Izolacja pierwotnych miofibroblastów z tkanki okrężnicy myszy i człowieka

Podsumowanie

Miofibroblast jest wpływową komórką zrębu przewodu pokarmowego, która reguluje ważne procesy fizjologiczne zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym. Opisujemy technikę, która pozwala na izolację pierwotnych miofibroblastów zarówno z mysjej, jak i ludzkiej tkanki okrężnicy, którą można wykorzystać do eksperymentów in vitro.

Streszczenie

Miofibroblast to komórka zrębowa przewodu pokarmowego (GI), która zyskuje znaczną uwagę ze względu na swoją kluczową rolę w wielu funkcjach przewodu pokarmowego. Podczas gdy kilka linii komórkowych miofibroblastów jest dostępnych na rynku do badania tych komórek in vitro, wyniki badań z linii komórkowej wystawionej na eksperymentalne warunki hodowli komórkowej mają nieodłączne ograniczenia ze względu na nadmiernie redukcjonistyczny charakter pracy. Zastosowanie pierwotnych miofibroblastów daje ogromną przewagę w zakresie potwierdzania wyników eksperymentalnych zidentyfikowanych w linii komórkowej. Izolacja pierwotnych miofibroblastów z modelu zwierzęcego pozwala na badanie miofibroblastów w warunkach, które bardziej naśladują badany stan chorobowy. Izolacja pierwotnych miofibroblastów z ludzkiej tkanki okrężnicy dostarcza prawdopodobnie najistotniejszych danych eksperymentalnych, ponieważ komórki pochodzą bezpośrednio od pacjentów z chorobą podstawową. Opisujemy dobrze ugruntowaną technikę, którą można wykorzystać do wyizolowania pierwotnych miofibroblastów zarówno z mysjej, jak i ludzkiej tkanki okrężnicy. Te izolowane komórki zostały scharakteryzowane jako alfa-mięśni gładkich aktyny i wimentyny dodatnie oraz desminy-ujemne, zgodne z podnabłonkowymi miofibroblastami jelitowymi. Pierwotne komórki miofibroblastów mogą być hodowane w hodowli komórkowej i wykorzystywane do celów eksperymentalnych przez ograniczoną liczbę pasaży.

Wprowadzenie

Regulacja funkcji przewodu pokarmowego (GI) obejmuje złożone, dynamiczne interakcje między warstwą śluzówkową a leżącą pod nią mezenchymą. Interakcje te zwykle służą utrzymaniu homeostazy, ale mogą również prowadzić do rozwoju stanów chorobowych w warunkach patologicznych¹. Miofibroblasty to subpopulacja komórek zrębu znajdujących się pod warstwą nabłonkową, które komunikują się w sposób parakrynny z otaczającymi subpopulacjami komórek w celu regulacji szeregu krytycznych procesów przewodu pokarmowego, w tym regeneracji, naprawy i zwłóknienia błony śluzowej².

Linia komórkowa 18Co jest przykładem linii komórkowej ludzkiego miofibroblastu okrężnicy, która jest szeroko stosowana do badania funkcji miofibroblastów, ponieważ ma wiele cech pierwotnych miofibroblastów in situ. Należą do nich ekspresja białek aktyny mięśni gładkich (α-SMA) i wimentyny, a także ekspresja szeregu receptorów powierzchniowych komórek, takich jak receptor naskórkowego czynnika wzrostu lub receptory kwasu lizofosfatydowego^3,4. Ze względu na te wspólne cechy ultrastrukturalne, a także podobieństwa w funkcji biologicznej⁵, linia komórkowa 18Co była szeroko stosowana do badania funkcji miofibroblastów w kontekście wielu stanów chorobowych, takich jak nieswoiste zapalenie jelit lub rak jelita grubego^3,6. Istnieją jednak nieodłączne ograniczenia i obawy związane z korzystaniem z linii komórkowej. Należą do nich niestabilność genotypowa w czasie, która różnicuje linie komórkowe od komórek pierwotnych, zmieniając fenotyp i funkcję biologiczną komórki, w tym tempo wzrostu i interakcje z innymi populacjami komórek. Linie komórkowe nie mają również normalnych składników mikrośrodowiska przewodu pokarmowego (składników nabłonkowych, zrębowych i naczyniowych), co stanowi poważne ograniczenie w ich stosowaniu. W związku z tym wnioski wyciągnięte z eksperymentalnych badań linii komórkowych wymagają dalszej walidacji, aby zmniejszyć ryzyko błędnej interpretacji.

Pierwotne miofibroblasty można uzyskać z ludzkiej i mysiej tkanki okrężnicy, aby potwierdzić wyniki eksperymentów zidentyfikowanych w linii komórkowej⁷. Metoda ta została pierwotnie opisana przez Mahidę i wsp.⁸, a nasz protokół jest jedną z wielu dobrze opisanych technik, które można wykorzystać do wyizolowania pierwotnych miofibroblastów z mysiego i ludzkiego jelita grubego⁹. W przypadku dowolnego mysiego modelu choroby okrężnicy technika ta może być wykorzystana do wyizolowania pierwotnych miofibroblastów w celu zbadania, w jaki sposób oddziałują one z sąsiednimi komórkami lub przyczyniają się zarówno do normalnych, jak i patologicznych procesów żołądkowo-jelitowych^10,11. Technika ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób miofibroblasty przyczyniają się do gojenia się błony śluzowej, zwłóknienia oraz rozwoju gruczolaków i raków jelita grubego. Pierwotne miofibroblasty można również uzyskać z ludzkiej tkanki okrężnicy, która została wycięta w czasie operacji z powodu łagodnych (nieswoiste zapalenie jelit, zwężenia, zapalenie uchyłków) lub złośliwych. Wyizolowane komórki pierwotne z ludzkiej i mysiej tkanki okrężnicy mogą być hodowane w hodowli komórkowej i wykorzystywane przez ograniczoną liczbę pasaży.

Protokół

1. Uzyskaj tkankę jelita grubego

Mysz

Protokół przeprowadzania eksperymentów na zwierzętach, szczegółowo opisujący uzasadnienie i cele badań, został przedłożony i zatwierdzony przez nasze instytucjonalne Biuro Nadzoru nad Badaniami na Zwierzętach.

1. Poddaj mysz eutanazji wziewnym izofluranem, a następnie zwichnięciu szyjki macicy.
2. Wykonaj brzuszne nacięcie linii środkowej, wycofaj jelito cienkie i zidentyfikuj okrężnicę. Cofnij pęcherz moczowy i macicę (jeśli są obecne) z boku i zidentyfikuj kość łonową i przetnij ją cienkimi nożyczkami, aby odsłonić odbytnicę.
3. Wypreparuj krezkę grzbietową odbytnicy od okrężnicy i zmobilizuj okrężnicę od odbytu do jelita ślepego, a następnie przeciąć ją, aby odłączyć okrężnicę od jelita cienkiego.
4. Umieścić próbkę w lodowatym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
5. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml lodowatym PBS i kilkakrotnie przepłucz światło jelita grubego, aby usunąć jego zawartość, a następnie rozetnij okrężnicę wzdłuż za pomocą nożyczek.
6. Umieścić okrężnicę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml lodowatego PBS. Dwukropek nie musi być umieszczony w żadnej określonej orientacji. Umyj okrężnicę, wymieniając PBS, aż płyn będzie klarowny i nie będzie zawierał cząstek stałych.

Człowiek

Protokół pobierania tkanek ludzkich od pacjentów chirurgicznych, szczegółowo opisujący znaczenie pozyskiwania tej tkanki, jak również ocenę potencjalnego ryzyka i korzyści, został przedłożony i zatwierdzony przez nasze instytucjonalne Biuro Programu Ochrony Badań Naukowych.

1. Współpraca badawcza z chirurgiem jelita grubego jest niezbędna, aby móc pozyskać tkankę ludzką do swoich badań. Protokół uzyskania ludzkiej tkanki jelita grubego powinien zostać przedłożony i zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną.
2. Przed zabiegiem chirurgicznym uzyskuje się pisemną świadomą zgodę pacjenta.
3. Chirurg wykona resekcję jelita grubego w standardowy sposób. Po usunięciu okrężnicy od pacjenta próbka jest natychmiast przenoszona do patologii. Dostarczany jest przekrój ściany okrężnicy o pełnej grubości 0,5 cala, który nie jest potrzebny do oceny patologicznej i jest natychmiast umieszczany na lodowatym PBS. Próbka ta nie powinna zawierać krezki jelita grubego, a także należy usunąć przydatki epiploiczne, ponieważ obecność tłuszczu wpłynie na proces trawienia.

2. Nagie komórki nabłonkowe

1. Inkubować całą okrężnicę myszy w 25 ml 5 mM EDTA w HBSS (temperatura pokojowa) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Umieść rurkę stożkową w łaźni wytrząsającej o temperaturze 37 °C (250 obr./min) na 15 minut. Po 15 minutach ostrożnie wylej płyn i ponownie napełnij probówkę 25 ml 5 mM EDTA, powtórz w sumie 5 prań. W przypadku ludzkiej okrężnicy, po uzyskaniu od patologa 1/2 cala paska ściany okrężnicy, pokrój okrężnicę nożyczkami na cztery równe kawałki. Umieść dwa kawałki w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml, a pozostałe dwa kawałki tkanki okrężnicy umieść w oddzielnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Następnie inkubować z 25 ml 5 mM EDTA w HBSS i przeprowadzić płukanie, jak opisano powyżej.
2. Opłucz okrężnicę dwukrotnie w 20 ml lodowatego PBS.
3. Umieść tkankę okrężnicy myszy w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml RPMI-5, 10 U dyspazy i 2,000 U kolagenazy D (temperatura pokojowa). W przypadku ludzkiej tkanki jelita grubego należy użyć podwójnej ilości dypazy i kolagenazy (20 U dypazy, 4 000 U kolagenazy D).
4. Umieść rurkę w łaźni powietrznej z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C zorientowanej pionowo (jeśli jest umieszczona poziomo, następuje zbyt duże napowietrzenie i uszkodzenie komórek). Wstrząsaj z prędkością 250 obr./min przez maksymalnie 60 min. Po ekspozycji na dypazę i kolagenazę D tkanka okrężnicy zacznie trawić, a tkanka okrężnicy zacznie wyglądać na żylastą. Zwykle trwa to około 30 minut. Kiedy okrężnica ma taki wygląd, usuń okrężnicę z enzymów.
5. Potrząśnij każdą rurką w górę iw dół 2-4 razy, aby rozbić tkankę. Osadzać tkankę w proporcjach 200 x g w wirówce stołowej (4 °C) przez 5 minut. Ostrożnie odlej supernatant i wyrzuć.

3. Izolacja i hodowla miofibroblastów

1. Zawiesić każdą osadkę, dodając 10 ml buforu do lizy ACK (47 °C). Ponownie odwirować przy 200 x g przez 5 minut (4 °C), odlać i wyrzucić supernatant.
2. Zawiesić każdą granulkę, dodając 10 ml RPMI-5 za pomocą pipety.
3. Przepuścić połowę zawiesiny komórek (5 ml) przez sitko o oczkach 70 μm za pomocą pipety o pojemności 10 ml do naczynia poddanego działaniu TC o średnicy 100 mm. Następnie dodaj dodatkowe 15 ml RPMI-5. Powtórzyć z pozostałymi 5 ml zawiesiny komórkowej w innym naczyniu o średnicy 100 mm poddanej działaniu TC. Jedna okrężnica myszy da zatem dwie 100-milimetrowe szalki poddane działaniu TC. Jeden 1/2-calowy pasek ludzkiej tkanki okrężnicy da w sumie cztery 100-milimetrowe naczynia poddane działaniu TC.
4. Umieścić szalki z kultur tkankowych w inkubatorze o stężeniu 10% CO_{2 w} temperaturze 37 °C. Warunki hodowli są takie same dla mysich i ludzkich komórek pierwotnych.
5. Po 3 godzinach delikatnie zmyj nieprzylegające komórki za pomocą dwóch zmian HBSS. Unoszące się zanieczyszczenia należy delikatnie zmyć. Komórki przylegające składają się z komórek nabłonkowych, makrofagów i miofibroblastów. Tydzień po wysiewie dzielą się tylko miofibroblasty, makrofagi i komórki nabłonkowe starzeją się po pierwszym pasażu. Dodaj świeży RPMI-5 i hoduj komórki w hodowli komórkowej.
6. Komórki są pasażowane przez trypsynizację przez 5 minut i są dzielone w stosunku 2:1.

Skróty

HBSS: Zrównoważony roztwór soli Hanka; RPMI-5: Media Instytutu Pamięci Roswell Park; ACK: Chlorek amonu-potas; FCS: płodowa surowica cielęca; Poddany działaniu TC: poddany działaniu hodowli tkankowej

Rozwiązania

Bufor do lizy ACK - (4.15 g NH₄Cl, 0.5 g KHCO₃, 18.6 mg Na₂EDTA, 400 ml H₂O, dostosuj pH do 7.2-7.4 za pomocą 1 N HCl). Filtrować sterylizować przez filtr 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. RPMI-5 - (do 500 ml: 454,5 ml RPMI, 25 ml FCS, 5 ml 200 mM L-glutaminy, 5 ml 1 M HEPES, pH 7,4, 5 ml 100 mM pirogronianu sodu, 5 ml 100x Pen-Strep, 500 ml 50 mM B-ME w PBS).

Wyniki

Po wyizolowaniu pierwotne ludzkie myofibroblasty mogą być hodowane in vitro i wykorzystywane przez ograniczoną liczbę pasaży (do 4. pasażu). Komórki te charakteryzują się pozytywnym wynikiem w kierunku α-aktyny mięśni gładkich oraz vimentyny i negatywnym w kierunku desminy (Rysunek 1A), co jest spójne z cechami myofibroblastów podnabłonkowych jelit^5,7. Wykazują one również charakterystyczną morfologię gwiaździstą (Rysunek 1B). Pierwotne myofibroblasty mogą następnie służyć do ...

Dyskusja

Ogólna technika jest podobna w przypadku użycia okrężnicy myszy lub człowieka. Technika ta może być również stosowana do izolowania miofibroblastów z jelita cienkiego. Szczegółowe informacje dotyczące izolacji miofibroblastów z 1. mysz i 2. Jelito grube człowieka omówiono poniżej.

1. Dwukropek myszy

Irygacja okrężnicy myszy jest ułatwiona przez przymocowanie igły Popper o długości 4 cali i 16 G do jednego końca okrężnicy. Pomaga to również przy cięciu okrężnicy wzdłuż....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nazwa odczynnika	Numer katalogowy	firmy	Komentarze (opcjonalnie)
Dispase I	Invitrogen/GIBCO	#17105-041
Collagenase D	Roche	#1 088 858
4 in, 16 G Igła Popper z końcem	Fisher	#14-825-16K