3. Doprowadzić komorę do chłodni o temperaturze 4 °C.
    4. Napełnij komorę zimnym alkalicznym buforem do elektroforezy (0,3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA) do poziomu, który pokryje tylko żel.
    5. Pozostaw do alkalicznego odwinięcia na 40 minut.
    6. Uruchomić elektroforezę przy napięciu 1 V/cm i natężeniu 300 mA przez 30 minut w chłodni. Dostosuj objętość bufora do elektroforezy w komorze, aby uzyskać żądany prąd roboczy.
  2. Aby wykonać test neutralnej komety:
    1. Usunąć bufor do lizy i przepłukać chip neutralnym buforem do elektroforezy (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM kwas borowy, pH 8,5) przez 2 x 15 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Zabezpiecz wiór w komorze elektroforetycznej folią żelową stroną skierowaną w dół za pomocą taśmy dwustronnej.
    3. Doprowadzić komorę do chłodni o temperaturze 4 °C.
    4. Napełnij komorę zimnym obojętnym buforem do elektroforezy (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM kwas borowy, pH 8,5) do poziomu, który pokryje tylko żel.
    5. Pozostaw żel w chłodnym pomieszczeniu na 60 minut.
    6. Uruchomić elektroforezę przy 0,6 V/cm i 6 mA przez 60 minut w chłodni. Dostosuj objętość bufora do elektroforezy w komorze, aby uzyskać żądany prąd roboczy.

6. Obrazowanie fluorescencyjne

  1. Usuń wiór z komory elektroforezy z chłodni.
  2. Neutralizować żele w buforze neutralizacyjnym (0,4 M Tris, pH 7,5) przez 2 x 15 minut w lodówce o temperaturze 4 °C.
  3. Wybarwić chip wybranym fluorescencyjnym barwnikiem DNA (tj. SYBR Gold, bromek etydyny) zgodnie z procedurami zalecanymi przez producenta. Obraz za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

7. Analiza danych

Analizuj obrazy komet za pomocą standardowego oprogramowania do badania komet, takiego jak Komet 5.5.

Wyniki

W tym pierwszym przykładzie opisujemy podejście do ilościowego oznaczania początkowych poziomów uszkodzeń DNA w ludzkich komórkach limfoblastoidalnych po narażeniu na uszkodzenia oksydacyjne przy użyciu H2O2. W celu oceny zmian w zasadach oraz pęknięć pojedynczej nici indukowanych przez H2O2 zastosowano zasadowe warunki testu kometowego. Po zakończeniu nakładania i enkapsulacji komórek w warstwie agarozy, na powierzchnię dociskano płytkę 96-dołkową bez dna, aby stworzyć 96 przedziałów na chipie. Każdy z 96 dołków może zostać poddany działaniu innego rodzaju lub stężenia substancji chemicznych. W tym przypadku zastosowano cztery różne dawki H2O2, a jako kontrolę negatywną wykorzystano 1x PBS. Reprezentatywne obrazy ułożonych w macierz komet przedstawiono na Rysunku 1A, gdzie próbki nieleczone (góra), narażone na 50 μM (środek) oraz 100 μM (dół) H2O2 wykazały różne poziomy ogonów komet. Analiza obrazów komet może być przeprowadzona przy użyciu komercyjnie dostępnego oprogramowania, które zazwyczaj kwantyfikuje poziom uszkodzeń na podstawie całkowitej intensywności fluorescencji i odległości migracji każdego ogona komety. Pomiary zazwyczaj wykonuje się na 50 do 100 kometach na warunek i oblicza wartość medianową (procent DNA w ogonie lub długość ogona). Rysunek 1B ilustruje krzywą odpowiedzi procentowej DNA w ogonie, przeanalizowaną z komet limfoblastoidalnych komórek TK6 narażonych na cztery różne stężenia H2O2. Spójność między niezależnymi eksperymentami wykazuje skuteczność tego podejścia w ocenie odpowiedzi na uszkodzenia DNA wywołane różnymi poziomami traktowania chemicznego komórek.

Aby zbadać zmienność między próbkami (np. między makrodofkami) oraz między powtórzeniami tego samego eksperymentu, zmienność międzypróbkową i międzyeksperymentalną przedstawiono odpowiednio na Rysunku 2A i 2B. W ramach każdego eksperymentu każde wgłębienie chipa 96-dołkowego odpowiada innej próbce, zatem zmienność między wgłębieniami ujawnia zmienność międzypróbkową urządzenia. W tym przypadku komórki TK6 wprowadzone do 12 wgłębień chipa 96-dołkowego poddano działaniu tej samej dawki H2O2 i poddano natychmiastowej lizie po traktowaniu. Wszystkie pozostałe etapy eksperymentu wykonano równolegle, a mediany z co najmniej 50 komet z każdego makrodofka przedstawiono na Rysunku 2A. Średnia z median wynosi 77,53% DNA w ogonie, przy odchyleniu standardowym wynoszącym 3,99%. Na podstawie tych danych obliczyliśmy, że współczynnik zmienności między próbkami wynosi 5,2%, co jest wartością kilkukrotnie niższą niż w przypadku tradycyjnego testu, co świadczy o zwiększonej odporności tej metody6,16. Aby ocenić powtarzalność testu, poddano komórki TK6 w chipie działaniu 75 μM H2O2 i przeanalizowano natychmiastowy poziom uszkodzeń DNA. Eksperyment ten powtórzono sześciokrotnie, a dane z każdego powtórzenia przedstawiono na Rysunku 2B. W identycznych warunkach eksperymentalnych otrzymano wyniki w zakresie od 41,76% do 57,87%, przedstawione na rysunku jako szare słupki. Średnia z sześciu powtórzeń wynosi 49,57%, przy błędzie standardowym średniej wynoszącym zaledwie 2,04%. Niska zmienność między powtórzeniami wskazuje, że test komet przeprowadzony na tym nowym urządzeniu jest wysoce powtarzalny.

Aby ocenić kinetykę naprawy, komórki pozostawia się do naprawy DNA w świeżej pożywce po przeprowadzeniu zabiegu. Lizowanie makrowykopów w różnych punktach czasowych pozwala ukazać zmianę uszkodzeń DNA w czasie. Przykład przedstawiono na Rysunku 3. W tym eksperymencie komórki TK6 zostały najpierw zamknięte w chipie, poddane działaniu 50 μM H2O2, a następnie pozostawiono do naprawy do 60 min po ekspozycji. Komórki lizowano odpowiednio w 0, 20, 45 i 60 min. Reprezentatywne obrazy komet w różnych punktach czasowych przedstawiono na Rysunku 3A, a zmianę poziomu uszkodzeń DNA w czasie przedstawiono na Rysunku 3B. Dane te wykazały, że niemal wszystkie uszkodzenia zostają naprawione w ciągu 45 min po traktowaniu H2O2. Wiele zmiennych może wpływać na tempo naprawy, w tym rodzaj linii komórkowej i użytego czynnika chemicznego. Dlatego badacze mogą wprowadzać zmiany do protokołu (np. wydłużając czas naprawy), aby dostosować go do dodatkowych potrzeb w swoich badaniach. Przedstawiamy tutaj kolejny przykład eksperymentu z naprawą z użyciem tego chipa, w którym komórki TK6 są poddawane działaniu innego czynnika genotoksycznego; N-metylo-N’-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG) jest czynnikiem alkilującym znanym z indukowania uszkodzeń zasad, w tym 7-metyloguaniny i 3-metyloadeniny. Uszkodzenia te są przekształcane w miejsca abazyczne albo w wyniku spontanicznej depurynacji, albo poprzez enzymatyczne usunięcie przez glikozylazy DNA. Powstałe miejsce abazyczne może zostać rozcięte w warunkach alkalicznych, a tym samym wykryte na chipie. Początkowa ekspozycja powoduje znaczny wzrost uszkodzeń, co jest widoczne po długich ogonach, a z upływem czasu ogony te ulegają skróceniu, gdy komórki przywracają nienaruszone DNA podczas naprawy. Chociaż uszkodzenia alkilacyjne i oksydacyjne są naprawiane głównie poprzez szlak naprawy przez wycinanie zasad, liczba powstałych uszkodzeń oraz białka zaangażowane w naprawę są różne. Zróżnicowanie to może prowadzić do różnych temp konwersji do miejsc abazycznych, a także do różnych temp naprawy powstałych miejsc abazycznych. Na Rysunku 4 przedstawiono kinetykę naprawy komórek TK6 eksponowanych na 0.1, 1 i 3 µg/ml MNNG. W tym eksperymencie wydłużyliśmy czas trwania badania do 2 h po ekspozycji, ponieważ uszkodzenia indukowane przez MNNG wydają się utrzymywać dłużej i są usuwane w wolniejszym tempie w porównaniu do uszkodzeń indukowanych przez H2O2.

Analiza DSB w warunkach neutralnych jest bardzo podobna do protokołu analizy uszkodzeń pojedynczej nici w warunkach alkalicznych. Aby wykazać początkowe poziomy uszkodzeń, komórki TK6 wystawiono na zmienne poziomy gIR, a otrzymane komórki poddano lizie i elektroforezie przy neutralnym pH (Rysunek 5A). Warto zauważyć, że morfologia ogonów komet różni się od tej obserwowanej w warunkach testu alkalicznego. Aby uzyskać widoczną fragmentację DNA w tym badaniu, zastosowana dawka IR jest znacznie wyższa (0-100 Gy) niż dawka wymagana do zaobserwowania uszkodzeń w warunkach alkalicznych. Ponadto stwierdzono, że długość ogona jest najczulszym parametrem odzwierciedlającym zakres uszkodzeń DNA podczas stosowania neutralnego testu kometowego7. Analizowana krzywa zależności od dawki została przedstawiona na Rysunku 5B. Za pomocą tej metody można również ocenić naprawę pęknięć dwuniciowych DNA w komórkach, co zostało wykazane przez Weingeist et. al.7. Podsumowując, neutralny CometChip stanowi cenne narzędzie do wysokoprzepustowej analizy DSB DNA.

Comet assay results, graph of % Tail DNA vs. H2O2 dose, DNA damage analysis, microscopy image.
Rycina 1. H2O2 odpowiedź komórek TK6 na dawkę z wykorzystaniem alkalicznej próby kometowej. (A) Ułożone w macierzy komety w mikrowydatkach z niepoddanych działaniu czynnika limfoblastów TK6 (góra) oraz komórek TK6 eksponowanych na 50 μM (środek) i 100 μM (dół) H2O2 przez 20 min w temperaturze 4 °CPasek skali wynosi 100 μm. (B) H2O2 odpowiedź na dawkę komórek TK6 eksponowanych na różne poziomy H2O2Każdy punkt danych stanowi średnią z trzech niezależnych eksperymentów, w których w każdym przypadku uzyskano medianę procentowej zawartości DNA w ogonie dla co najmniej 50 pojedynczych komet. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej z trzech niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres testu uszkodzeń DNA; analiza % DNA w ogonie w dołkach i eksperymentach; ilościowa ocena danych.
Rycina 2. Zmienność międzypróbkowa i międzyeksperymentalna. (A) Zmienność międzypróbkowa. Ludzkie limfoblasty TK6 wprowadzono do 12 dołków chipa 96-dołkowego. Każdy dołek poddano działaniu 100 μl 50 μM H2O2 przez 20 min w 4 °C. Komórki natychmiast poddano lizie i analizie pod kątem % DNA w ogonie. Przedstawiono dane z każdego dołka. Każdy słupek reprezentuje medianę z co najmniej 50 pojedynczych komet z każdego dołka. Średnia z 12 dołków wynosi 77,53%, odchylenie standardowe 3,99%, a obliczony współczynnik zmienności wynosi 5,2%. (B) Zmienność międzyeksperymentalna. Ludzkie limfoblasty TK6 wprowadzono do chipa 96-dołkowego i poddano działaniu 100 μl 75 μM H2O2 przez 20 min w 4 °C. Komórki natychmiast poddano lizie i analizie pod kątem % DNA w ogonie. Ten sam eksperyment powtórzono 6 razy, a dane z każdego powtórzenia przedstawiono jako szary słupek. Każdy słupek reprezentuje medianę % DNA w ogonie z co najmniej 100 pojedynczych komet z każdego powtórzenia. Średnia z 6 powtórzeń wynosi 49,57% i jest przedstawiona tutaj jako czarny słupek. Odchylenie standardowe z 6 powtórzeń wynosi 4,99%, a obliczony błąd standardowy średniej wynosi 2,04%, co przedstawiono na rycinie jako słupek błędu.

Analiza naprawy DNA metodą Comet assay, schemat i wykres, ekspozycja na H2O2 w czasie, % DNA w ogonie.
Rysunek 3. Naprawa uszkodzeń indukowanych H2O2 w limfoblastach TK6. (A) Schemat badania naprawy z reprezentatywnymi kometami. Komórki TK6 są traktowane czynnikami uszkadzającymi, a następnie pozostawiane do naprawy w pożywce w temperaturze 37 °C przed lizą. (B) Kinetyka naprawy komórek TK6 po traktowaniu 50 μM H2O2 przez 20 min w 4 °C. Każdy punkt danych stanowi średnią z trzech niezależnych eksperymentów, w których w każdym z nich wyznaczono medianę procentowej zawartości DNA w ogonie dla co najmniej 50 pojedynczych komet. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej z powtórzonych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykres czasu naprawy DNA; % DNA w ogonie w zależności od czasu dla poziomów ekspozycji na MNNG; analiza wykresu słupkowego.
Rycina 4. Naprawa uszkodzeń indukowanych przez MNNG w limfoblastach TK6. Komórki TK6 traktowano MNNG w stężeniach 0,1, 1 i 3 µg/ml przez 30 min w temperaturze 4 °C, a następnie pozostawiono do naprawy w pożywce w temperaturze 37 °C do 120 min po ekspozycji. Mediana procentowej zawartości DNA w ogonie dla co najmniej 50 pojedynczych komet została wyznaczona dla każdego z trzech niezależnych eksperymentów. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej z trzech niezależnych eksperymentów.

Wyniki testu kometkowego; analiza fragmentacji DNA na obrazach żelowych; wykres zależności długości ogonów od dawki IR.
Rysunek 5. Odpowiedź komórek TK6 na dawkę IR w neutralnym teście kometkowym. (A) Układy komet w mikrowellach z nieleczonych limfoblastów TK6 (góra) oraz komórek TK6 poddanych promieniowaniu gamma dawką 40 Gy (środek) i 80 Gy (dół). Pasek skali wynosi 100 μm. (B) Odpowiedź komórek TK6 na różne poziomy promieniowania gamma. Każdy punkt danych reprezentuje medianę długości ogona (μm) dla co najmniej 300 komet zgromadzonych z sześciu makrowelli na chipie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Wszechobecne genotoksyny w środowisku, a także w komórkach ludzkich, wywołują nieunikniony stres i uszkodzenia DNA komórkowego. W rzeczywistości szacuje się, że w ludzkich komórkach w stanie stacjonarnym18 występuje 1000 uszkodzeń DNA. Zrozumienie podatności na uszkodzenia i kinetyki naprawy u ludzi nie tylko zapewnia wgląd w badania podstawowe, ale także przynosi korzyści w opracowywaniu leków. Jak na ironię, pomimo zdolności uszkodzeń DNA do promowania raka, środki uszkadzające DNA są stosowane w bardzo wysokich stężeniach w leczeniu raka, co sprawia, że wiedza na temat uszkodzeń i naprawy DNA jest istotna dla medycyny spersonalizowanej. CometChip to nowatorskie urządzenie badawcze, które wykorzystuje praktyki mikrofabrykacji, aby zrewolucjonizować istniejący od dawna test uszkodzeń DNA. Opierając się na tych samych zasadach, co tradycyjny test komet, chip zapewnia znacznie wyższą przepustowość i lepszą odtwarzalność. Opisujemy tutaj metody korzystania z tego chipa. Aby wyjaśnić jego użyteczność i solidność, przedstawiamy wyniki kilku eksperymentów, w których chip został wykorzystany do oceny uszkodzeń wywołanych przez kilka różnych czynników uszkadzających DNA oraz gdzie został wykorzystany do oceny naprawy DNA. Przedstawione tutaj wyniki dostarczają przydatnych informacji na temat korzystania z chipa i pokazują jego szerokie zastosowanie w badaniach nad uszkodzeniem i naprawą DNA.

Jednym z najważniejszych kroków w tym protokole jest osiągnięcie efektywnego ładowania komórek. W tym systemie przetestowano wiele linii komórkowych, w tym zarówno komórki zawiesinowe, jak i przylegające. Wydajność ładowania zależy od wielu zmiennych, takich jak typ ogniwa, rozmiar ogniwa, stężenie obciążenia i czas. Zawiesinowe linie komórkowe, takie jak komórki limfoblastoidalne, są najłatwiejsze w obróbce. Stężenie zawiesiny komórek może wahać się od 10,4 do 10,6 komórek na 96 dołków, a ładowanie zwykle kończy się w ciągu 15–30 minut. Większa gęstość komórek ułatwia ładowanie i skraca czas potrzebny komórkom na osiedlenie się w mikrostudzienkach.

Parametry obciążenia dla ogniw przylegających mogą różnić się od ogniw zawiesinowych. Stwierdzono, że linie komórkowe, takie jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), mają podobną wydajność ładowania jak komórki zawiesinowe (po trypsynizacji), a zatem wykorzystują podobne warunki obciążenia. Inne typy komórek, takie jak komórki nowotworowe, które łatwo tworzą agregaty komórkowe w zawiesinie, wymagają dodatkowej obsługi. Przepuszczanie zawiesin komórkowych przez filtr jednokomórkowy i dodawanie trypsyny do podłoża zawiesinowego może hamować tworzenie się klastrów komórkowych podczas ładowania. Wreszcie, jeśli chodzi o czas ładowania, czas potrzebny do wychwycenia przylegających linii komórkowych w mikrostudzienkach może wynosić od 20 minut do 1 godziny. W związku z tym zaleca się, aby użytkownicy przeprowadzili eksperymenty pilotażowe w celu określenia optymalnych warunków obciążenia przed przystąpieniem do dalszych badań. Skuteczność ładowania można zobrazować pod mikroskopem jasnego pola lub dokładniej ujawnić poprzez barwienie zamkniętych komórek za pomocą DAPI lub innych barwników DNA przed oceną pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Jedną z głównych zalet tej metody i chipa jest wszechstronność. Po pierwsze, naukowcy nie są ograniczeni do określonego stężenia komórek roboczych, ponieważ nadmiar komórek jest wypłukiwany, a mikromacierz zapewnia jednolitą gęstość komety. Po drugie, mikrostudzienki mogą być wykonane o różnych rozmiarach, aby pomieścić typy komórek o różnych rozmiarach. W warunkach, w których wiele komórek jest wychwytywanych w pojedynczej mikrostudzince, komety wielokomórkowe są samokalibrowane i dają spójne wyniki w porównaniu z kometami jednokomórkowymi6,7. Kolejną zaletą tworzenia wzorów komórek w mikromacierzy jest to, że wszystkie komety znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej ze stałymi pozycjami, co redukuje szum spowodowany nieostrymi kometami i ułatwia automatyczne obrazowanie i analizę. Znaczna poprawa przepustowości i czułości zapewniana przez CometChip umożliwia zastosowanie testu w badaniach na dużą skalę. Podsumowując, chip stanowi cenne narzędzie do oceny uszkodzeń DNA dla badaczy, toksykologów, klinicystów i epidemiologów.

Podczas gdy test kometarny jest znany ze swojej doskonałej czułości w wykrywaniu szerokiego zakresu uszkodzeń DNA, test ten cierpi również na niską specyficzność. Użycie tego protokołu znacznie poprawia odtwarzalność i przepustowość testu, ale nie wykazuje postępu w swoistości. Niemniej jednak stwierdzono, że multipleksowanie testu z innymi metodologiami jest skuteczne w osiąganiu wyższej swoistości. Jednym z przykładów jest włączenie oczyszczonych enzymów specyficznych dla zmian chorobowych. Enzymy te mogą przekształcać niewykrywalne w inny sposób zmiany podstawowe w wykrywalne pęknięcia nici i miejsca zasadowe1,19-21. Szeroko stosowanym przykładem jest endonukleaza naprawcza formamidopirymidyno-glikozylaza DNA (Fpg), która ujawnia oksydacyjne modyfikacje DNA19,22. Ponieważ etap trawienia enzymatycznego jest stosowany po lizie komórek, system może być traktowany w taki sam sposób, jak tradycyjny szkiełko agarozowe bez zmian w protokole. Chociaż szczegółowy protokół nie jest tutaj opisany, podejście to zostało zaadaptowane przez wielu tradycyjnych użytkowników testów komet w przeszłości, a protokoły można łatwo znaleźć. W poprzedniej publikacji zastosowaliśmy tę metodę do identyfikacji uszkodzeń wywołanych światłem fluorescencyjnym 22 .

Główną zaletą tej metody jest zapewniana przez nią przepustowość, która otwiera drzwi do badań, które wcześniej były praktycznie niemożliwe. Możliwość przetwarzania 96 próbek na tej samej platformie nie tylko zmniejsza nakład pracy i czas, ale także redukuje odgłosy eksperymentalne i znacznie zwiększa odtwarzalność. Zmienność między próbkami jest znacznie niższa niż w przypadku tradycyjnej zmiany typu slide-to-slide, która może być 2-krotnie wyższa niż zmienność obserwowana przy użyciu tego chipa6,7. Zmniejszenie szumów prowadzi również do poprawy czułości, umożliwiając wykrywanie bardziej subtelnych różnic między próbkami. Ponieważ urządzenie wykorzystuje standardowy format 96-dołkowy, jest kompatybilne z ogólną aparaturą badawczą i technologiami HTS. Weźmy pod uwagę badanie, które wymaga oceny 100 próbek, przy założeniu, że przeciętny badacz może przetworzyć ~30 szklanych szkiełek w ciągu kilku dni. Biorąc pod uwagę, że każda próbka musi być wykonana w trzech egzemplarzach, ukończenie takiego badania zajęłoby około jednego miesiąca, co również nieuchronnie ucierpiałoby z powodu zmienności między próbkami. Natomiast przetwarzanie 100 warunków, każdy w trzech egzemplarzach, za pomocą tego chipa wymaga tylko kilku płytek i może być wykonane w ciągu trzech dni. Ta znaczna poprawa przepustowości otwiera drzwi do badań, które wcześniej były nieosiągalne.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje zarówno podstawowe procedury wykonywania standardowego testu komety, jak i zmodyfikowane kroki wymagane do korzystania z platformy CometChip. Dzięki możliwości pomiaru zarówno wrodzonych poziomów uszkodzeń DNA, jak i późniejszej odpowiedzi naprawczej, test jest bardzo przydatny w różnych zastosowaniach biologicznych i klinicznych. Informacje na temat wpływu określonych substancji chemicznych na genom ułatwiają zapobieganie chorobom i ich leczenie. Co więcej, istnieje również duże zainteresowanie określeniem różnic we wrażliwości na uszkodzenia DNA i zdolności naprawczych wśród osób23,24. Technika ta zapewnia przepustowość wymaganą dla takich badań na dużą skalę. Wiedza na temat różnic międzyosobniczych ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji osób podatnych oraz dla projektowania zindywidualizowanych terapii lub strategii zapobiegawczych. Podsumowując, zaprezentowana tutaj technologia zapewnia wysoce wydajną, obiektywną i ilościową platformę analizy uszkodzeń DNA, która ma potencjał, aby w niedalekiej przyszłości stać się standardową metodologią.

Oświadczenia

Licencja na CometChip została udzielona firmie Trevigen, Inc. na podstawie zgłoszenia patentowego, które obejmuje Wood, Weingeist, Bhatia i Engelward.

Podziękowania

Ta praca była głównie wspierana przez 5-UO1-ES016045 z częściowym wsparciem ze strony 1-R21-ES019498 i R44-ES021116. DMW otrzymało wsparcie w ramach grantu szkoleniowego NIEHS w zakresie toksykologii środowiskowej T32-ES007020. Sprzęt został dostarczony przez Centrum Nauk o Zdrowiu Środowiskowym P30-ES002109.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
UltraPure LMP Agaroza (niska temperatura topnienia)Invitrogen16520Wielu dostawców
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS) 1xGibco firmy life technologies14190Wielu dostawców
Krystaliczny NaClMacron Chemicals7581-06Wielu dostawców
Krystaliczny Na2EDTAMacron Chemicals4931-04Wielu dostawców, Drażniący
krystaliczny Tris (baza)Sigma-AldrichT1503Wielu dostawców, Drażniący
krystaliczny Tris (kwas)J.T.Baker4106Wielu dostawców
Krystaliczna N-lauroilsarcosineSigma-AldrichL9150Wielu dostawców, Wysoce toksyczny przez drogi oddechowe, Drażniący
Triton X-100Sigma-AldrichX100Wielu dostawców, Szkodliwy po spożyciu., Drażniący
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD4540Wielu dostawców, Ciecz palna, Wpływ narządów docelowych
Krystaliczny NaOHMacron Chemicals7708-06Wielu dostawców,
Kwas solnyVWRBDH3871Wielu dostawców,
Krystaliczny kwas borowySigma-AldrichB6768Wielu dostawców, Efekt narządu docelowego, Teratogen, Zagrożenie reprodukcyjne
CometChipTrevigenW trakcie opracowywania do dystrybucji, skontaktuj się bezpośrednio z Trevigen w celu uzyskania niezbędnych materiałów
Naczynie 1-dołkoweThomas Scientific73521-420
Płytka 96-dołkowa bez dnaVWR655000-06
1,5-calowe spinacze do segregatorówZszywkiWielu dostawców
Szklana płytaTag SprzętDostosowany do rozmiaru 96-dołkowej
płytki Sowa Poziomy system elektroforezyVWR27372-131Wielu dostawców
PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad164-5050Wielu dostawców

Bibliografia

  1. Collins, A. R. The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).
  2. Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells. Nature. 1 (1), 23-29 (2006).
  3. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).
  4. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).
  5. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).
  6. Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).
  7. Weingeist, D. M., et al. Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors. Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).
  8. Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
  9. Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).
  10. Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).
  11. Møller, P. Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 96, Suppl 1.. 1-42 (2005).
  12. Dusinska, M., Collins, A. R. The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions. Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).
  13. Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).
  14. McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer. Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).
  15. Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -L. Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells. Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).
  16. Forchhammer, L., et al. Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG† inter-laboratory validation trial. Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).
  17. Olive, P. L., Wlodek, D., Banáth, J. P. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis. Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).
  18. Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA. Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).
  19. Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay). Current protocols in cell biology. , Suppl Chapter 6, Unit 6.11.. (2010).
  20. Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay. Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).
  21. Collins, A. R., Dusinská, M., Horská, A. Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay. Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).
  22. Ge, J., et al. Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).
  23. Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations. Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).
  24. Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population. Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test kometowywysokoprzepustowe przesiewaniekomórki w układzie mikroarrayliza alkalicznaelektroforezaobrazowanie fluorescencyjnebadanie genotoksycznościnakładanie komórek
CometChip: wysokowydajna, 96-dołkowa platforma do pomiaru uszkodzeń DNA w mikromacierzowanych komórkach ludzkich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.