Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka chemiczna lipidu A z bakterii Gram-ujemnych

DOI:

10.3791/50623

⸱

16 września 2013

 ,  ,  , 
1Section of Molecular Genetics and Microbiology, The University of Texas at Austin, 2Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Texas at Austin, 3The Institute of Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja i charakterystyka domeny lipidów A lipopolisacharydu (LPS) od bakterii Gram-ujemnych dostarcza wglądu w oparte na powierzchni komórek mechanizmy oporności na antybiotyki, przeżywalność i sprawność bakterii, oraz jak chemicznie zróżnicowane gatunki molekularne lipidów A różnie modulują wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipopolisacharyd (LPS) to główna cząsteczka bakterii Gram-ujemnych na powierzchni komórki, osadzona na zewnętrznej warstwie błony zewnętrznej. LPS można podzielić na trzy domeny: dystalny O-polisacharyd, oligosacharyd rdzeniowy i domenę lipidową A składającą się z gatunku cząsteczkowego lipidu A i reszt kwasu 3-deoksy-D-manno-oct-2-ulosonowego (Kdo). Domena lipidu A jest jedynym składnikiem niezbędnym do przetrwania komórek bakteryjnych. Po syntezie lipid A jest modyfikowany chemicznie w odpowiedzi na stresy środowiskowe, takie jak pH lub temperatura, w celu promowania odporności na związki antybiotykowe i unikania rozpoznania przez mediatory wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Poniższy protokół szczegółowo opisuje izolację lipidu A na małą i dużą skalę od bakterii Gram-ujemnych. Wyizolowany materiał jest następnie chemicznie charakteryzowany za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) lub spektrometrii mas (MS). Oprócz matrycowo wspomaganej matrycowo desorpcji/jonizacji czasu przelotu (MALDI-TOF) MS, opisujemy również tandemowe protokoły MS do analizy form molekularnych lipidów A przy użyciu jonizacji elektronrozpylającej (ESI) sprzężonej z dysocjacją wywołaną zderzeniem (CID) i nowo zastosowanymi metodami fotodysocjacji ultrafioletowej (UVPD). Nasze protokoły MS pozwalają na jednoznaczne określenie struktury chemicznej, co ma zasadnicze znaczenie dla charakterystyki cząsteczek lipidów A, które zawierają unikalne lub nowatorskie modyfikacje chemiczne. Opisujemy również znakowanie radioizotopowe, a następnie izolację lipidu A z komórek bakteryjnych do analizy za pomocą TLC. W porównaniu z protokołami opartymi na MS, TLC zapewnia bardziej ekonomiczną i szybszą metodę charakteryzacji, ale nie może być używana do jednoznacznego przypisywania struktur chemicznych lipidów A bez użycia wzorców znanej struktury chemicznej. W ciągu ostatnich dwóch dekad izolacja i charakterystyka lipidu A doprowadziła do wielu ekscytujących odkryć, które poprawiły naszą wiedzę na temat fizjologii bakterii Gram-ujemnych, mechanizmów oporności na antybiotyki, wrodzonej odpowiedzi immunologicznej człowieka i dostarczyły wielu nowych celów w rozwoju związków przeciwbakteryjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipopolisacharyd (LPS) jest główną cząsteczką na powierzchni zewnętrznej prawie wszystkich organizmów Gram-ujemnych i składa się z trzech domen molekularnych: dystalnego polisacharydu antygenu O, oligosacharydu rdzeniowego i lipidu A związanego z błoną, domeny A osadzonej na zewnętrznej warstwie dwuwarstwy błony zewnętrznej1,2. Domena lipidu A składa się z reszt 3-deoksy-D-manno-oct-2-ulosonu (Kdo) i cząsteczki lipidu A, gdzie lipid A można zdefiniować jako rozpuszczalną w chloroformie część LPS po hydrolizie łagodnegokwasu 1,2. Standardową cząsteczkę lipidu A można chemicznie zdefiniować jako szkielet diglucozynaminy, który jest heksa-acylowany i bis-fosforylowany; zgodne z głównymi gatunkami lipidów A obserwowanymi w organizmie modelowym Escherichia coli (E. coli)1,2. Dziewięć konstytutywnie eksprymowanych genów, zachowanych w bakteriach Gram-ujemnych, jest odpowiedzialnych za produkcję domeny lipidowej A (ryc. 1)1,2. Większość bakterii ma dodatkowy zestaw genów, które różnią się stopniem zachowania filogenetycznego, które uczestniczą w dalszej modyfikacji chemicznej lipidu A3. Najczęściej obserwowanymi działaniami są defosforylacja, usuwanie łańcuchów acylowych i dodawanie ugrupowań chemicznych, takich jak aminocukiery (np. aminoarabinoza) i/lub fosfoetanoloamina (ryc. 1). Wiele enzymów odpowiedzialnych za modyfikację lipidów A jest bezpośrednio aktywowanych przez sygnały środowiskowe, takie jak kationy dwuwartościowe, lub ich ekspresja jest regulowana przez dwuskładnikowe systemy regulujące odpowiedź3.

Rozpoznawanie gatunku lipidu A przez wrodzony układ odpornościowy gospodarza odbywa się za pośrednictwem receptora Toll-like 4 / szpikowego czynnika różnicowania 2 (TLR4/MD2) koreceptora4. Siły hydrofobowe między MD2 a łańcuchami acylowymi lipidu A, a także między TLR4 a grupami fosforanowymi 1 i 4' lipidu A sprzyjają silnemu powiązaniu lipidu A z TLR4 / MD24,5. Modyfikacje, które zmieniają stan acylacji lub ujemny ładunek lipidu A, wpływają na rozpoznawanie lipidów A na podstawie TLR4 / MD2 i dalszą stymulację wrodzonych aktywatorów odpowiedzi immunologicznej NF-κB i mediatorów stanu zapalnego, takich jak TNFα i IL1-β6,7. Modyfikacje, które maskują ujemny ładunek lipidu A, zapobiegają również wiązaniu się bakteriobójczych kationowych peptydów przeciwdrobnoustrojowych z powierzchniami komórek Gram-ujemnych3,8. Przypuszcza się, że wiele modyfikacji lipidów A zwiększa sprawność bakterii w określonych warunkach środowiskowych, takich jak wnętrze ludzkiego gospodarza lub w niszy ekologicznej. Z tego powodu wiele enzymów modyfikujących jest atrakcyjnymi celami w racjonalnym rozwoju związków przeciwdrobnoustrojowych. Różnorodność chemiczna struktur lipidowych A w odniesieniu do organizmu i/lub środowiska oraz biologiczne implikacje tych różnorodnych struktur sprawiają, że charakterystyka strukturalna lipidu A jest ważnym przedsięwzięciem w badaniach nad bakteriami Gram-ujemnymi.

Izolacja cząsteczek lipidu A z całych bakterii polega na ekstrakcji LPS z powierzchni komórki bakteryjnej, hydrolitycznym etapie uwalniania lipidu A, po którym następuje końcowa procedura oczyszczania9-11. Najczęściej cytowaną procedurą ekstrakcji LPS jest procedura ekstrakcji gorącą wodą fenolową, po raz pierwszy wprowadzona przez Westphala i Janna10. Po ekstrakcji cały LPS poddaje się łagodnej hydrolizie kwasowej, która chemicznie oddziela Kdo od 6'-hydroksylu dystalnego cukru glukozaminowego lipidu A (ryc. 1). Istnieje wiele pułapek związanych z procedurą z gorącą wodą fenolową, w tym użycie odczynnika wysokiego ryzyka, konieczność degradacji współekstrahowanych kwasów nukleinowych i białek, a do wypełnienia protokołu10 potrzeba kilku dni.

Nasze laboratorium dalej rozwija metodę ekstrakcji i izolacji lipidu A, którą po raz pierwszy opracowali Caroff i Raetz12,13. W porównaniu z procedurami z użyciem gorącej wody fenolowej, przedstawiona tutaj metoda jest szybsza i wydajniejsza oraz obejmuje szeroki zakres objętości hodowli od 5 ml do wielu litrów. Co więcej, w przeciwieństwie do ekstrakcji gorącą wodą fenolową, nasza metoda nie selekcjonuje szorstkich lub gładkich typów LPS, zapewniając optymalny odzysk lipidów A. W naszym protokole liza chemiczna całych komórek bakteryjnych jest przeprowadzana przy użyciu mieszaniny chloroformu, metanolu i wody, przy czym LPS można granulować przez odwirowanie. Połączenie hydrolizy łagodnego kwasu i ekstrakcji rozpuszczalnikiem (Bligh-Dyer) stosuje się do uwolnienia lipidu A z kowalencyjnie przyłączonego polisacharydu. Metoda Bligha i Dyera została po raz pierwszy zastosowana do ekstrakcji form lipidów z różnych tkanek zwierzęcych iroślinnych14, zmodyfikowanych tutaj w celu oddzielenia hydrolizowanego polisacharydu od lipidu A. W tym ostatnim etapie separacji lipidy rozpuszczalne w chloroformie selektywnie rozdzielają się na dolną fazę organiczną. W celu dalszego oczyszczenia lipidu A można zastosować chromatografię kolumnową z odwróconymi fazami lub chromatografią anionową12.

Po wyizolowaniu gatunku lipidu A z całych komórek, można użyć wielu metod analitycznych do scharakteryzowania struktury chemicznej izolowanego materiału, takich jak NMR, TLC i analiza oparta na MS. NMR pozwala na nieniszczące wyjaśnienie strukturalne i dostarcza szczegółów strukturalnych związanych z wiązaniami glikozydowymi, jednoznacznym przypisaniem pozycji łańcucha acylowego i przypisaniem miejsc przyłączenia dla modyfikacji lipidów A, takich jak aminoarabinoza lub fosfoetanoloamina15-17. Analiza NMR lipidu A nie jest omówiona w naszym protokole, ale została odpowiednio opisana w innym miejscu15,16. Do szybkiej analizy często stosuje się metody oparte na TLC, ale nie dostarczają bezpośrednich informacji na temat dokładnej struktury chemicznej. Protokoły oparte na stwardnieniu rozsianym są najczęściej stosowaną metodą charakteryzowania struktur lipidowych A18,19. Jonizacja desorpcyjna laserowa związana z matrycą (MALDI)-MS jest często stosowana do wstępnego badania nienaruszonych gatunków lipidów A. Pojedynczo naładowane jony są generowane z analitu przygotowanego zgodnie z naszymi procedurami ekstrakcji. Ponieważ wymagana jest bardziej dokładna analiza statyczno-wytrzymałościowa, metody oparte na MS/MS okazują się bardziej pouczające niż MALDI-MS. W połączeniu z jonizacją elektrorozpylania (ESI) pojedynczo lub wielokrotnie naładowane jony prekursorowe lipidu A są dalej fragmentowane przez dysocjację wywołaną zderzeniem (CID) lub fotodysocjację ultrafioletową (UVPD), w celu wytworzenia strukturalnie informacyjnych jonów produktowych18,20,21. Neutralne produkty utraty jonów prekursorowych lipidów A są również często generowane podczas ESI-MS, zapewniając dodatkową warstwę informacji strukturalnej.

Tandemowa spektrometria mas (MS/MS) okazała się niezastąpioną i wszechstronną metodą wyjaśniania struktur lipidów A. Podczas MS/MS jony są aktywowane w celu uzyskania diagnostycznego wzorca fragmentacji, który można wykorzystać do wyjaśnienia struktury jonu prekursorowego. Najszerzej dostępną metodą MS/MS jest CID. Metoda ta wytwarza jony fragmentacyjne poprzez zderzenia wybranego jonu prekursorowego z obojętnym gazem docelowym, co powoduje depozycję energii, która prowadzi do dysocjacji. CID okazał się kluczowym narzędziem w przypisywaniu struktury lipidów A dla szerokiego zakresu gatunków bakterii22-33.

Chociaż CID jest najbardziej uniwersalnie stosowaną metodą MS/MS, generuje ograniczoną liczbę jonów produktowych. 193 nm UVPD jest alternatywną i komplementarną metodą MS/MS. Metoda ta wykorzystuje laser do naświetlania jonów, a absorpcja fotonów powoduje energetyzację jonów i późniejszą dysocjację. Ta technika MS/MS o wyższej energii wytwarza bardziej zróżnicowany wachlarz jonów produktowych niż CID, a tym samym zapewnia bardziej informacyjne wzorce fragmentacji. W szczególności UVPD dostarcza informacji o subtelnych zmianach w gatunkach lipidów A w oparciu o rozszczepienia wiązań glikozydowych, aminowych, acylowych i połączonych C-C18,21,34.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie roztwory powinny być przygotowane z ultraczystej wody oraz metanolu i chloroformu klasy HPLC. Przygotowane roztwory zawierające rozpuszczalniki organiczne, takie jak metanol, chloroform lub pirydyna oraz stężone kwasy lub zasady, należy przygotować i stosować pod wyciągiem chemicznym. Wszystkie roztwory mogą być przechowywane w RT. Rozpuszczalniki powinny być mierzone w szklanym cylindrze z podziałką i przechowywane w szklanych butelkach z rozpuszczalnikiem z nakrętkami wyłożonymi PTFE. W przypadku długotrwałego przechowywania rozpuszczalniki zawierające chloroform powinny być przechowywane w barwionych butelkach ze szkła bursztynowego, aby uniknąć wytwarzania fosgenu, wysoce reaktywnego chlorku kwasowego. Probówki wirówkowe z PTFE i obrotowe kolby parownika należy przed użyciem przepłukać metanolem i chloroformem. Podczas usuwania rozpuszczalników i/lub odpadów radioaktywnych należy przestrzegać niezbędnych federalnych, stanowych i/lub instytucjonalnych przepisów dotyczących usuwania odpadów.

1. Ekstrakcja lipidów A na dużą skalę (50 ml do 1,5 l)

  1. Przygotować jednofazową mieszaninę Bligha-Dyera: sól fizjologiczna buforowana fosforanem chloroform-metanol-1X (PBS), pH 7,4; 1:2:0,8 v/v). Połączyć 200 ml chloroformu, 400 ml metanolu i 160 ml PBS w 1 litrowej butelce z rozpuszczalnikiem. Zakręć butelkę i wymieszaj przez odwrócenie (>30x). Okresowo poluzuj nakrętkę podczas mieszania, aby odpowietrzyć i przechowywać szczelnie.
  2. Przygotować wstępnie zbilansowaną dwufazową mieszaninę Bligh-Dyera - chloroform:metanol:woda (2:2:1,8 v/v). Połączyć 400 ml chloroformu, 400 ml metanolu i 180 ml wody w 1 litrowej butelce z rozpuszczalnikiem. Zakręć butelkę i wymieszaj przez odwrócenie, pamiętając o okresowym poluzowywaniu nakrętki podczas mieszania, aby odpowietrzyć. Odczekać, aby zrównoważyć O/N i przechowywać szczelnie.
  3. Przygotować łagodny kwaśny bufor do hydrolizy (50 mM octan sodu, pH 4,5; 1% dodecylosiarczan sodu (SDS)). Na 500 ml łagodnego buforu do hydrolizy kwasowej odważyć 2,05 g octanu sodu i przenieść do zlewki o pojemności 500 ml. Dodaj wodę do objętości ~350 ml i wymieszaj, a następnie dodaj 50 ml 10% SDS. Wymieszaj i dostosuj pH do 4,5, przenieś do cylindra z podziałką i dodaj wodę do 500 ml.
  4. Przygotowanie chloroformu:metanolu (4:1, v/v): Odmierzyć 100 ml chloroformu i przenieść do butelki z rozpuszczalnikiem. Odmierzyć 25 ml metanolu i wymieszać z chloroformem. Przechowywać w butelce ze szkła oranżowego.
  5. Zaszczepić 5 ml pożywki (bulionu Luria lub innej) z pojedynczej kolonii bakteryjnej. Uprawiać O/N w temperaturze 37 °C lub w temperaturze wymaganej do wzrostu. Schemat procedury ekstrakcji przedstawiono na rysunku 2.
  6. Następnego dnia zmierzyć OD600 i użyć 5 ml kultury O/N do zaszczepienia 200 ml kultury do wyjściowego OD600 0,05. Hoduj komórki, aż zostanie osiągnięty OD600 0,8-1,0.
  7. Zbieraj komórki przez wirowanie przy 10 000 x g przez 10 minut. W przypadku odmian, które słabo się granulują, mogą być wymagane dłuższe wirowanie. Odlewać supernatant pożywki.
  8. Przemyć osad komórkowy 50 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Powtórz wirowanie do komórek osadu. Odlewać supernatant i przechowywać osad komórkowy w temperaturze -20 °C lub przejść do kroku 1.9.
  9. Ponownie zawiesić komórki w 40 ml 1x PBS i podzielić między dwie probówki wirówkowe z PTFE o pojemności 250 ml (otrzymując 20 ml zawiesiny komórek/probówki). Dodać 25 ml chloroformu i 50 ml metanolu do każdej probówki, dla jednofazowego barwnika Bligh-Dyera (chloroform: metanol:woda; 1:2:0,8 v/v) (Rysunek 2). Wymieszać przez odwrócenie i inkubować w temperaturze pokojowej przez >20 minut, aby zapewnić całkowitą lizę komórek.
  10. Odwiruj mieszaninę przy 2000 x g przez 20 minut. LPS będzie granulować się wraz z białkami i kwasami nukleinowymi (ryc. 2); jednak fosfolipidy, lipidy izoprenylowe i małe, hydrofobowe peptydy pozostaną w supernatancie. Odrzucić supernatant.
  11. Umyj granulat LPS ~100 ml jednofazową mieszanką Bligh-Dyer. Odwirować przy 2 000 x g przez 20 minut. Odrzucić supernatant. Podczas izolowania lipidu A od E. coli lub Salmonelli wymagane jest tylko jedno płukanie; jednak mogą być potrzebne dodatkowe etapy płukania w celu zmniejszenia zanieczyszczenia fosfolipidami podczas izolowania lipidu A od niektórych organizmów.
  12. Dodać 27 ml łagodnego kwaśnego buforu hydrolizy (50 mM octanu sodu, pH 4,5; 1% SDS; patrz krok 1.3) do osadu LPS i mieszać pipetując w górę i w dół, aż pozostaną tylko małe cząstki. Sonikacja w celu jednorodnego ponownego zawieszenia osadu LPS w roztworze za pomocą sonografu z końcówką sondy w stałym cyklu pracy przez 20 sekund przy 50% wydajności. Powtórzyć sonikację próbki 2x (20 sekund/serię, ~5 sekund między seriami).
  13. Gotuj próbki w łaźni wodnej przez 30 minut. Uwaga: upewnij się, że nakrętki są szczelne, ale nie całkowicie zamknięte. Niektóre organizmy, takie jak Vibrio cholerae (V. cholerae) wymagają dłuższego czasu inkubacji (1 godzina), aby zwiększyć ogólną wydajność lipidu A. Wyjmij butelki z łaźni wodnej i pozwól próbce ostygnąć do temperatury RT przed kontynuowaniem.
  14. Aby wyekstrahować lipidy po hydrolizie, należy przekształcić roztwór SDS w dwufazową mieszaninę Bligh-Dyera (ryc. 2), dodając 30 ml chloroformu i 30 ml metanolu, aby uzyskać mieszaninę chloroformu:metanolu:wody (2:2:1,8, v/v). Wymieszać przez odwrócenie i odwirować próbkę przez 10 minut przy 2 000 x g. Ekstrahować dolną fazę do czystej probówki wirówkowej z PTFE za pomocą szklanej pipety.
  15. Przeprowadzić drugą ekstrakcję, dodając 30 ml dolnej fazy ze wstępnie zbalansowanej dwufazowej mieszaniny Bligh-Dyera (etap 1.2) do górnej fazy z etapu 1.14. Wymieszać, a następnie odwirować przy 2 000 x g przez 10 minut. Wyodrębnij dolną fazę i połącz dolną fazę z dolną fazą wyodrębnioną w kroku 1.14.
  16. Przemyć połączone dolne fazy (łącznie 60 ml), dodając 114 ml wstępnie zbalansowanej dwufazowej górnej fazy Bligh-Dyera (krok 1.2) w celu utworzenia dwufazowej mieszaniny Bligh-Dyera (chloroform: metanol, woda; 2: 2: 1,8, v/v). Odwirować przy 2.000 x g przez 10 min.
  17. Usunąć dolną fazę do czystej szklanej kolby obrotowej parownika i wysuszyć próbkę za pomocą odparowania rotacyjnego (rysunek 2).
  18. Dodać 5 ml chloroformu:metanolu (4:1, v/v) do kolby obrotowej i dokonać kąpieli w sonikacji (>30 s), aby wspomóc zawiesinę lipidów z boków kolby. Użyj szklanej pipety do przenoszenia, aby przenieść lipid do czystej szklanej rurki (13 x 100 mm lub większej) zamkniętej fenolowymi nakrętkami wyłożonymi PTFE. Wysuszyć próbkę pod strumieniem azotu za pomocą osuszacza azotu.
  19. Zawiesić wysuszony lipid w 1 ml chloroformu:metanolu (4:1, v/v). Przenieść do małej szklanej fiolki na próbkę (12 x 32 mm) ze zwężającą się podstawą w celu bardziej ilościowego ponownego zawieszenia przy użyciu małych objętości (patrz Tabela wyposażenia/odczynników). Suszyć za pomocą suszarki do azotu.
  20. Wysuszoną próbkę można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu późniejszej analizy TLC (protokół 2) lub MS (protokół 3, 4 lub 5). (Uwaga: Ilość materiału wyizolowanego i użytego w kolejnych protokołach jest sugerowana na podstawie tego, co jest wystarczające dla większości organizmów. Ta sama próbka lipidów może być użyta w Protokołach 2-5, biorąc pod uwagę % usuniętego materiału. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz Dyskusja.).

2. Wizualizacja gatunku lipidu A za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

  1. Przygotować system rozpuszczalnika TLC z fazą ruchomą (chloroform: pirydyna: 88% kwas mrówkowy: woda; 50:50:16:5 v/v). Połącz 200 ml chloroformu, 200 ml pirydyny, 64 ml 88% kwasu mrówkowego i 20 ml wody w butelce z rozpuszczalnikiem o pojemności 1 l. Zakręć butelkę, kilkakrotnie wymieszaj przez odwrócenie i odpowietrz.
  2. Użyj zbiornika TLC, który pomieści talerze o wymiarach 20 x 20 cm. Wyłóż zbiornik TLC bibułą chromatograficzną o długości ~40 cm.
  3. Do zbiornika TLC dodać 200 ml mieszaniny chloroformu: pirydyny: 88% kwasu mrówkowego: wody (50:50:16:5, v/v). Pozwól zbiornikowi na wstępną równowagę przez >3 godziny, często preferowane i wygodniejsze jest O/N.
  4. Wyjąć wysuszone próbki lipidów z zamrażarki (krok 1.20) i ogrzać do temperatury pokojowej.
  5. Za pomocą brzytwy usuń krzemionkę z górnej krawędzi płytki z żelem krzemionkowym 60 TLC. Za pomocą ołówka narysuj linię równoległą do dołu talerza, 2 cm od dołu. Ta linia jest początkiem wykrywania próbek. Zaznacz przyrosty wzdłuż tej linii odniesienia, aby dostrzec próbki oddalone od siebie o 1 cm.
  6. Rozpuść wysuszony lipid z kroku 2.4 w 200 μl chloroformu: metanolu (4:1, v/v), wiru i sonikatu (3x, ~15 sekund każdy), daje ~100-500 ng/μl lipidu A w przypadku ekstrakcji z E. coli.
  7. Za pomocą szklanej pipety mikrokapilarnej naniec jedną dziesiątą objętości (20 μl) na płytkę TLC, jak oznaczono w kroku 2.5. Pozostawić próbki do wyschnięcia na powietrzu na płytce TLC przez ~15 minut. (Uwaga: Próbki w małych szklanych fiolkach można suszyć za pomocą suszarki azotowej i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania w protokołach 3-5. Zwróć uwagę na % usuniętego materiału).
  8. Umieścić płytkę TLC zawierającą nakrapiane próbki w zbiorniku ze wstępną równowagą. Gdy czoło rozpuszczalnika dotrze do górnej części płytki TLC (~2,5-3 godziny), wyjmij płytkę i wysusz na powietrzu (>60 min). Można użyć pistoletu na zimne powietrze, aby zapewnić całkowite wysuszenie.
  9. Podczas suszenia płyty włącz gorącą płytę w temperaturze 250 °C w celu zwęglenia.
  10. W wentylowanym dygestorii chemicznej przygotować 10% mieszaninę kwasu siarkowego i etanolu do zwęglenia lipidów rozpuszczonych na płytce TLC krzemionki (stężony kwas siarkowy: 100% etanol; 1:9 v / v). Odmierz 10 ml kwasu siarkowego i powoli dodawaj do 90 ml 100% etanolu. Ostrożnie wymieszać i przenieść do rozpylacza odczynnika do chromatografii szklanej.
  11. W dygestorium użyć szklanego rozpylacza odczynnika chromatograficznego, aby spryskać wysuszoną płytkę TLC 10% mieszaniną kwasu siarkowego i etanolu. Rozpyl mieszaninę równomiernie na płytce.
  12. Umieścić płytkę TLC na płycie grzejnej o temperaturze 250 °C, aż zwęglone próbki lipidów pojawią się jako czarne/brązowe plamy (<1 min). Nie należy prześwietlać płytki, ponieważ spowoduje to brązowienie całej płytki i utrudni wizualizację gatunku lipidu A.

3. Charakterystyka strukturalna lipidu A za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF

  1. Z kroku 1.20 (lub kroku 2.7) wyjmij próbkę lipidu A z zamrażarki i pozwól jej ogrzać się do temperatury pokojowej. Ponownie zawiesić wysuszoną próbkę lipidów A w ~20 μl chloroformu:metanolu (4:1, v/v) i odwirować, aby uzyskać ~1-5 μg/μl roztwór lipidów A, jeśli zostanie wyekstrahowany z E. coli. (Uwaga: 10% mniej skoncentrowany, jeśli materiał jest używany z kroku 2.7).
  2. Przygotuj składniki macierzy ATT. Nasycona 6-aza-2-tiotyminą w 50% acetonitrylu: dodać 500 μl wody i 500 μl acetonitrylu do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej, a następnie dodać >10 mg 6-aza-2-tiotyminy, tak aby 50% acetonitrylu było super nasycone. Nasycony trójzasadowy roztwór cytrynianu amonu: Dodać >1 mg do 500 μl wody, osad powinien być łatwo widoczny. Roztwory wirowe i wirówki przed użyciem; Stosuje się tylko nasycony supernatant.
  3. Przygotować mieszaninę matrycową ATT: nasycona 6-aza-2-tiotymina w 50% acetonitrylu, nasycony trójzasadowy cytrynian amonu (20:1, v/v). Wymieszać składniki matrycy ze sobą, dodając 20 μl roztworu ATT do 1 μl nasyconego trójzasadowego roztworu cytrynianu amonu w probówce mikrowirówkowej o pojemności 500 μl, odwirować do wymieszania i odwirować przed nałożeniem na płytkę MALDI.
  4. Przygotować płytkę MALDI, dodając mieszaninę kalibru 0,5 μl do płytki MALDI w miejscu w pobliżu miejsca, w którym próbki zostaną zdeponowane, aby zapewnić najdokładniejsze określenie stosunku masy do ładunku.
  5. Umieść 0,5 μl matrycy ATT na płytce MALDI w każdym miejscu, w którym zostanie zdeponowana próbka lipidu A.
  6. Umieść 0,5 μl próbki (2,5% całej próbki) w miejscu matrycy ATT, aby wymieszać na płytce i uzyskać widma, skanując próbkę w celu uzyskania optymalnych sygnałów jonowych (rysunek 3). Uwaga: Ilości najbardziej optymalnego sygnału MS mogą się różnić w zależności od organizmu i muszą być określone empirycznie. Aby dodać więcej materiału, można wielokrotnie namierzyć 0,5 μl, pozwalając plamistej mieszaninie wyschnąć między dodaniem większej ilości próbki. Próbka może być również zagęszczona (sucha i ponownie zawieszona w mniejszej objętości) lub rozcieńczona w razie potrzeby. Można również użyć większej ilości materiału wyjściowego (objętość wyjściowej hodowli komórkowej) (patrz dyskusja).

4. Spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylania i dysocjacja lipidu A wywołana zderzeniem

  1. Przygotować mieszaninę rozpuszczalnika chloroform-metanol (1:1, v/v) przez zmieszanie 200 μl zapasu metanolu klasy HPLC z 200 ml chloroformu klasy HPLC w szklanej butelce z rozpuszczalnikiem.
  2. Przenieść 200 μl mieszaniny rozpuszczalnika chloroform:metanol do fiolki z lipidem A (np. z etapu 1.20, 2.7 lub wysuszonej po protokole 3) i poddać sonikacji roztworu lipidów przez 5 minut lub do momentu, gdy cały materiał zostanie rozpuszczony.
  3. Ustaw spektrometr masowy do jonizacji elektrorozpylania w trybie ujemnym.
  4. Za pomocą strzykawki o pojemności 250 μl i pompy strzykawkowej bezpośrednio wlać rozcieńczoną próbkę lipidu A z szybkością przepływu 2,0-3,5 μl/min.
  5. Zoptymalizuj i wzmocnij sygnał jonów lipidowych A, dostrajając optykę jonową. Można teraz zebrać pełne spektrum masowe gatunku lipidu A (ryc. 4).
  6. Wyizoluj i aktywuj docelowy lipid A, wybierając CID jako metodę MS/MS.
  7. Zwiększ napięcie CID (lub znormalizowaną energię zderzenia, NCE), aż prekursor lipidowy A osiągnie około 10% względnej obfitości w porównaniu z najwyższym jonem produktowym.
  8. Zbieraj i uśredniaj widma, aż zostanie osiągnięty wystarczający stosunek sygnału do szumu dla jonów produktowych. Liczba wymaganych skanów zależy od intensywności sygnału oryginalnego prekursora i może wynosić od 3 do 300 skanów (rysunek 5A).

5. MS/MS na lipidie A przez fotodysocjację w ultrafiolecie

  1. Przygotować próbkę i spektrometr masowy jak w krokach 4.1-4.5.
  2. Włącz laser połączony ze spektrometrem masowym. Spektrometr masowy został wyposażony w laser excimerowy o długości fali 193 nm i zmodyfikowany tak, aby umożliwić aktywację UV w komórce HCD instrumentu. Fotodysocjacja została zrealizowana w sposób podobny do opisanego wcześniej35. Używamy zmodyfikowanego kolektora próżniowego z oknem optycznym CaF2 do przesyłania fotonów do ogniwa dysocjacji pułapki C o wyższej energii (HCD). Laser jest wyzwalany podczas MS/MS przez sygnał logiczny tranzystor-tranzystor (TTL) ze spektrometru mas do generatora impulsów/opóźnienia.
  3. Skonfiguruj oprogramowanie instrumentu tak, aby laser uruchamiał laser excimerowy, gdy jony dostaną się do komórki HCD. Wymaga to niewielkiej modyfikacji oprogramowania.
  4. Włącz generator impulsów tak, aby laser był impulsowany co 2 ms (500 Hz).
  5. Wyizoluj jon prekursorowy lipidu A, wybierając HCD jako metodę MS/MS i dostosuj energię zderzenia do 1% NCE. Pozwala to na izolację jonów prekursorowych do dysocjacji ultrafioletowej w komórce HCD. Chociaż używana jest komórka HCD, oprogramowanie jest modyfikowane tak, aby wykonywać UVPD w tym przedziale czasu.
  6. Aktywuj izolowany jon lipidowy A, zwiększając energię lasera i dostosowując liczbę impulsów laserowych. Typowy eksperyment UVPD zostanie przeprowadzony przy użyciu dziesięciu impulsów o pojemności 6 ml.
  7. Podobnie jak w kroku 4.8, uzyskaj i uśrednij widma, aż zostanie osiągnięta wystarczająca proporcja sygnału do szumu dla jonów produktu UVPD. Liczba wymaganych skanów zależy od intensywności sygnału oryginalnego prekursora i może wynosić od 3 do 300 skanów (rysunek 5B).

6. 32Znakowanie P lipidu A i późniejsza izolacja

  1. Zaszczepić 5 ml pożywki (bulionu Luria lub innej pożywki) z pojedynczej kolonii. Uprawiaj O/N w temperaturze 37 °C lub w wymaganej temperaturze.
  2. Następnego dnia zmierz OD600 i użyj kultury O/N do zaszczepienia 7 ml kultury do początkowego OD600 ~0,05, wyhodowanej w standardowej jednorazowej szklanej probówce hodowlanej o wymiarach 20 x 150 mm. Dodaj 2,5 μCi/ml nieorganicznego 32P. Hoduj komórki, aż do osiągnięcia OD600 0,8-1,0. Należy postępować zgodnie z federalnymi, stanowymi i/lub instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpiecznego i prawidłowego obchodzenia się z materiałami radioaktywnymi.
  3. Pobrać komórki do szklanych probówek wirówkowych o wymiarach 16 x 125 mm z nasadką wyłożoną PTFE za pomocą wirówki klinicznej o stałym kącie nachylenia 1 500 x g przez 10 min. Usunąć supernatant do odpowiedniego pojemnika na odpady radioaktywne. Wszystkie odpady radioaktywne (np. ciecze, szkło, zagrożenie biologiczne) powstające w kolejnych etapach powinny być utylizowane zgodnie z wytycznymi federalnymi, stanowymi i/lub instytucjonalnymi.
  4. Przepłukać osad komórkowy 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wirować przez 10 minut przy 1 500 x g. Odrzucić supernatant.
  5. Zawiesić komórki w 5 ml jednofazowej mieszaniny Bligh-Dyera (ryc. 2) składającej się z chloroformu:metanolu:wody (1:2:0,8, v/v). Wirować do wymieszania i inkubować w temperaturze pokojowej przez >20 minut, aby zapewnić całkowitą lizę komórek.
  6. Wirować w wirówce klinicznej przy 1 500 x g przez 20 min. Delikatnie odlewać sklarowany sklarant, który zawiera fosfolipidy i lipidy izoprenylowe.
  7. Zawiesić osad LPS w 1,8 ml 50 mM octanu sodu o pH 4,5; 1% buforze SDS przez wirowanie. Sonikować próbkę za pomocą sonikatora kąpielowego, aż do równomiernego rozproszenia osadu (~30 sekund).
  8. Inkubować próbkę przez 30 minut we wrzącej łaźni wodnej. Upewnij się, że nakrętki są szczelne, ale nie uszczelnione.
  9. Wyjąć z łaźni wodnej i pozostawić próbkę do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut.
  10. Przekształć roztwór w dwufazową mieszaninę Bligha-Dyera, dodając 2 ml chloroformu i 2 ml metanolu, otrzymując mieszaninę chloroformu:metanolu:wody (2:2:1,8 v/v). Wirować do mieszania i wirować przez 10 minut w wirówce klinicznej przy 1,500 x g do rozdzielenia faz.
  11. Wyekstrahować dolną fazę do czystej szklanej probówki wirówkowej za pomocą szklanej pipety (pierwsza ekstrakcja).
  12. Przeprowadzić drugą ekstrakcję próbki, dodając 2 ml wstępnie zbalansowanej dwufazowej dolnej fazy Bligh-Dyera (przygotowanej jak w kroku 1.2) do pozostałej górnej fazy z etapu 11. Wirować i odwirowywać 10 min. Usuń dolną fazę i połącz z dolną fazą z pierwszej ekstrakcji.
  13. Do połączonej dolnej fazy (~ 4 ml całkowitej objętości) dodać 7,6 ml wstępnie zbalansowanej górnej fazy (krok 1.2), otrzymując dwufazowy roztwór Bligh-Dyera (chloroform: metanol: woda; 2: 2: 1,8, v/v). Wirować i wirować przez 10 minut.
  14. Usuń dolną fazę do czystej szklanej rurki i wysusz za pomocą suszarki do azotu. Wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego wykorzystania.

7. Wizualizacja 32gatunków lipidów A znakowanych P za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

  1. Przygotować 32próbki lipidów A znakowanych P, zbiornik TLC i płytki TLC zgodnie z opisem w krokach 2.1-2.8.
  2. Rozpuścić 32próbki znakowane P w 500 μl chloroformu metanolu w proporcji 4:1 (v/v). Sonikacja wirowa i kąpielowa w celu całkowitego rozpuszczenia materiału lipidowego. Dodać 5 μl próbki do fiolki scyntylacyjnej zawierającej 5 ml koktajlu scyntylacyjnego. Policz w liczniku scyntylacyjnym i oblicz całkowitą liczbę próbek/min.
  3. Podczas wizualizacji znakowanych radioizotopowo gatunków lipidów można użyć płytek TLC o wymiarach 10 x 20 cm lub 20 x 20 cm. W przypadku płytek o wymiarach 10x20 cm próbki należy dostrzec wzdłuż początku układu współrzędnych oznaczonego w kroku 2.5, tak aby najdłuższy wymiar płytki był pionowy (tj. próbki dostrzeżone w punkcie początkowym oznaczonym 2 cm powyżej krawędzi 10 cm).
  4. Za pomocą pipety mikrokapilarnej naniec 10 000-20 000 cpm/próbkę na płytce i pozostaw plamki do wyschnięcia (>15 min). Próbki mogą wymagać zagęszczenia przez suszenie w atmosferze azotu i ponownego zawieszenia w odpowiedniej objętości, aby osiągnąć 10 000-20 000 zliczeń/min/plamkę (2 μl lub 2 μl jednorazowo dla <10 μl ogółem).
  5. Umieścić płytkę TLC zawierającą próbki znakowane radioizotopem w zbiorniku ze wstępną równowagą. Gdy czoło rozpuszczalnika dotrze do górnej części płytki TLC (~ 3 godziny), wyjmij płytkę i wysusz na powietrzu (>60 min). Uwaga: Płytki TLC prowadzone w obecności pirydyny muszą być dokładnie wysuszone w dygestoriach chemicznych, ponieważ śladowe ilości pirydyny mogą uszkodzić sita fosforyzujące. Można użyć pistoletu na zimne powietrze, aby zapewnić całkowite wysuszenie.
  6. Owiń płytkę w folię spożywczą i wystaw na działanie ekranu PhosphorImager w kasecie autoradiograficznej O/N. Następnego ranka zeskanuj ekran, aby uzyskać obraz (Rysunek 6). Wykorzystując oprogramowanie do analizy densytometrii obrazu, metoda ta pozwala na dokładną, względną kwantyfikację gatunków lipidów A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanoniczny lipid A E. coli oraz Salmonella enterica serowaru Typhimurium jest heksaacylanym disacharydem glukozaminy z grupami fosforanowymi w pozycjach 1 i 4'. Podczas wzrostu w bogatych pośrodkach (np. bulionie Lurii) część lipidu A zawiera grupę pirofosforanową w pozycji 1, co prowadzi do powstania gatunku tris-fosforylowanego36 (Rysunek 1). Kdo (kwas 3-deoksy-D-manno-oktulozonowy) jest przyłączony do grupy 6'-hydroksylowej i służy jako mostek łą...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole szczegółowo opisaliśmy izolację gatunków lipidów A z całych komórek bakterii i opisaliśmy metody analityczne oparte na TLC lub MS w celu chemicznej charakterystyki tego wyizolowanego materiału. Tandemowa spektrometria mas jest potężną strategią charakterystyki strukturalnej de novo związków biologicznych i jest nieoceniona w charakterystyce chemicznej całego wachlarza cząsteczek lipidów A obserwowanych w przyrodzie. CID i UVPD to dwie uzupełniające się metody aktywacji, które tworzą różne rodzaje...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Granty AI064184 i AI76322 z National Institutes of Health (NIH) oraz przez Grant 61789-MA-MUR z Biura Badań Wojskowych dla M.S.T. Badania były również wspierane przez Welch Foundation Grant F1155 i R01GM103655 grantu NIH dla J.S. B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ChloroformThermo Fisher ScientificC607Metanol klasy HPLC
Thermo FisherScientific A452
Teflonowe butelki wirówkowe FEPThermo Fisher Scientific05-562-21
Żel krzemionkowy 60 płytek TLCEMD Biosciences5626-6
Klasa nr 3MM Bibuła chromatograficznaWhatman3030700
spektrometr
mas Orbitrap EliteThermo Fisher
ExciStar XS Excimer LasrerCoherent Inc.
Emitery PicoTip Nanospray ESINowe urządzenia≥ 30 μ m w celu zmniejszenia zatykania
Model 505 Generator impulsów/opóźnieńBerkeley Nucleonics Corporation
Gorąca płyta Thermoylne 2200Barnstead/ThermolyneHPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Gwintowane jednorazowe probówki do hodowli borokrzemianówCorning Pyrex99449-16X
Wielokrotnego użytku gwintowane nakrętki z PTFE GPI 45-415Corning9999-152
Osobisty system obrazowania molekularnego (phosphorimager)BioRad170-9400
Kaseta autoradiograficznaThermo Fisher ScientificFBCS810
Phosphorscreen SO230Kodak
Peptide Mass Standards KitSequazymeP2-3143-00
Sonifier S250-ABranson101063196
1,5 ml 12x32 mm Fiolka ze stożkowym gwintem podstawyThermo Fisher ScientificC4000-V1
klasy HPLC Naukowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
  2. Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
  3. Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
  4. Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
  5. Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
  7. Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
  8. Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
  9. Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
  10. Westphal, O. aJ., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
  11. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
  12. Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
  13. Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
  14. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
  15. Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
  16. Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).
  17. Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
  18. Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
  19. Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
  20. Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
  21. Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
  22. Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
  23. Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
  24. Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
  25. El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
  26. Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
  27. Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
  28. Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
  29. Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
  30. Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
  31. Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
  32. Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
  33. Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
  34. Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
  35. Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
  36. Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
  37. Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).
  38. Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
  39. Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
  40. Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
  41. Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja lipidu Aekstrakcja lipopolisacharyduagodna hydroliza kwasowachromatografia cienkowarstwowaspektrometria masMALDI TOF MSESI MS MSdysocjacja indukowana zderzeniamifotodysocjacja ultrafioletowa

Powiązane artykuły