Zoptymalizowane protokoły zarządzania szczepem Mycobacterium leprae: konserwacja i konserwacja zamrożonych stad u nagich myszy Athymic

Podsumowanie

Mycobacterium leprae, czynnik wywołujący trąd, nie rośnie in vitro. Opisujemy łatwy do naśladowania protokół przygotowania zawiesiny bakteryjnej, aby zapewnić utrzymanie dużych ilości M. leprae do różnych zastosowań. Szczegółowo opisano protokoły rozmnażania przez inokulację opuszki myszy na puszystej podeszwie, ocenę żywotności, zamrażanie i rozmrażanie stada prątków.

Streszczenie

Trąd, wywołany przez Mycobacterium leprae, jest ważną chorobą zakaźną, która nadal występuje endemicznie w wielu krajach na całym świecie, w tym w Brazylii. Obecnie nie są znane żadne metody hodowli M. leprae in vitro, co stanowi poważną przeszkodę w badaniach nad tym patogenem w laboratorium. Dlatego utrzymanie i wzrost szczepów M. leprae zaleca się przeprowadzać u atymicznych myszy nagich (NU-Foxn1 ^nu). Warunki laboratoryjne do wykorzystania myszy są łatwo dostępne, łatwe do wykonania i pozwalają na standaryzację i opracowanie protokołów w celu uzyskania powtarzalnych wyników. W niniejszym raporcie opisujemy prosty protokół oczyszczania z pałeczek z nagich opuszków myszy za pomocą trypsyny, który daje zawiesinę z minimalną ilością resztek komórkowych i wysokim wskaźnikiem żywotności bakterii, określonym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Zademonstrowano również modyfikację standardowej metody liczenia pałeczek za pomocą barwienia Ziehla-Neelsena i mikroskopii świetlnej. Dodatkowo opisujemy protokół zamrażania i rozmrażania zapasów pałeczek jako alternatywny protokół utrzymania i przechowywania szczepów M. leprae.

Wprowadzenie

Trąd, choroba wywoływana przez Mycobacterium leprae, jest ważnym problemem zdrowia publicznego w wielu krajach na całym świecie^1,2. Pomimo tego, że jest znana jako choroba zakaźna, która atakuje zarówno skórę, jak i nerwy obwodowe, nadal istnieje kilka luk w wiedzy na temat mechanizmów zaangażowanych w złożoną immunopatogenezę choroby.

Wśród trudnych cech M. leprae, które utrudniają jego badanie, są jego niezdolność do wzrostu w sztucznych pożywkach hodowlanych i stosunkowo długi czas podwojenia (około 14 dni)^3,4. Większość procedur eksperymentalnych z użyciem M. leprae opiera się na prątkach oczyszczonych ze zmian skórnych pacjentów z trądem lub z eksperymentalnych modeli zwierzęcych, takich jak pancerniki i kilka szczepów myszy^5,6.

Przez wiele lat badacze polegali na oczyszczaniu M. leprae ze zmian skórnych u pacjentów z trądem wielopałeczkowym do wykorzystania w procedurach eksperymentalnych. Próbowano stworzyć kilka warunków laboratoryjnych dla hodowli in vitro lub utrzymania żywego M. leprae, ale do tej pory modele zwierzęce okazały się najbardziej odpowiednie do celów badawczych. W latach sześćdziesiątych i siedemdziesiątych XX wieku naukowcy zaczęli wykorzystywać myszy i pancerniki do wykrywania i oceny żywotności M. leprae, monitorowania wzrostu bakterii w odpowiedzi na leki anty-M. leprae oraz we wzroście i utrzymaniu szczepów prątków^2,4.

Modele zwierzęce mają pewne ograniczenia, szczególnie u pancerników i naczelnych, w tym kwestie etyczne, koszty utrzymania, specjalną infrastrukturę potrzebną do utrzymania zwierząt oraz słabą powtarzalność wyników i końcowych plonów. Obecnie myszy są preferowanym zwierzęciem modelowym do badań nad trądem. Warunki laboratoryjne do wykorzystania myszy są łatwo dostępne, łatwe do wykonania i pozwalają na ustandaryzowane protokoły^7,8,9. Nagie myszy były wykorzystywane do utrzymania szczepów M. leprae, ponieważ nawet przy niskim obciążeniu żywotnymi pałeczkami, odpowiedź immunologiczna z niedoborem limfocytów T prowadzi do wybujałego tworzenia ziarniniaków i dobrego namnażania się bakterów. W ten sposób ten zwierzęcy model zyskał szeroką akceptację w społeczności badawczej zajmującej się trądem.

W niniejszym raporcie opisujemy prosty protokół enzymatycznego oczyszczania pałeczek z opuszków nagich myszy, przeznaczony do przygotowania zawiesiny M. leprae z minimalną ilością resztek komórkowych i o wysokim wskaźniku żywotności bakterii. Żywotność określa się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, którą można szybko wykonać w laboratorium. Pokazujemy również modyfikację standardowej metody liczenia pałeczek poprzez barwienie na zimno metodą Ziehl-Neelsen i mikroskopię świetlną. Dodatkowo przedstawiamy alternatywny protokół utrzymania i przechowywania szczepów M. leprae, pozwalający na zamrażanie i rozmrażanie zapasów bakteryjnych.

Protokół

1. Przygotowanie zawiesiny Mycobacterium leprae

1. Przed eutanazją atymimiczną nagą mysz (NU-Foxn1^nu) przygotuj roztwór trypsyny i pożywkę hodowlaną (Protokół odczynników - Protokoły 1, 2 i 3). Eutanazja nagich myszy 4-5 miesięcy po zaszczepieniu M. leprae zgodnie z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt: 2013 wydanie¹⁰ (eksperymenty i wykorzystanie zdjęć zwierząt zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Faculdade de Odontologia de Bauru, USP). Wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego używanej do obchodzenia się ze zwierzętami wyczyść całą mysz 70% alkoholem etanolowym.
2. Przytrzymaj tylną łapę za pomocą kleszczy hemostatycznych dystalnie do stawu stępu. Odetnij łapę nożyczkami poniżej kleszczy i zanurz łapę w 2% jodu na 20 minut. Następnie powtórz procedurę dla drugiej tylnej łapy.
3. Przenieś łapy do czystej szafy bezpieczeństwa biologicznego w celu dalszej pracy. Wyjmij łapy z 2% jodu, osusz je sterylną gazą, a następnie zbierz dwie poduszki stóp za pomocą ostrza skalpela numer 22 lub 23, usuwając wszystkie tkanki miękkie (skórę właściwą, naskórek, ścięgna i nerwy) w pobliżu kości. Usuń kości śródstopia oraz 1. i 5. paliczki. Umieść materiał na sterylnej szalce Petriego i usuń naskórek, zeskrobując go ostrzem skalpela. Pokrój tkankę na małe kawałki nożyczkami i przenieś je do rurki o okrągłym dnie. Zważ tkankę i dodaj 1 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS). Trzymaj probówkę na lodzie, aby uniknąć rozgrzania próbki.
4. Dodać kolejny 1 ml HBSS i homogenizować próbkę za pomocą homogenizatora tkankowego.
   1. Pierwszy cykl homogenizacji: 3 impulsy po 15 sekund przy prędkości 4 (14 450 obr./min).
   2. Przenieść sklarowany osad do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml, przepuszczając go przez sitko do komórek w celu usunięcia pozostałych zanieczyszczeń. Pozwól, aby roztwór przeszedł grawitacyjnie.
   3. Dodać dodatkowe 2 ml HBSS i powtórzyć cykl homogenizacji (sekcja 1.4.1) i ponownie przepuścić próbki przez sitko do komórek.
   4. Opłucz sitko, dodając HBSS, aby doprowadzić objętość do 9 ml. Wyrzuć sitko do komórek.
5. Rozmrozić podwielokrotność 0,5% roztworu trypsyny. Dodać 1 ml trypsyny do 9 ml zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 0,05% trypsyny. Wyrzuć pozostałą rozmrożoną trypsynę. Inkubować przez 60 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po inkubacji zwiększyć objętość do 40 ml, dodając sterylną sól fizjologiczną w celu rozcieńczenia trypsyny.
6. Wirować przy 1 700 x g przez 30 minut w temperaturze 4°C.
7. Odrzucić supernatant, ostrożnie odwracając probówkę. Zawiesić osad, stukając w probówkę, a następnie dodać 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Przenieść zawiesinę do nowej stożkowej rurki mierzącej końcową objętość zawiesiny (w celu obliczenia wydajności/gram tkanki).
8. Homogenizować zawiesinę bakcylarną za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą 26 G, przenosząc zawiesinę do nowej probówki.
9. Przeprowadzić kontrolę mikrobiologiczną zawiesiny, umieszczając 2 krople (50 ul) w każdej pożywce: 7H9 i pożywce Lowensteina-Jensena i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 dni, w celu wykrycia skażających prątków. Podobnie, należy zaszczepić pożywkę do infuzji mózgowo-sercowej (BHI) i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, w celu wykrycia skażających bakterii tlenowych.
10. Podwielokrotność zawiesiny przelać do probówek do barwienia: 35 μl do barwienia na zimno metodą Ziehl-Neelsen (protokół 2) i 200 μl do oznaczania żywotności (protokół 3).
11. Po barwieniu metodą Ziehl-Neelsen (ZN) obliczyć liczbę pałeczek kwasoodpornych/ml (AFB/ml). W przypadku inokulacji u nagich myszy należy przygotować zawiesinę 1 x 10⁸ AFB/ml; upewnić się, że objętość jest wystarczająca do zaszczepienia 30 μl/opuszkę na stopę/zwierzę (Protokół 5) i utrzymywać zawiesinę w niskiej temperaturze do momentu zaszczepienia. Do zamrożenia należy przygotować zawiesinę 1 x 10⁷ AFB/ml (protokół 4).

2. Barwienie na zimno Ziehl-Neelsen

1. Przed rozpoczęciem barwienia należy przygotować roztwór surowicy/fenolu i roztwory barwiące ZN (Protokół odczynników - Protokoły 4 i 5). Narysuj trzy koła (średnica wewnętrzna 10 mm) na trzech szklanych szkiełkach za pomocą pisaka immunohistochemicznego. Zidentyfikuj szkiełka: (1) normalne lub nierozcieńczone, (2) 1:10 i (3) 1:100 za pomocą ołówka numer 2 (Uwaga: część grafitu blaknie po barwieniu ZEN).
2. Rozcieńczyć zawiesinę bakcylarną (etap 1.10) do rozcieńczeń seryjnych w stosunku 1:10 i 1:100, tj. dodać 5 μl nierozcieńczonej zawiesiny i 45 μl soli fizjologicznej, następnie pobrać 5 μl roztworu 1:10 i dodać 45 μl soli fizjologicznej.
3. Dodać 5 μl roztworu surowicy/fenolu i 10 μl zawiesiny bakcylarnej na okrąg. Homogenizuj i rozprowadź równomiernie w obszarze koła za pomocą uchwytu jednorazowej pętli. Poczekaj, aż zawiesina wyschnie na wypoziomowanym stole.
4. Po wyschnięciu utrwal rozmaz, przesuwając szkiełko 3 razy po niebieskim płomieniu palnika Bunsena (łącznie około 20 sekund)¹¹.
5. W celu barwienia pokryć całą powierzchnię szkiełka przefiltrowaną karbofuchzyną Ziehl-Neelsen (około 5 ml) przez 20 min.
6. Opłucz szkiełko pod bieżącą wodą (powolny przepływ).
7. Przykryj szkiełko 10% kwaśnym roztworem alkoholu na około 20 sekund.
8. Ponownie umyj szkiełko pod bieżącą wodą.
9. Przykryj szkiełko roztworem błękitu metylenowego na 5 minut.
10. Opłucz szkiełko pod bieżącą wodą i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
11. Policz 20 pól/okrąg (łącznie 60 pól/slajd) za pomocą obiektywu zanurzeniowego 100X. Obliczanie prątków kwasoodpornych/ml (AFB/ml) przeprowadza się w następujący sposób, zgodnie z opisem w Technikach laboratoryjnych dla trądu¹²:
    AFB/pole = całkowita liczba pałeczek znalezionych w 3 okręgach (60 pól) podzielona przez 60,
    AFB/ml = AFB/pole x stała (pole koła x 100 podzielone przez obszar apertury soczewki obiektywu), a w przypadku liczenia rozcieńczonej zawiesiny pomnóż liczbę AFB/ml przez współczynnik rozcieńczenia (10 lub 100).

3. Określenie żywotności

1. Przed rozpoczęciem należy przygotować autoklawowaną zawiesinę M. leprae (Protokół odczynników - Protokół 7). Użyć odpowiedniego zestawu (patrz tabela odczynników i wyposażenia) do jakościowego oznaczania żywotności M. leprae w zawiesinie. Rozcieńczyć roztwory w następujący sposób (wszystkie procedury należy wykonywać przy słabym świetle): rozcieńczyć roztwór A przez współczynnik 10 w soli fizjologicznej (1 μl bulionu plus 9 μl soli fizjologicznej), rozcieńczyć roztwór B 20 przez współczynnik soli fizjologicznej (1 μl bulionu plus 19 μl soli fizjologicznej).
2. Dodać 3,6 μl rozcieńczonego roztworu A i 6 μl rozcieńczonego roztworu B do 200 μl zawiesiny bakterii, która ma być badana (krok 1.10). Uprzednio autoklawowana zawiesina M. leprae jest rutynowo stosowana jako kontrola ujemna do barwienia żywotności.
3. Inkubować zawiesiny przez 15 minut, w temperaturze pokojowej w ciemności.
4. Odwirować probówkę o stężeniu 10 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 μl 10% glicerolu. Nanieść 8 μl na powierzchnię czystego szkiełka podstawowego i przykryć go małym szkiełkiem nakrywkowym. Przeanalizować szkiełko za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, zawierającego odpowiednie filtry (patrz zalecenia dotyczące sond molekularnych). Oceń wyniki, porównując barwienie Syto 9 (Sy) z barwieniem jodkiem propidyny (PI).
   Uwaga: Barwnik Sy wnika w 100% zarówno w martwe, jak i żywe bakterie, a barwnik PI wnika tylko w bakterie z uszkodzonymi błonami. Autoklawizowana zawiesina (kontrola ujemna) może tworzyć grudki bakterii ze względu na obecność resztek komórkowych. Skala półilościowa stosowana do oceny żywych/martwych waha się od 0 do 2+; 0 oznacza, że mniej niż 30% komórek jest dodatnich pod kątem barwienia PI; 1+ oznacza, że od 30 do 50% komórek jest dodatnich pod kątem barwienia PI; 2+ oznacza, że ponad 50% komórek jest dodatnich pod kątem barwienia PI. Wynik 0 jest uważany za najbardziej odpowiedni do użycia.

4. Zamrażanie/rozmrażanie M. leprae Zawiesina

1. Przed rozpoczęciem należy przygotować pożywkę zamrażającą (Protokół odczynników - Protokół 6). Aby zamrozić, wykonaj czynności opisane poniżej:
   1. Dodać 150 μl zawiesiny zawierającej 1 x 10⁷ AFB/ml do sterylnego kriowialu wraz z 1 ml pożywki do zamrażania.
   2. Umieścić kriowial w pojemniku do zamrażania i przechowywać pojemnik w temperaturze -80 °C przez 24 godziny.
   3. Przenieść zamrożoną fiolkę do pojemnika do przechowywania i przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. Aby rozmrozić, wykonaj czynności opisane poniżej:
   1. Usunąć kriowial z zamrożoną zawiesiną z temperatury -80 °C i umieścić go w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby rozpocząć rozmrażanie zawiesiny.
   2. Wlać zawiesinę do probówki zawierającej 20 ml jałowego roztworu soli fizjologicznej. Zawiesinę delikatnie wymieszać aż do zakończenia rozmrażania.
   3. Odwirować zawiesinę przez 30 minut, w sile 1 700 x g, w temperaturze 4 °C.
   4. Wyrzuć supernatant i dodaj tyle sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby osiągnąć pożądaną objętość. Homogenizować zawiesinę, przepuszczając ją przez strzykawkę (krok 1.8).
   5. W przypadku barwienia ZEN, określania żywotności i inokulacji należy postępować zgodnie z protokołami 2, 3 i 5.

5. Szczepienie myszy

1. Do tej procedury potrzebne są dwie osoby, jedna do unieruchomienia myszy, a druga do podania inokulum. Ze zwierzęciem, które ma zostać zaszczepione, należy obchodzić się zgodnie z wytycznymi i przepisami etycznymi, a wszystkie procedury muszą zostać zatwierdzone przez instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania. Powstrzymaj nagą mysz za kark z łapami skierowanymi do góry.
2. Homogenizować zawiesinę, przepuszczając ją przez igłę o stężeniu 26 G. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml odessać wystarczającą ilość zawiesiny bakcylarnej, aby zaszczepić dwie opuszki stóp (30 μl/opuszkę stopy).
3. Chwyć tylną łapę, przed wstrzyknięciem oczyść opuszkę stopy 70% alkoholem etanolowym i wprowadź igłę śródskórnie ze skosem igły skierowanym do góry, od bliższej do dalszej strony opuszki stopy. Wstrzyknąć 30 μl zawiesiny. Zastrzyki z opuszki stopy można wykonywać u znieczulonych myszy.
4. Odczekać 5 sekund przed wyjęciem igły ze skóry, aby uniknąć refluksu inokulum. Myszy powinny być trzymane na miękkim ściółce po zaszczepieniu, a poruszanie się i oznaki samookaleczenia powinny być monitorowane.

Wyniki

Powodzenie protokołu można ocenić na trzy sposoby. Po pierwsze, ocenę jakości inokulum określa się na podstawie ilości zanieczyszczeń komórkowych oraz wynikowego procentu żywych prątków w końcowej zawiesinie (patrz Protokół 3). Jak pokazano na rycinach 1 i 2, końcowa zawiesina prątków zawierała bardzo mało zanieczyszczeń komórkowych i charakteryzowała się wysoką żywotnością (wynik 0+); należy zauważyć, że większość prątków została zabarwiona zielonym barwnikiem fluorescencyjnym Syto 9 (barwnik przenika przez 100% bakterii martwych i żywych, rycina 1), a tylko nieliczne prątki zostały zabarwione czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym PI (barwnik przenika tylko przez bakterie z uszkodzonymi błonami, rycina 2).

Rycina 1. Barwienie zawiesiny M. leprae barwnikiem Syto 9. Zielona fluorescencja wskazuje obecność żywych i martwych M. leprae. 400X.

Rycina 2. Barwienie PI zawiesiny M. leprae. Czerwona fluorescencja wskazująca na niewielką liczbę martwych M. leprae. Powiększenie 400X.

Po drugie, inokulum o wysokiej żywotności wpłynie na namnażanie się prątków w stopach zwierząt 4-5 miesięcy po inokulacji, co doprowadzi do rozwoju wyraźnych zmian makroskopowych, jak pokazano w filmie (Protokół 1). Trzecim sposobem oceny skuteczności protokołu jest analiza przeżywalności i namnażania się AFB w stopach myszy inokulowanych prątkami, które były zamrożone przez różne okresy czasu (patrz Protokół 4).

Eksperyment (zwierzęcy)	Liczba AFB/ml zamrożona w dniu 0	Wskaźnik żywotności/dzień 0	Okres mrożenia (dni)	Liczba zaszczepionych prątków kwasoodpornych (AFB) po zamrożeniu	Wskaźnik żywotności po zamrażaniu	Liczba odzyskanych AFB/ml po 7 miesiącach
1 (1)	1,0 x 107	0+	60	1,7 x 105	1+	2,3 x 108
1 (2)	1,0 x 107	0+	60	1,7 x 105	1+	3,8 x 107
1 (3)	1,0 x 107	0+	60	1,7 x 105	1+	8,5 x 107
1 (4)	1,0 x 107	0+	60	1,7 x 105	1+	4,6 x 107
2 (1)	1,0 x 107	0+	15	4,2 x 105	1+	1,7 x 107
2 (2)	1,0 x 107	0+	15	4,2 x 105	1+	4,8 x 106
2 (3)	1,0 x 107	0+	15	4,2 x 105	1+	8,6 x 106
3 (1)	1,0 x 107	0+	15	1,7 x 105	1+	1,2 x 107
3 (2)	1,0 x 107	0+	15	1,7 x 105	1+	1,8 x 107
3 (3)	1,0 x 107	0+	15	1,7 x 105	1+	1,8 x 107
3 (4)	1,0 x 107	0+	15	1,7 x 105	1+	2,6 x 107
3 (5)	1,0 x 107	0+	15	1,7 x 105	1+	3,7 x 106

Tabela 1. Wyniki namnażania M. leprae z wykorzystaniem zawiesin po zamrażaniu.

Tabela 1 przedstawia wyniki wzrostu M. leprae z wykorzystaniem zawiesin po zamrożeniu. Wynik żywotności zawiesin po rozmrożeniu wyniósł 1+. Protokół zamrażania przeprowadzono w trzech niezależnych eksperymentach, aby przetestować różne okresy zamrażania. W obu eksperymentach z inokulatem zamrożonym na 15 lub 60 dni wynik był podobny; namnażanie po zamrożeniu doprowadziło do 10–1000-krotnego wzrostu liczby AFB odzyskanych z każdej poduszki stopy po 7 miesiącach od inokulacji (Tabela 1). Zatem zamrożenie zawiesin M. leprae w medium 7H9 uzupełnionym o OADC (kwas oleinowy-albumina-dekstroza-katalaza) pozwoliło na zachowanie żywotności.

Użyto trzech inokulum do oceny namnażania M. leprae po dwóch różnych okresach mrożenia (15 i 60 dni). Po 7 miesiącach prątki odzyskano z poduszek stóp inokulowanych myszy i policzono po barwieniu metodą Ziehla-Neelsena. Półilościowa skala żywotności: 0 oznacza brak do 30% komórek barwionych PI; 1+ oznacza od 30-50% komórek barwionych PI; 2+ oznacza powyżej 50% komórek barwionych PI. AFB: prątki kwasoodporne.

Dyskusja

Bardzo potrzebny jest szczegółowy opis dobrze zilustrowanego, skutecznego protokołu rozmnażania M. leprae . Nasze badanie pokazuje, że protokół przygotowania inokulum przez filtrację i trawienie trypsyny pozwala na uzyskanie inokulum z bardzo małą ilością zanieczyszczeń komórkowych i z wysoką żywotnością pałeczek (wynik 0+). Wodorotlenek sodu został użyty do dezagregacji tkanki w celu oczyszczenia z pałeczek⁶. Badania przeprowadzone w naszym laboratorium z użyciem wodorotlenku sodu do oczyszczania M. leprae doprowadziły do powstania grudek prątków, co utrudniało homogenizację zawiesiny w celu określenia żywotności i inokulacji zwierząt (dane nie pokazane).

Potencjalne problemy napotkane podczas przygotowania inokulum przez filtrację i trawienie trypsyny obejmują dużą ilość resztek komórkowych i zanieczyszczenie inokulum czynnikami bakteryjnymi lub grzybiczymi. W przypadku, gdy po oczyszczeniu obserwuje się duże ilości resztek komórkowych, albo trypsyna nie jest już aktywna, albo występuje nadmierna ilość materiału biologicznego. Należy ocenić aktywność enzymatyczną roztworu podstawowego trypsyny. W przypadku podejrzenia nadmiernej ilości wyjściowego materiału biologicznego, materiał ten należy podzielić na podwielokrotności, a protokół należy przeprowadzić w oddzielnych partiach. Aby uniknąć zanieczyszczenia inokulum czynnikami bakteryjnymi lub grzybiczymi, należy zachować ostrożność w przetwarzaniu materiału w warunkach aseptycznych. W przypadku wykrycia skażenia grzybiczego i/lub bakteryjnego zawiesinę należy wyrzucić.

Ograniczeniem naszego protokołu jest subiektywność oceny żywotności przy użyciu opisanej metody półilościowej. Rentowność oceniana półilościowo jest bardziej praktyczna, choć mniej precyzyjna niż opublikowana metoda^ilościowa6. Ocena żywotności 0+ i 1+ jest zadowalająca dla utrzymania rozmnażania i zamrażania M. leprae. Lahiri i wsp. wykazały już, że nagie myszy zaszczepione 80-90% żywotnym inokulum dają opuszki stóp odpowiednie do zbioru (pałeczki o wysokiej żywotności) po 4-5 miesiącach od zaszczepienia. Dlatego wczesna infekcja (około 4 miesięcy) jest najlepszym czasem zbiorów. W przypadku zbioru zamrożonych inokulantów, myszy w niniejszym protokole były utrzymywane w stanie zaszczepionym przez dłuższy okres (7 miesięcy), aby zagwarantować krzywe wzrostu. Kluczowym krokiem w celu zapewnienia odpowiedniej żywotności jest stosowanie świeżych zawiesin pałeczek, najlepiej w ciągu 24 godzin po pobraniu materiału biologicznego od gospodarza i przetworzeniu. Ponadto jakość odczynników, świeżo przygotowanej rozcieńczonej trypsyny i roztworów barwiących żywotność, jest niezbędna do zagwarantowania powtarzalnych wyników.

Innym ograniczeniem tego protokołu jest to, że ostateczna zawiesina M. leprae nie jest wolna od DNA gospodarza, RNA, białka itp. Dlatego należy dodać inne etapy oczyszczania, aby uzyskać zawiesinę M. leprae wolną od składników komórki gospodarza.

Opisano metodę utrzymywania żywotnych pałeczek poprzez zamrażanie całych próbek tkanek zmian chorobowych M. leprae ⁹. Jednak badanie przeprowadzone przez Portaelsa i wsp. wykazały znaczną utratę żywotności, wynoszącą od 65 do 97% po zamrożeniu i rozmrożeniu próbek tkanek zakażonych M. leprae uzyskanych z pancernika⁹. Nasz protokół wykazał, że wskaźnik żywotności obserwowany w zawiesinach M. leprae po zamrożeniu i rozmrożeniu spadł w porównaniu z podwielokrotnością, która nie została zamrożona (Tabela 1). Rzeczywiście, zamrożenie M. leprae Zawiesina w pożywce do zamrażania dawała żywotność w zakresie 50-70%, przy wyniku żywotności 1+, podczas gdy wynik żywotności 0+ uzyskano w zawiesinie niezamrożonej. Niemniej jednak namnażanie M. leprae było zadowalające po 7 miesiącach od inokulacji nagich myszy (Tabela 1). Inokulacja nagich myszy odtworzonymi próbkami utrzymywanymi w stanie zamrożonym przez 60 dni spowodowała średnio 100-krotny wzrost liczby pałeczek w porównaniu z początkowym inokulum. Wydaje się, że zamrożenie zawiesiny M. leprae w pożywkach do zamrażania, zamiast w zakażonych próbkach tkanek, jest bardziej efektywne. Krytycznym krokiem naszego protokołu jest powolne zamrażanie AFB w pojemniku do zamrażania, niezbędne do utrzymania żywotności pałeczek, jak wykazano przez Colstona i Hilsona⁸. W przyszłości zostaną przeprowadzone eksperymenty w celu oceny żywotności pałeczek po dłuższych okresach zamrażania.

Podsumowując, ponieważ M. leprae nie rośnie in vitro, nasz protokół pozwala na szybką i łatwą alternatywę dla utrzymania żywotnego inokulum, a udany etap zamrażania umożliwia utrzymanie szczepów bez ciągłego przenikania u zwierząt, umożliwiając w ten sposób utworzenie banku zdefiniowanych szczepów.

Ta sekcja zawiera instrukcje dotyczące przygotowania odczynników do wykonania tego protokołu.

1. Trypsyna

Trypsyna	0,5 grama
Woda destylowana	do 100 ml

Filtruj sterylizację. Przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Godzina 7H9

Baza bulionowa 7H9	4,7 gr
40% zapasów glicerolu	Pojemność 5 ml
Woda destylowana	do 900 ml

Wymieszaj bazę z wodą, a następnie dodaj glicerol, mieszając. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 20 minut w celu sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

3. Napar z mózgu i serca (BHI)

BHI powiedział:	37 gramów
Woda destylowana	do 1 000 ml

Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 minut w celu sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

4. Surowica fenolowa

4.1) 5% fenolu

Fenol	Pojemność 5 ml
Woda destylowana	do 100 ml

4.2) Fenol w surowicy

płodowa surowica bydlęca	Pojemność 2 ml
5% fenolu	Pojemność 98 ml

Przechowywać w temperaturze 4 °C.

5. Roztwory do barwienia na zimno Ziehl-Neelsen

5.1) KarboFuchsyna

Fuchsin powiedział:	1 gramów
Kryształy fenolu stopione do temperatury 60 °C	Pojemność 5 ml
Czysty alkohol etylowy	Pojemność 10 ml
Woda destylowana	do 100 ml

Filtruj przed każdym użyciem.

5.2) Niebieska baza metylenowa

Błękit metylenowy	3 gramów
95% alkoholu etylowego	do 200 ml

5.3) Kwas alkoholowy

70% alkoholu	Pojemność 990 ml
kwas chloridowy	Pojemność 10 ml

6. Podłoże do zamrażania:

Organizacja OADC (Organizacja Zarządzania T	Pojemność 10 ml
Glicerol	Pojemność 20 ml
7H9 średni	do 100 ml

Autoklaw glicerolu przed użyciem i sterylizuj OADC przez filtrację.

7. Autoklawizowana zawiesina M. leprae

Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 20 min. Przechowywać w temperaturze -20 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do żywotności bakterii BacLight	Invitrogen; Sondy molekularne	L7007
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)	Sigma	H9269
Cryo 1 ° C Pojemnik do zamrażania	Nalgene	5100001
Lowenstein-Jensen medium	LB Laborclin	901122
Saline	TEK Nova Inc	S5812
Pen	Dako	S2002
Probówka wirówkowa 50 ml/stożkowa podstawa	TPP	91050
Sitko do komórek  - 40 &mikro; m Nylon	BD Falcon	352340
Trypsyna	Sigma	T-7409
Baza bulionowa Middlebrook 7H9	Sigma-Aldrich	M0178 Fluka
Glicerol	Gibco BRL	15514011
Napar z mózgu (BHI)	Oxoid LTDA	CM1135
Fuchsin	Merck Millipore	1159370025
Fenol	Invitrogen	15509037
Alkohol etylowy	Merck Millipore	EX02764
Kwas klorydryczny	Merck	1131349010
BBL Middlebrook OADC (kwas oleinowy-albumina-dekstroza-katalaza)	Becton Dickinson	211886
Surowica bydlęca	płodu Gibco; LifeTechnologies	26140079