Ten protokół opisuje metodę tymczasowej przepuszczalności przylegających komórek za pomocą strumienia gazu obojętnego. Technika ta ułatwia przenoszenie materiału genetycznego i biomolekuł do przylegających komórek ssaków poprzez wykorzystanie sił mechanicznych do przerwania błony plazmatycznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przepuszczalność przylegających komórek za pomocą strumienia gazu obojętnego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Istnieją różne techniki transfekcji komórek, które można podzielić na trzy szerokie kategorie: wirusowe, chemiczne i mechaniczne. Protokół ten opisuje mechaniczną metodę czasowej przepuszczalności przylegających komórek za pomocą strumienia gazu obojętnego, który może ułatwić przenoszenie normalnie nieprzepuszczalnych makrocząsteczek do komórek. Uważamy, że ta technika działa poprzez wywieranie sił ścinających na błonę plazmatyczną przylegających komórek, co powoduje tymczasowe tworzenie się mikroporów. Po utworzeniu tych porów komórki są przepuszczalne dla materiału genetycznego i innych biomolekuł. Występujące siły mechaniczne stwarzają ryzyko trwałego uszkodzenia lub oderwania komórek od ich podłoża. Istnieje zatem wąski zakres dynamiki gazów obojętnych, w którym technika ta jest skuteczna. Strumień gazu obojętnego okazał się skuteczny w przenikaniu różnych przylegających linii komórkowych, w tym HeLa, HEK293 i ludzkich komórek śródbłonka aorty brzusznej. Protokół ten jest odpowiedni do przenikania przylegających komórek zarówno in vitro, jak i, jak wykazaliśmy, in vivo, wykazując, że może być wykorzystany do badań i potencjalnie w przyszłych zastosowaniach klinicznych. Ma również tę zaletę, że przenika komórki w sposób ograniczony przestrzennie, co może okazać się cennym narzędziem badawczym.
Wprowadzenie
Wraz z ewolucją biomedycyny i zrozumieniem mechaniki komórkowej, dostarczanie biomolekuł do komórek stało się kluczowe dla wielu dziedzin badań i terapii medycznych. Opracowano różne techniki wprowadzania obcych cząsteczek przez błonę plazmatyczną do cytozolu komórki. Można je ogólnie sklasyfikować jako: techniki wirusowe, chemiczne lub mechaniczne. Techniki wirusowe mogą transfekować materiał genetyczny, taki jak RNA i DNA, za pomocą wektorów wirusowych1. Techniki wirusowe mają zwykle wysoką skuteczność w niektórych liniach komórkowych, jednak mają potencjał do reakcji immunologicznych i zapalnych2. Typowe metody transfekcji chemicznej obejmują wytrącanie fosforanem wapnia3, egzotoksynami bakteryjnymi4 i lipofekcję5. Techniki te okazały się skuteczne; Pojawiają się jednak pewne problemy, takie jak toksyczność komórek i nieswoistość. Ponadto stwierdzono, że techniki takie jak wytrącanie fosforanu wapnia mają skuteczność transfekcji do 70%, ale tylko w niektórych liniach komórkowych, rzadko w komórkach pierwotnych6. Jest to godne uwagi, ponieważ coraz więcej wysiłków badawczych wkłada się w komórki pierwotne, zwłaszcza w przypadku projektowania różnych terapii do użytku klinicznego i badania funkcjonowania DNA.
Czasowe zakłócenie błony komórkowej przez bodźce mechaniczne jest alternatywą dla wprowadzania obcych cząsteczek do komórek. Techniki obejmują: mikroiniekcję cząsteczek7, elektroporację przy użyciu pola elektrycznego w celu przerwania błony8,9, sonoporację za pomocą fal ultradźwiękowych w celu przerwania błony komórkowej10-12, bombardowanie cząstkami, jak wykazano za pomocą "pistoletu genowego", który wystrzeliwuje cząstki związane z genami do komórki13, a ostatnio zastosowanie naprężenia ścinającego płyn, które, jak wykazano, czasowo przenika komórki ssaków14,15. Chociaż metody mechaniczne pozwalają uniknąć niektórych z wyżej wymienionych problemów, zazwyczaj towarzyszy im niższa wydajność oraz bardzo złożone i wyspecjalizowane konfiguracje. Palnik wyładowczy jarzeniowy pod ciśnieniem atmosferycznym (APGD-t) został opracowany w McGill z początkowym celem funkcjonalizacji powierzchni i odłączenia przylegających komórek in vitro16. Nieoczekiwanie odkryto, że żywa/martwa plama, która była używana, była w jakiś sposób wchłaniana przez komórki bez dodawania środka przepuszczalnego. Co więcej, wydawało się, że zdarzało się to tylko w ograniczonych obszarach studni, które przypadkiem pokrywały się ze ścieżką pochodni. Kontynuowano badania nad zdolnościami przepuszczalności APGD-t, a w badaniach kontrolnych stwierdzono, że strumień gazu obojętnego nośnika plazmy bez wzbudzenia był również zdolny do przenikania komórek. Było to sprzeczne z początkową hipotezą, że reaktywne formy wytworzone przez strumień plazmy tymczasowo upośledzają funkcję błony i sugerowało, że po prostu siły mechaniczne były wystarczające, aby spowodować przenikanie komórek. Od tego momentu w naszym laboratorium kontynuowano badania, aby spróbować określić ilościowo i scharakteryzować skuteczność przepuszczalności strumienia gazu obojętnego, a także przyjrzeć się jego zdolnościom transfekcji16.
Dzięki tym badaniom stwierdzono, że mikropory faktycznie tworzą się w błonie plazmatycznej, a pory te mają tendencję do ponownego zamykania się w ciągu około 5 sekund15. Wykazaliśmy użyteczność tej techniki in vitro i in vivo w błonie kosmówkowo-omoczniowej zarodka kurczątka.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Rozwój programu LabView
- Regulator przepływu masowego (MKS M100B Mass-Flo Controller) jest przymocowany do przewodu helu gazowego, aby zapewnić precyzyjne natężenie przepływu gazu. To urządzenie jest sterowane napięciem wejściowym w zakresie od 0 do 5 V. Pętla sterująca w programie LabView określa wymagane napięcie w danym momencie. Połączenie między komputerem a regulatorem przepływu masowego odbywa się za pomocą urządzenia do akwizycji danych (NI USB-6009), a zasilacz 12 V zapewnia zasilanie regulatora przepływu masowego.
- Do sterowania ruchem płytki 6-dołkowej służą dwie prowadnice liniowe pozycjonujące, po jednej dla każdego kierunku. Każdy zespół składa się z zespołu Velmex Unislide serii MA15 sprzężonego z silnikiem krokowym, a oba zespoły są sterowane przez pojedynczy sterownik silnika krokowego Velmex VXM. Sterownik pozwala na ręczne impulsowanie każdego silnika lub akceptuje ciąg zewnętrznych poleceń szeregowych, których kombinacja pozwala na określone wzorce ruchowe. W programie LabView można zaprogramować kilka wzorów, co wymaga od użytkownika podania tylko żądanej prędkości palnika, a także wymiarów ścieżki.
2. Przygotowanie sprzętu
- Otwórz zarówno butlę z helem, jak i reduktor.
- Włącz sterownik silnika.
- Otwórz program LabView i sprawdź wszystkie warunki.
- Upewnij się, że platforma jest wyśrodkowana. Aby to sprawdzić, przyjrzyj się każdemu etapowi silnika i sprawdź, czy każdy wózek nie zbliża się do końca żadnego z nich. Albo program wyśrodkuje kareki, albo wyreguluj ręcznie za pomocą elementów sterujących impulsowaniem z przodu sterownika silnika.
- Jeśli jest to pierwsze uruchomienie w ciągu dnia, zaleca się jednokrotne uruchomienie programu bez komórek, aby upewnić się, że konfiguracja działa poprawnie.
3. Przygotowanie wysokości dyszy kapilarnej strumienia gazu
- Wyjmij kapilarę z uchwytu i wyzeruj pokrętło wysokości.
- Umieść płytkę 6-dołkową na platformie.
- Wymień i opuść kapilarę strumienia gazu na dno studni, aż uderzy w szkiełko nakrywkowe. Zabezpiecz kapilarę w uchwycie.
- Za pomocą pokrętła wysokości podnieś kapilę o 3 mm. Zaznacz tę wysokość na podstawie kapilary.
- Podnieś kapilatę na bezpieczną wysokość, a następnie wyjmij płytkę 6-dołkową.
4. Protokół przenikania komórek
- Hodowla przylegającej linii komórkowej do konfluencji na szklanych szkiełkach nakrywkowych na 6-dołkowej płytce przy użyciu standardowych technik hodowli. W przypadku komórek HeLa należy wysiać płytki 6-dołkowe z 2 x 105 komórek na dołek i inkubować przez 48 godzin przed zabiegiem.
- Przygotuj odpowiednią objętość roztworu zawierającego pożądany wektor. W przypadku hrGFPII-1 stężenie 50 ng/μl w 1x PBS zapewnia silny sygnał fluorescencyjny w komórkach HeLa 24 godziny po transfekcji. Do badań dekstranu zaleca się 80 μg/ml 10 kDa dekstranu fluorescencyjnego zielonego. Odtąd rozwiązanie to będzie określane jako "rozwiązanie wektorowe".
- Wyjmij pożywkę do hodowli komórkowych ze studzienki i spłucz trzy razy 1x PBS.
- Odpipetować 1,370 μl roztworu wektorowego przygotowanego w kroku 4.2 do studzienki. Powinno to skutkować głębokością cieczy około 1,3 mm.
- Umieść studzienkę zawierającą roztwór wektorowy na środku platformy. Opuść dyszę strumienia gazu do wcześniej zaznaczonego poziomu, wskazując wysokość dyszy 3 mm nad suwakiem.
- Ustaw natężenie przepływu helu w programie LabView i wybierz żądany wzór ruchu, który ma być używany. Wybierz "Uruchom", gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia protokołu przepuszczalności. Nastąpi początkowy okres opóźnienia, podczas którego regulator przepływu masowego przygotowuje się do zapewnienia niezbędnego natężenia przepływu. Po osiągnięciu odpowiedniego natężenia przepływu program LabView aktywuje silniki krokowe, aby przesunąć studnię w pożądanym wzorcu przepuszczalności. Po zatrzymaniu platformy odczekaj około 30 sekund i usuń roztwór wektorowy. Uwaga: Optymalna przepuszczalność zachodzi w pobliżu ciśnienia dynamicznego od 100 do 200 Pa na wylocie dyszy, w zależności od średnicy kapilary.
- Umyj dobrze trzy razy za pomocą 1x PBS.
- Dobrze wypełnij świeżymi pożywkami hodowlanymi.
- Powtórz kroki 4.3 - 4.6 dla żądanej liczby eksperymentów. Uwaga: Należy pamiętać o dołączeniu próbek kontrolnych, które składają się z studzienek napełnianych roztworem wektorowym bez przepływania po nich strumienia gazu. Pozostawić roztwór w studzienkach kontrolnych na około 1 minutę, a następnie przejść do kroków 4.5 i 4.6.
- W przypadku przeprowadzania eksperymentu transfekcji hrGFP, należy umieścić 6-dołkową płytkę w inkubatorze na 24 godziny, aby umożliwić transkrypcję transfekowanego materiału przez komórki. Jeśli przeprowadzasz eksperyment przepuszczalności dekstranu, umieść 6-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze na 15 minut.
5. Obrazowanie komórek
- W razie potrzeby, bezpośrednio przed obrazowaniem, należy przeciwbarwić odpowiednią żywą/martwą barwą, aby ocenić śmierć komórki.
- Zobrazuj komórki za pomocą odpowiedniego mikroskopu, aby zbadać skuteczność transfekcji/przepuszczalności.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Permeabilizacja komórek HeLa za pomocą zielonego fluorescencyjnego dekstranu 10 kDa przy użyciu strumienia gazu helu z kapilarą o średnicy wewnętrznej 0,86 mm przedstawiona jest na Rysunku 1. Komórki zostały poddane barwieniu kontrastowemu natychmiast po permeabilizacji przy użyciu roztworu EthD-1 w stężeniu 2 μl/ml (LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit) w celu wizualizacji śmierci komórkowej. Bezpośrednio po barwieniu kontrastowym szkiełka podstawowe zostały zamontowane i poddane obrazowaniu. Rysunek te...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Permeabilizacja strumieniem gazu obojętnego jest przydatną techniką transfekcji komórek adherentnych. Zapewnia możliwość przenoszenia biomolekuł do komórek za pomocą sił mechanicznych, co eliminuje konieczność stosowania potencjalnie szkodliwych substancji chemicznych lub wektorów wirusowych. Technika ta może potencjalnie zapewnić naukowcom i klinicystom skuteczny i stosunkowo prosty sposób na precyzyjną transfekcję komórek. Selektywność przenikania jest również wyjątkowa, co pozwala naukowcom leczyć tylko niektóre komór...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować następującym źródłom finansowania: Kanadyjskim Instytutom Badań nad Zdrowiem (CIHR), Radzie Badań nad Naukami Przyrodniczymi i Inżynierią (NSERC).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Zielone białko fluorescencyjne do eksperymentów transfekcyjnych na komórkach HeLa |
| Dekstran, AlexaFluor 488; 10 000 MW, Anionowy, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dekstran do eksperymentów przepuszczalności |
| ŻYWY/MARTWY Zestaw do żywotności/cytotoksyczności | Life Technologies Inc. | L3224 | do barwienia przeciwstawnego komórek ssaków |
| Odczynnik Antibrede Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | do montażu szkiełek podczas obrazowania |
| Helium o ultra wysokiej czystości | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ Pożywka o wysokiej zawartości glukozy - 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | dla komórek HeLa |
| Surowica bydlęca | płodu Invitrogen | 26140079 | Dla pożywek |
| DMEM Penicylina-Streptomycyna, płyn | Invitrogen | 15140-122 | Do pożywek DMEM |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1x | Wyprodukowano w laboratorium | ||
| Tabela 1. Lista wymaganych odczynników | |||
| 6-dołkowe przezroczyste mikropłytki poddane działaniu TC | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Szkiełka nakrywkowe | Fisher | 12-542B | |
| Szklane kapilary | World Precision Instruments | WPI Identyfikator informacji o rozmiarach | |
| (mm): 1, 0,86, 0,68, 0,5 Zamówienie #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Kontroler Mass-Flo | MKS | M100B01314CS1BV | Regulator przepływu masowego, seria M100B, wymaga zewnętrznego zasilacza 12 V |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| Zespół UniSlide z silnikiem krokowym i kontrolerem | zespoły UniSlide serii MA15 Velmex, wyposażone w silniki krokowe Vexta 1,8 stopnia dostarczone przez firmę Velmex i sterowane przez sterownik silnika krokowego VXM | ||
| Tabela 2. Lista wymaganego wyposażenia |
Bibliografia
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101(2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
